區(qū)海蘊,周亞南,吳晨曉,梁潤利,肖芬,萬樂,萬振鵬,張羿洋,朱芝秀
(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西南昌330045)
鏈球菌感染是導(dǎo)致現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)重大損失原因之一[1]。據(jù)研究,鏈球菌可以隨著血液循環(huán)到達各個器官引發(fā)炎癥[2~6],我國大部分豬場關(guān)節(jié)炎主要由豬鏈球菌等病原菌引起[7~8]。為了預(yù)防或治療豬鏈球菌,部分豬場忽略飼養(yǎng)管理的因素而大量使用抗生素,導(dǎo)致鏈球菌耐藥性日益加強[9~12]。2020年,南昌某豬場仔豬發(fā)生疑似鏈球菌感染病例,無菌采集病死仔豬關(guān)節(jié)積液,對其進行細菌分離鑒定和抑菌試驗,找到治療該病的有效方法,給臨床治療提供用藥參考,減少抗生素的使用。
南昌某豬場死亡仔豬。
乳酸菌T-C-5、T-C-6、T-C-9:保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室。
電子數(shù)顯游標卡尺:上海美耐特旗艦店;牛津杯:上海申源科學(xué)儀器有限公司;TSA兔血瓊脂平板,TSA血清肉湯,革蘭氏染色液,瑞氏染色液:自行配制;測微尺:北京中西華大科技有限公司。
無菌取仔豬關(guān)節(jié)液涂抹于TSA兔血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃溫箱中培養(yǎng)48 h;挑選優(yōu)勢菌落再進行培養(yǎng),最終獲得ZF-1。
將ZF-1分別接種添加血清的生化鑒定管,置于37℃溫箱培養(yǎng)24~48 h,按照生化鑒定試驗說明書滴加相應(yīng)的指示劑,觀察并記錄結(jié)果。
采用細菌16SrRNA通用引物,按照細菌常規(guī)擴增法[13],將ZF-1進行PCR擴增,PCR擴增產(chǎn)物交由湖南擎科生物科技有限公司測序,并進行核苷酸序列同源性比對(在NCBI內(nèi))和進化樹構(gòu)建(利用MEGA7.0系統(tǒng))。
2.4.1 藥敏試驗。在TSA血清肉湯中接種分離菌ZF-1培養(yǎng)24h(37℃、200r/min搖床震蕩),培養(yǎng)液涂布于TSA兔血瓊脂培養(yǎng)基,其上均勻放置藥敏紙片7片,在37℃溫箱中靜置培養(yǎng)24h后測量抑菌圈大小。
2.4.2 乳酸菌體外抑制試驗。在TSA血清肉湯中接種分離菌ZF-1培養(yǎng)24h(37℃、200r/min搖床震蕩),培養(yǎng)液涂抹5%血清瓊脂平板,其上均勻放置3個牛津杯(靜置2min),牛津杯內(nèi)分別滴加乳酸菌T-C-5、T-C-6、T-C-9發(fā)酵液,每個牛津杯0.3mL,移入冰箱過夜,待菌液充分擴散,放入37℃溫箱靜置培養(yǎng)24h后測量抑菌圈大小。
培養(yǎng)48h后,TSA兔血瓊脂平板有菌落生長,單菌落圓形,邊沿整齊,表面光滑,濕潤,呈α溶血(圖1);顯微鏡觀察菌體成對或呈短鏈狀,有莢膜,為G+短桿菌(圖2)。
圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果
結(jié)果見表1,ZF-1不能發(fā)酵甘露醇和乳糖,能分解尿素,能產(chǎn)明膠酶,能還原硝酸鹽,不能利用枸櫞酸鹽。
表1 分離菌生理生化特性
電泳結(jié)果如圖3所示,目的條帶在約1 500bp處出現(xiàn)。使用Megalign進行同源性分析,可見ZF-1與鏈球菌同源性最高(圖4)。使用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)ZF-1與MT585635.1和KR819497.1親緣關(guān)系最近(圖5)。
圖3 分離菌PCR擴增結(jié)果
圖4 分離菌基因序列同源性分析結(jié)果
圖5 分離菌基因序列系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果
3.4.1 藥敏試驗。結(jié)果見表2,ZF-1對部分青霉素類、頭孢類、酰胺醇類等抗生素敏感,對部分大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、林可胺類等抗生素完全耐藥。
表2 藥敏試驗結(jié)果 mm
3.4.2 乳酸菌體外抑菌試驗。結(jié)果見表3,乳酸菌對ZF-1有顯著的抑制作用,其中T-C-5抑菌效果最好。
表3 乳酸菌抑菌試驗結(jié)果 (mm)
根據(jù)分離菌的培養(yǎng)形態(tài)、生化特性,對比《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8版)[11],初步確定分離菌為鏈球菌,用分子生物學(xué)方法進行進一步鑒定,確定ZF-1為鏈球菌。ZF-1形態(tài)與表面特征與史麗華[8]、姚火春[12]、張奧[14]報道的一致,與Moor的β溶血不一致,可能是菌株的差異。ZF-1顯微鏡下觀察結(jié)果與史麗華[8]、陳楠楠[15]報道的一致。
ZF-1藥敏試驗中,對鏈霉素、麥迪霉素、多黏菌素B、甲氧氨芐嘧啶、諾氟沙星、克林霉素完全耐藥性,與卿任科[2]、劉瑞雪[16]的結(jié)果一致,與黃千年[17]有差異,由此可見鏈球菌耐藥性問題十分嚴重,急需尋找替代物。近年來乳酸菌的研究成為了熱點,如劉小蘭[18]等報道:腸乳桿菌可代替抗生素的使用,減少耐藥性的發(fā)生,與乳酸菌T-C-5對鏈球菌的抑制作用不謀而合。
人和動物容易被鏈球菌感染,并能引起多種人畜共患病[7],我國出現(xiàn)過兩次較大規(guī)模豬鏈球菌感染人事件[9],豬鏈球菌感染人的衛(wèi)生事件已經(jīng)引起全世界的關(guān)注,切斷豬鏈球菌這個傳染源顯得尤為重要。
豬鏈球菌主要是由于豬之間的緊密接觸,由鼻子通過呼吸道的途徑傳播,健康帶菌豬更易于通過密切接觸將感染傳播給其他豬[9]。通風(fēng)不良,密度過大,粉塵多等飼養(yǎng)管理條件不當(dāng)和仔豬的運輸應(yīng)激導(dǎo)致的免疫力下降等更加容易發(fā)生鏈球菌的感染。
防治豬鏈球菌最優(yōu)的方法是:一是防患于未然,盡量自繁自養(yǎng),減少外界病原菌的侵入。二是改善豬舍環(huán)境,加強飼養(yǎng)管理,盡量減少鏈球菌感染,預(yù)防比治療更重要。三是若已經(jīng)發(fā)生鏈球菌的感染,可對病原菌進行藥敏試驗選擇兩三種抗生素混合使用加強藥效。四是可研究新的方法替代抗生素的使用減少耐藥性的發(fā)生。