陳 路,胡 爽,張慧敏,王 君,黃 鳳,王志文*

(1.岳陽職業(yè)技術(shù)學院慢性病重點實驗室,中國湖南岳陽414000;2.湖南師范大學附屬岳陽醫(yī)院/岳陽市二人民醫(yī)院,中國湖南岳陽414000;3.武漢科技大學生命科學與健康學院,中國湖北武漢430065)

胃癌(gastric cancer,GC)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤,其預(yù)后較差,嚴重威脅人類健康。2018全球癌癥統(tǒng)計報告顯示,全球胃癌新增病例約103萬例,死亡約728 685例,胃癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率居第5位,死亡率居第3位[1]。我國胃癌患者數(shù)量龐大,每年新發(fā)病例占全球新發(fā)病例的40%以上[2]。目前,單純原發(fā)癌的胃切除仍是胃癌治療的首選方法,但整體效果仍不理想[3～4],故早期發(fā)現(xiàn)和治療以及阻斷或延緩胃癌惡性進展是改善胃癌預(yù)后的必要條件[5]。

微RNA(microRNA,miRNA)是一類小的非編碼RNA,通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)堿基配對來調(diào)控30%以上的哺乳動物基因[6～8]。以往的研究表明,異常的miRNA表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),特別是在胃癌中[4,9～11]。一些在胃癌中表達發(fā)生改變的miRNA已經(jīng)被證實可以控制胃癌細胞的增殖、凋亡和炎癥[12～13]。有報道表明,miR-365在胃癌中可作為抑癌基因參與調(diào)控胃癌的發(fā)生[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn),miR-365在胃癌細胞系(AGS)內(nèi)的表達水平低于正常胃上皮細胞(GES-1),但其對胃癌細胞的具體調(diào)控機制和方式尚未闡明,本文旨在進一步研究miR-365在胃癌細胞中參與調(diào)控胃癌發(fā)生的機制。

叉頭盒蛋白(forkhead box protein)是一類轉(zhuǎn)錄因子,主要存在于無脊椎動物和哺乳動物細胞內(nèi),擁有一個高度保守的大于100個氨基酸的DNA結(jié)合域。該蛋白質(zhì)的編碼基因被分為19小類,分別命名為Fox A～S[15]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子O家族(FoxO)是叉頭盒家族中最大的亞家族之一,迄今已在哺乳動物中鑒定出4個FoxO亞型(FoxO1、FoxO3a、FoxO4、FoxO6),它們都有序列相同的線蟲同源基因[16]。在這些蛋白質(zhì)中,FoxO1被廣泛研究,是具有復(fù)雜活性的超轉(zhuǎn)錄因子。FoxO1調(diào)節(jié)許多靶標,包括凋亡和自噬相關(guān)的基因、抗氧化酶、細胞周期阻滯基因以及代謝和免疫調(diào)節(jié)劑[17～18]。目前普遍認為FoxO1蛋白是一種細胞周期抑制因子。然而,FoxO1蛋白在胃癌發(fā)生過程中的作用尚不明確[19]。

本文在分子和細胞水平探究了miR-365在胃癌中對細胞增殖的影響,可為闡明miR-365調(diào)控FoxO1的確切分子機制,揭示miR-365調(diào)節(jié)FoxO1進而調(diào)控胃癌細胞增殖的機制研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù),同時也可為胃癌的治療及預(yù)后干預(yù)和新的藥物靶點研發(fā)提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

人胃腺癌細胞AGS、MGC80-3和人正常胃上皮細胞GES-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),分別在加有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%青-鏈霉素的 D-MEM/F-12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基(均購自美國Gibco公司)中培養(yǎng)。pmirGLO載體源自美國A-ddgene公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、ECL發(fā)光液、細胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8)(大連美倫生物技術(shù)有限公司);抗cyclinD1、CDK4、CDK6、FoxO1 抗體(CST 公司,美國);anti-GAPDH(Santa Cruz公司,美國);兔/鼠二抗(Thermo公司,美國);熒光素酶報告實驗所需試劑盒(Promega公司,美國);miR-365模擬物(miR-365 mimics)、模擬物對照(negative control,NC)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司);RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit(康為世紀生物科技有限公司);BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(強)、脫脂奶粉(碧云天生物技術(shù)有限公司);限制性核酸內(nèi)切酶SalⅠ和XhoⅠ、T4連接酶(NEB公司);突變試劑盒Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2、PCR 擴增酶 2× Rapid Taq Master Mix、轉(zhuǎn)染試劑 ExFect?2000 Transfection Reagent(南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司);miRNA提取試劑盒miRNeasy Mini Kit(QIAGEN公司,德國)。多功能酶標儀(Thermo公司,美國);化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

以人基因組為模板擴增得到FoxO1 3′-UTR序列,將所得片段連接到pmirGLO載體上得到野生型熒光素酶報告質(zhì)粒WT-pmirGLO-FoxO1。嚴格按照Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2試劑盒說明書,以WT-pmirGLO-FoxO1質(zhì)粒為模板構(gòu)建FoxO1 3′-UTR與miR-365結(jié)合位點突變的熒光素酶報告質(zhì)粒mut-pmirGLO-FoxO1,所需PCR引物(表1)在Primer Premier 5.0軟件上設(shè)計,所得序列由上海擎科生物科技有限公司合成。

表1 FoxO1 3′-UTR報告質(zhì)粒構(gòu)建所需引物Table 1 Primers used for FoxO1 3′-UTR plasmid construction

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

在兩支1.5 mL無菌離心管中各加入25 μL無血清培養(yǎng)基,然后一支添加適量的ExFect 2000轉(zhuǎn)染試劑(1 μg目的質(zhì)粒對應(yīng) 2 μL ExFect 2000),一支添加適量的目的質(zhì)粒,混勻。室溫靜置5 min后將目的質(zhì)粒-培養(yǎng)基混合物滴加到ExFect 2000-培養(yǎng)基混合物中,并用移液器輕輕混勻。室溫靜置10 min后將ExFect 2000/目的質(zhì)粒復(fù)合物滴加至含有AGS和MGC80-3細胞的培養(yǎng)基中,輕輕晃動培養(yǎng)皿使復(fù)合物均勻分布。過夜培養(yǎng)24～48 h后收取細胞,進行后續(xù)實驗。

1.2.3 熒光素酶報告實驗

將AGS以每孔2×105個細胞接種于24孔板(每組3個重復(fù)),待細胞貼壁后轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞。將收集得到的細胞用1×PBS洗滌,然后加入 100 μL 1× passive lysis buffer,冰上裂解30 min后12 000 r/min離心收集上清。取10 μL上清,加入 100 μL luciferase assay buffer混勻后立刻用多功能酶標儀測熒光值并做記錄,該過程應(yīng)避光處理。取相同體積上清液進行蛋白質(zhì)定量,將所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.2.4 細胞活性實驗

AGS和MGC80-3細胞分別轉(zhuǎn)染終濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的miR-365 mimics和模擬物對照(NC),轉(zhuǎn)染24 h后制備細胞懸液并對細胞進行計數(shù)。按照每孔5×103個細胞將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(每組6個重復(fù)),最終要求每孔細胞懸液的體積約100 μL,待細胞貼壁后每孔加入10 μL CCK-8增強型溶液,在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后測定570 nm處的吸光度值(A570nm),所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.2.5 miRNA/mRNA提取及RT-qPCR

細胞和病人組織樣本的miRNA提取嚴格按照miRNeasy Mini Kit試劑盒中的說明書操作,mRNA的提取工作嚴格按照Ultrapure RNA Kit試劑盒進行。對提取的RNA進行定量,并將其按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將得到的cDNA按照Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、上游引物 0.8 μL、下游引物 0.8 μL、cDNA 2 μL、超純水 6.4 μL 配成 20 μL PCR 擴增體系。擴增條件如下:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性2 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s,共40個循環(huán)。其中,miRNA的RT-qPCR結(jié)果以U6為內(nèi)參,mRNA的RT-qPCR結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參。RT-qPCR所需引物序列如表2所示,均由上海擎科生物科技有限公司合成。

表2 RT-qPCR所需引物Table 2 Primers used for RT-qPCR

1.2.6 Western-blot分析

細胞經(jīng)RIPA裂解液冰上裂解30 min后在4℃條件下12 000 r/min離心15 min取上清。采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對目標蛋白質(zhì)進行定量分析。取相同總量的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳;根據(jù)目的蛋白的相對分子質(zhì)量,按照200 mA恒定電流、1 min/kD將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將其用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。CyclinD1、CDK4、CDK6、FoxO1 一抗按照 1∶1 500稀釋使用,4℃孵育過夜;TBST洗滌3次(每次10 min)后按照1∶3 000比例孵育兔/鼠二抗(根據(jù)一抗的種屬來定),常溫孵育1 h;TBST洗滌3次(每次10 min)后在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中分析實驗結(jié)果。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析,每個實驗結(jié)果均進行3次獨立重復(fù)實驗。用t檢驗比較兩組數(shù)據(jù)之間的差異,P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-365可抑制胃癌細胞的活力

為了探討miR-365在胃癌細胞中的內(nèi)源性表達水平,我們分別提取了GES-1、MGC80-3和AGS中的總miRNA,檢測了3種細胞系中miR-365的相對表達水平,結(jié)果如圖1A所示。與正常胃上皮細胞GES-1相比,胃癌細胞MGC80-3和AGS中的miR-365水平明顯下調(diào)。隨后,我們在胃癌細胞MGC80-3和AGS中轉(zhuǎn)染不同濃度的miR-365 mimics或NC,結(jié)果顯示,隨著miR-365 mimics濃度的增加,細胞的活力明顯下降,在40 μmol/L時AGS和MGC80-3的細胞活力與對照組相比分別下降50%和40%(圖1B)。以上結(jié)果表明,在胃癌細胞中miR-365的表達量下調(diào)且miR-365可降低胃癌細胞的活力水平。

圖1 miR-365在胃癌細胞系中的內(nèi)源性表達及對胃癌細胞活力的影響(A)RT-qPCR檢測GES-1、MGC80-3和AGS細胞系中miR-365的內(nèi)源性表達;(B)胃癌細胞AGS和MGC80-3轉(zhuǎn)染不同量miR-365 mimics后經(jīng)CCK-8檢測細胞的活力。*P＜0.05,**P＜0.01,圖2～4類似。Fig.1 The endogenous expression of miR-365 in gastric cancer cell lines and its effect on the viability of gastric cancer cells(A)RT-qPCR detection of miR-365 endogenous expression in GES-1,MGC80-3 and AGS cell lines;(B)Gastric cancer cells AGS and MGC80-3 were transfected with different amounts of miR-365 mimics and the cell viability was tested by CCK-8.*P＜0.05,**P＜0.01,these are same in the following figures.

2.2 miR-365通過抑制細胞周期蛋白抑制胃癌細胞增殖

為了探究miR-365是否通過參與調(diào)控胃癌細胞周期而影響細胞活力,進而影響胃癌細胞的增殖,我們對轉(zhuǎn)染 miR-365 mimics(20 μmol/L)的AGS細胞進行了細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測。RT-qPCR結(jié)果表明,AGS細胞過表達miR-365 mimics后與對照組相比細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)CDK4、CDK6、cyclinD1的 mRNA水平明顯下調(diào)(圖2A);Western-blot結(jié)果表明,CDK4、CDK6、cyclinD1的蛋白質(zhì)水平明顯低于對照組(圖2B)。由此我們得出,miR-365 mimics可以抑制胃癌細胞周期蛋白的表達,抑制胃癌細胞周期的進行,降低胃癌細胞活力,從而抑制胃癌細胞的增殖。

圖2 在AGS細胞中miR-365抑制細胞周期蛋白的表達(A)RT-qPCR方法檢測miR-365對CDK4、CDK6、cyclinD1 mRNA水平的影響;(B)Western-blot檢測CDK4、CDK6、cyclinD1蛋白的表達。Fig.2 Inhibition of cyclin transcription and expression by miR-365 in AGS cells(A)Transfection of miR-365 mimics and control in AGS cells.RT-qPCR method was used to detect the effect of miR-365 on CDK4,CDK6 and cyclinD1 mRNA levels;(B)CDK4,CDK6 and cyclinD1 protein expression changes were detected by Western-blot.

2.3 miR-365通過靶向FoxO1 3′-UTR抑制FoxO1蛋白的表達

為了探討miR-365抑制胃癌細胞增殖的分子機制,我們在TargetScanHuman 7.2網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_72/targetscan.cgi?species=Human&mir_sc=miR-365-3p)分析了miR-365的序列結(jié)構(gòu)(圖3A),發(fā)現(xiàn)miR-365可以靶向結(jié)合到FoxO1的3′-UTR。為了探究miR-365是否確實可以與FoxO1的3′-UTR靶向結(jié)合,我們構(gòu)建了包含F(xiàn)oxO1 3′-UTR序列的野生型及突變型(miR-365與FoxO1 3′-UTR的結(jié)合位點突變)熒光素酶報告質(zhì)粒(圖3B,C),并在AGS細胞中將野生型或突變型熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-365 mimics(20 μmol/L)或 NC 共轉(zhuǎn)染,熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,miR-365能顯著抑制野生型熒光素酶報告基因活性,但對突變型熒光素酶報告基因活性無明顯影響(圖3D)。與該結(jié)果類似,在轉(zhuǎn)染miR-365 mimics(20 μmol/L)或NC的AGS細胞中,Western-blot結(jié)果表明,miR-365可顯著抑制FoxO1蛋白的表達(圖3E)。以上結(jié)果表明miR-365通過靶向FoxO1的3′-UTR抑制FoxO1蛋白的表達。

圖3 miR-365通過靶向FoxO1的3′-UTR抑制FoxO1蛋白的表達(A)生物信息學分析預(yù)測miR-365可靶向結(jié)合FoxO1的3′-UTR;(B)熒光素酶報告質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖;(C)突變型FoxO1 3′-UTR熒光素酶報告質(zhì)粒構(gòu)建及堿基突變示意圖;(D)在AGS細胞中將野生型或突變型熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-365 mimics或NC共轉(zhuǎn)染,采用熒光素酶報告實驗檢測熒光活性;(E)在AGS細胞中轉(zhuǎn)染miR-365 mimics或NC,采用Westernblot檢測FoxO1蛋白表達水平。Fig.3 Inhibition of FoxO1 protein expression by miR-365 targeting FoxO1 3′-UTR(A)Prediction of miR-365 targeting 3′-UTR of FoxO1 by bioinformatics analysis;(B)Schematic diagram of the luciferase reporter plasmid;(C)The construction of mutant FoxO1 3′-UTR luciferase reporter plasmid and schematic diagram of base mutation;(D)Co-transfection of AGS cells by wild-type or mutant luciferase reporter plasmid with miR-365 mimics or NC.The fluorescence activity was detected through luciferase reporter experiment;(E)The cells were transfected with miR-365 mimics or NC,and the expression level of FoxO1 protein was detected by Western-blot in AGS.

2.4 臨床樣本中miR-365在胃癌組織中下調(diào)

為了進一步確認miR-365對胃癌細胞增殖的抑制作用,我們收集了11例臨床胃癌樣本及其對應(yīng)的癌旁組織,并用RT-qPCR檢測了其miR-365的表達。結(jié)果如圖4所示,相較于癌旁組織,miR-365在癌組織中的表達明顯下調(diào),證實miR-365抑制胃癌細胞增殖。

圖4 臨床樣本中miR-365的表達RT-qPCR檢測病人癌組織及癌旁組織中miR-365的表達。Fig.4 Expression of miR-365 in clinical samplesRT-qPCR detection of miR-365 expression in cancer and adjacent tissues.

3 討論

miRNA表達失調(diào)已被證明會促進癌癥的發(fā)展,包括乳腺癌[20]、消化道癌癥[21]、黑色素瘤[22]等。miR-365位于染色體16p13.12,其表達模式和生物學作用與癌癥類型相關(guān)。研究報道,miR-365在皮膚鱗狀細胞癌[23～24]中高表達,而在乳腺癌[25]、結(jié)腸癌[26]、肺癌[27]和黑色素瘤[28]中下調(diào),提示miR-365可能在特定的癌癥類型中發(fā)揮促增殖或促凋亡作用。目前,miR-365在胃癌發(fā)展中的作用還知之甚少。已有的研究顯示,miR-365-3p通過調(diào)節(jié)CDK4和CDK6抑制皮膚鱗狀細胞癌的進展[29],同時,其也可通過靶向NRP(neuropilin)抑制惡性黑色素瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移[28]。另外,miR-365-3p在乳腺癌中通過靶向FOXK1調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移和侵襲[30]。我們的研究發(fā)現(xiàn),miR-365在胃癌細胞中表達下調(diào),并抑制胃癌細胞的活力。

FoxO 家族蛋白(包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4 和FoxO6)已被越來越多的研究認為是重要的蛋白質(zhì)家族,可調(diào)節(jié)凋亡、細胞周期、自噬和DNA損傷修復(fù)等過程[31～32]。FoxO1是在胰島素反應(yīng)性組織(例如肝臟)中表達得最豐富的同工型,可以調(diào)節(jié)涉及凋亡、細胞周期、代謝、應(yīng)激反應(yīng)和分化的基因的表達[31～32]。許多研究關(guān)注其對細胞周期的調(diào)節(jié)作用。例如:PLK1(polo-like kinase 1)與FoxO1相互作用,使其磷酸化,從而消除其對細胞生存的抑制作用,促進G2/M周期進展[33];在增殖細胞中,FoxO1可被CDK1激活,從而影響PLK的表達[34]。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn),大量的研究提出調(diào)控FoxO1可以應(yīng)用于癌癥治療。敲除FoxO1可抑制三苯氧胺對乳腺癌細胞的敏感性[35]。核激活的FoxO1被報道可以控制骨肉瘤細胞中下游周期阻滯基因的表達,p21和p27作為FoxO1的下游靶點,可引起細胞周期停滯在G1/S邊界,從而抑制細胞增殖[36]。先前的研究報道,姜黃素作為FoxO1激活劑,可通過上調(diào)p27和p21以及下調(diào)cyclinD1來降低肺癌的增殖[37]。此外,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了FoxO1-p27(kip)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸,從而誘導(dǎo)細胞周期G0/G1阻滯[38]。我們的研究結(jié)果表明,miR-365可通過靶向結(jié)合FoxO1的3′-UTR抑制FoxO1的表達,進而影響胃癌細胞的增殖活力。

對于癌癥的常規(guī)治療,靶向細胞周期的化學療法已經(jīng)發(fā)展了數(shù)十年。細胞周期失調(diào)將導(dǎo)致細胞不受控制的增殖,同時允許細胞不受限制的復(fù)制和生長[39～40]。因此,靶向細胞周期并使得細胞復(fù)制受抑制可以阻止腫瘤形成[41]。在細胞周期運動中,細胞周期蛋白在觸發(fā)和促進從G1期到S和G2/M期的細胞周期中起關(guān)鍵作用。據(jù)報道,cyclinD1可能參與不同的周期狀態(tài)[42]。通常,cyclinD1或G1/S特異性cyclinD1通過結(jié)合并激活CDK4、CDK6的G1期特征來促進細胞增殖[43]。我們的研究表明,miR-365通過抑制細胞周期蛋白抑制胃癌細胞增殖,推測miR-365可通過靶向結(jié)合FoxO1的3′-UTR抑制FoxO1的表達,進而調(diào)控胃癌細胞的增殖。

4 結(jié)論

本研究表明miR-365在胃癌細胞中表達下調(diào),可視為一種抑癌因子。其通過靶向FoxO1的3′-UTR抑制FoxO1的表達,進而抑制細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)CDK4、CDK6和cyclinD1的表達,抑制胃癌細胞的增殖和活力。這一研究結(jié)果進一步證實FoxO1可以參與胃癌細胞周期的進行,并提示cyclinD1可能是一個潛在的抗腫瘤靶點。