方晉仁,尹小慧,周 濤,李國慶,秦 輝,楊南揚(yáng)

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與遺傳研究所生態(tài)健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)衡陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國湖南衡陽421000)

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smads信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡以及轉(zhuǎn)移黏附等方面均具有重要作用,該信號(hào)通路的異常被認(rèn)為與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1～2]。在許多正常的細(xì)胞類型中,TGF-β作為一種主要的負(fù)生長調(diào)控因子,通過細(xì)胞膜上的TGF-β受體和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD蛋白共同發(fā)揮抑制細(xì)胞生長的作用。當(dāng)細(xì)胞外存在TGF-β配體分子時(shí),該配體分子可以依次激活細(xì)胞膜上的TGF-βⅡ型和Ⅰ型受體,繼而磷酸化激活胞質(zhì)中的受體調(diào)節(jié)型SMAD(R-SMAD分子,SMAD2或SMAD3),后者進(jìn)一步與通用型SMAD分子Co-SMAD(SMAD4)形成異源復(fù)合體入核,最終調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在該過程中,SMAD4作為TGF-β/Smads信號(hào)通路中唯一的通用型SMAD分子,是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的關(guān)鍵核心分子。已有研究表明,多種由TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常所導(dǎo)致的腫瘤中,常常被發(fā)現(xiàn)有SMAD4的基因突變或/和表達(dá)下調(diào)甚至缺失,例如胰腺癌、頭頸部鱗狀癌和結(jié)直腸癌等[3～8]。在這些癌細(xì)胞中,過表達(dá)SMAD4可增加細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖[7,9～10]。但在部分癌癥種類(比如惡性膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、前列腺癌等)中,研究者卻極少能觀察到SMAD4的基因突變或表達(dá)異常[1,11]。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,基因的mRNA選擇性剪接可以產(chǎn)生多種具有不同功能甚至相反功能的蛋白質(zhì)差異剪接體。SMAD4全長蛋白質(zhì)共包含11個(gè)外顯子,本文中研究的6種剪接體在3號(hào)外顯子至7號(hào)外顯子區(qū)段內(nèi)發(fā)生了不同程度的外顯子缺失,分別為 SMAD4△3、SMAD4△4、SMAD4△6、SMAD4△5-6、SMAD4△4-6 和 SMAD4△4-7[12],這6種剪接體與全長外顯子的組成情況如圖1所示。越來越多的研究表明,許多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展同一些轉(zhuǎn)錄因子的異常剪接體存在與否密切相關(guān)[13～15]。因此,在那些未發(fā)現(xiàn)SMAD4基因突變或表達(dá)異常的癌癥類型中,SMAD4剪接體是否在其發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能,值得進(jìn)一步探討。

圖1 SMAD4全長及剪接體示意圖SMAD4包括MH1、linker和MH2結(jié)構(gòu)域。外顯子表示為帶有外顯子編號(hào)的方框;下面的數(shù)字為外顯子-外顯子邊界的氨基酸;NLS:核定位信號(hào);NES:核輸出信號(hào);SAD:SMAD蛋白激活區(qū)。Fig.1 Schematics of SMAD4 full-length and splicing variantsSMAD4 includes MH1,a linker and MH2 domains.Exons are denoted as boxes with the exon numbers indicated.Numbers below are amino acids at the exon-exon boundaries.NLS,nuclear localization signal;NES,nuclear export signal;SAD,SMAD4 activation domain.

本研究旨在構(gòu)建帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標(biāo)簽的人SMAD4全長及各種剪接體基因的表達(dá)載體,觀察其在真核細(xì)胞HEK-293T中的亞細(xì)胞定位,并分析其對(duì)SMAD4下游靶基因啟動(dòng)子上的SMAD結(jié)合元件(SMAD binding element,SBE)轉(zhuǎn)錄活性的影響,為SMAD4剪接體的進(jìn)一步功能研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞系HEK-293T購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC);pEGFP-C1表達(dá)載體、pcDNA3.1-flag空載體、SMAD4全長及各種剪接體過表達(dá)載體(帶flag標(biāo)簽)、4*SBE-luc報(bào)告基因、內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒pREP7-RLuc和大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ);DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR cleanup試劑盒均購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ及其緩沖液、T4 DNA連接酶及其緩沖液購自寶生物工程(大連)有限公司;無內(nèi)毒素中量提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自賽默飛世爾科技公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Double-Lu-ciferase Reporter Assay Kit)購于北京全式金生物科技有限公司;引物的合成及質(zhì)粒的測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)

將HEK-293T細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 μg/mL(終質(zhì)量濃度)青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,用37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài),并根據(jù)情況每隔2 d左右換液或傳代一次。

1.3 pEGFP-C1-SMAD4全長及剪接體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

在NCBI網(wǎng)站上查詢?nèi)薙MAD4的CDS(coding sequence)序列,并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的6種SMAD4剪接體的外顯子構(gòu)成[12],設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增SMAD4全長及剪接體的PCR通用引物。上游引物:5′-CCGGAATTCCATGGACAATATGTCTATTACG-3′(下劃線部分為EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)),下游引物:5′-ACGCGTCGACTCAGTCTAAAGGTTGTGGGT-3′(下劃線部分為SalⅠ的酶切位點(diǎn))。分別以本實(shí)驗(yàn)室保存的pMD19-T-SMAD4全長及剪接體重組質(zhì)粒為模板,利用上述引物對(duì)SMAD4全長及剪接體片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用PCR cleanup試劑盒對(duì)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。將PCR回收產(chǎn)物與pEGFP-C1載體進(jìn)行EcoRⅠ和SalⅠ的雙酶切反應(yīng),并回收酶切產(chǎn)物。所得酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶在16℃條件下連接4 h;之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中,于卡那霉素抗性LB固體平板中生長過夜。采用堿裂解法提取單克隆菌落中的質(zhì)粒并雙酶切鑒定,將酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的亞定位

轉(zhuǎn)染前一天,按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種HEK-293T于24孔板中。第2天,待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)60%～70%時(shí),分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1載體、pEGFP-C1-SMAD4全長及剪接體共8種質(zhì)粒至不同細(xì)胞孔中。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000的用量按轉(zhuǎn)染DNA總量(微克數(shù))的1.5倍體積(微升)的標(biāo)準(zhǔn)使用。轉(zhuǎn)染48 h后去掉培養(yǎng)基,在適量磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗細(xì)胞后,用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min。棄4%多聚甲醛,加入適量PBS清洗細(xì)胞兩次,再加入0.1%Triton X-100室溫處理細(xì)胞10 min。PBS清洗細(xì)胞兩次,加入細(xì)胞核染液4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI),室溫染色5 min。棄染液,PBS清洗細(xì)胞3次,于倒置熒光顯微鏡下觀察SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的亞定位。

1.5 SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性分析

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;數(shù)據(jù)符合方差齊性和正態(tài)分布,多組間比較采用ANOVA方法,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMAD4全長及剪接體基因片段的PCR擴(kuò)增

以本實(shí)驗(yàn)室保存的SMAD4全長及剪接體的pMD19-T載體為模板,對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增,所得PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示,條帶大小分別為1 542 bp(SMAD4△6)、1 449 bp(SMAD4△4)、1 626 bp(SMAD4△3)、1 422 bp(SMAD4△5-6)、1 212 bp(SMAD4△4-6)、1 158 bp(SMAD4△4-7)和1 659 bp(SMAD4),均與預(yù)期大小相一致。

圖2 SMAD4全長及剪接體基因的PCR結(jié)果M:DL2000 DNA標(biāo)記;1:SMAD4△6基因的PCR產(chǎn)物;2:SMAD4△4基因的PCR產(chǎn)物;3:SMAD4△3基因的PCR產(chǎn)物;4:SMAD4△5-6基因的PCR產(chǎn)物;5:SMAD4△4-6基因的PCR產(chǎn)物;6:SMAD4△4-7基因的PCR產(chǎn)物;7:SMAD4基因的PCR產(chǎn)物。Fig.2 PCR results of full-length SMAD4 and the splicing variant genesM:DL2000 DNA marker;1:PCR product of SMAD4△6 gene;2:PCR product of SMAD4△4 gene;3:PCR product of SMAD4△3 gene;4:PCRproduct of SMAD4△5-6 gene;5:PCRproduct of SMAD4△4-6 gene;6:PCR product of SMAD4△4-7 gene;7:PCR product of SMAD4 gene.

2.2 pEGFP-C1-SMAD4全長及剪接體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

從篩選目的重組質(zhì)粒的卡那霉素抗性LB平板上挑取單克隆,經(jīng)堿裂解法抽提所得質(zhì)粒,利用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切,采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,結(jié)果如圖3所示,泳道1～7均可見兩條大小分別與pEGFP-C1空載體和目的基因片段相符的特異性條帶。測序結(jié)果經(jīng)NCBI的Blast比對(duì)正確,表明pEGFP-C1-SMAD4全長及剪接體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 pEGFP-C1-SMAD4全長及剪接體重組質(zhì)粒的EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切結(jié)果M1:100 bp DNA標(biāo)記;M2:1 kb DNA標(biāo)記;1:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-SMAD4△3雙酶切結(jié)果;2:重組質(zhì)粒pEGFPC1-SMAD4△4雙酶切結(jié)果;3:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-SMAD4△6雙酶切結(jié)果;4:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-SMAD4△5-6雙酶切結(jié)果;5:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-SMAD4△4-6雙酶切結(jié)果;6:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-SMAD4△4-7雙酶切結(jié)果;7:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-SMAD4雙酶切結(jié)果。Fig.3 EcoRⅠ/SalⅠ double digestion of recombinant plasmid pEGFP-C1-SMAD4(full-length)and the splicing variant plasmidsM1:100 bp DNA marker;M2:1 kb DNA marker;1:pEGFP-C1-SMAD4△3 digested by EcoRⅠ/SalⅠ;2:pEGFPC1-SMAD4△4 digested by EcoRⅠ/SalⅠ;3:pEGFP-C1-SMAD4△6 digested by EcoRⅠ/SalⅠ;4:pEGFP-C1-SMAD4△5-6 digested by EcoRⅠ/SalⅠ;5:pEGFP-C1-SMAD4△4-6 digested by EcoRⅠ/SalⅠ;6:pEGFP-C1-SMAD4△4-7 digested by EcoRⅠ/SalⅠ;7:pEGFP-C1-SMAD4 digested by EcoRⅠ/SalⅠ.

2.3 SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的亞定位

為了研究SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的亞定位,我們將上述所得重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中,48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的分布情況,對(duì)SMAD4全長及剪接體轉(zhuǎn)染組在細(xì)胞核定位、細(xì)胞質(zhì)定位以及核質(zhì)均有定位的細(xì)胞數(shù)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并計(jì)算3種分布類型細(xì)胞所占百分比。結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空載體的對(duì)照組中,核質(zhì)均勻分布的細(xì)胞所占比例為99%;與之相比,在SMAD4全長轉(zhuǎn)染組以及SMAD4△4、SMAD4△6、SMAD4△5-6、SMAD4△4-6和SMAD4△4-7五種剪接體轉(zhuǎn)染組中,核質(zhì)均勻分布的細(xì)胞僅在1%～7%,絕大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的胞質(zhì)分布(百分比在93%～99%)(圖4)。值得注意的是,與上述5種SMAD4剪接體的細(xì)胞內(nèi)定位不同,SMAD4△3在HEK-293T細(xì)胞中的分布主要集中于細(xì)胞核(占比91%),基本沒有呈現(xiàn)明顯的胞質(zhì)分布,說明SMAD4△3呈現(xiàn)過度的細(xì)胞核定位。

圖4 SMAD4全長及剪接體在HEK-293T中的亞細(xì)胞定位(A)SMAD4全長及剪接體亞細(xì)胞定位的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。隨機(jī)選取5個(gè)不同熒光觀察視野共計(jì)180～200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行僅有核內(nèi)熒光信號(hào)、僅有胞質(zhì)熒光信號(hào)以及熒光信號(hào)均勻分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的3種熒光分布類型的細(xì)胞數(shù)及百分占比統(tǒng)計(jì),并繪制百分比直方圖;(B)SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中具有代表性的熒光分布圖。Fig.4 Subcellular localization of full-length SMAD4 and the splicing variants in HEK-293T cells(A)Statistical analysis results of full-length SMAD4 and splicing variants distribution.Five random fields were selected and the staining pattern of each cell within the field was counted visually according to the three categories including only nucleus distribution,only cytoplasm distribution and whole cell distribution.Plotted is the percentage of cells in each category±standard deviation;(B)Representative fluorescence images of full-length SMAD4 and splicing variants distribution.

2.4 SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性分析

作為TGF-β/Smads信號(hào)通路中核心的轉(zhuǎn)錄因子,SMAD4與胞質(zhì)中的R-SMADs形成復(fù)合體入核后,通過識(shí)別并結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子上的SBE發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的功能。為了對(duì)比SMAD4全長及剪接體的轉(zhuǎn)錄活性,也為了明確SMAD4△3剪接體的核分布是否組成型激活TGF-β/Smads信號(hào)通路,我們?cè)贖EK-293T細(xì)胞中檢測了SMAD4全長及剪接體對(duì)4*SBE-luc(4拷貝SMAD結(jié)合元件報(bào)告基因)轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果如圖5所示,與轉(zhuǎn)染flag空載體的對(duì)照組相比,6種SMAD4剪接體過表達(dá)組中,只有具有核分布的SMAD4△3過表達(dá)組呈現(xiàn)出了一定程度SBE報(bào)告基因的熒光素酶活性上調(diào)趨勢。這個(gè)結(jié)果說明SMAD4△3剪接體較小程度地激活TGF-β/Smads信號(hào)通路。值得注意的是,與SMAD4△3過表達(dá)組相比,分布于細(xì)胞質(zhì)的全長SMAD4的過表達(dá)更加顯著地增強(qiáng)了SBE報(bào)告基因的熒光素酶活性。

3 討論

SMAD4蛋白作為TGF-β/Smads信號(hào)通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子,其全長蛋白質(zhì)在癌癥發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮抑制作用的研究報(bào)道已有很多,但迄今為止,關(guān)于SMAD4各種剪接體的表達(dá)及生物學(xué)功能的研究報(bào)道卻還極少。而且,雖有研究報(bào)道甲狀腺癌組織中存在SMAD4△5-6、SMAD4△4-6和SMAD4△4-7的表達(dá)[16];原代神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中存在SMAD4△5-6和SMAD4△4-6的表達(dá)[17];乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中只有SMAD4△5-6剪接型的表達(dá)[18];人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT中有本文提及的6種SMAD4蛋白剪接型的表達(dá),并在輻射照射條件下HaCaT中存在SMAD4B的表達(dá)[19],但對(duì)于SMAD4蛋白剪接體生物學(xué)功能的研究報(bào)道幾乎是空白。

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位對(duì)其功能的發(fā)揮十分重要。利用熒光蛋白的定位來確定與熒光蛋白基因融合的目的基因的表達(dá)與定位,是目前蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究的一種常用方法。GFP因具有相對(duì)分子質(zhì)量小、能很好地與目的基因融合表達(dá)、在真核細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性表達(dá)以及所產(chǎn)生的綠色熒光易于檢測等優(yōu)點(diǎn)[20～21],成為被廣泛使用的熒光標(biāo)簽之一。本文通過融合GFP觀察了人SMAD4全長蛋白質(zhì)以及6種剪接體蛋白質(zhì)在HEK-293T中的表達(dá)與定位情況。不同于全長蛋白質(zhì)以及SMAD4△4、SMAD4△6、SMAD4△5-6、SMAD4△4-6、SMAD4△4-7這5種剪接體的細(xì)胞質(zhì)分布,3號(hào)外顯子缺失突變體SMAD4△3定位于細(xì)胞核(圖4)。根據(jù)已有的SMAD4全長蛋白質(zhì)各功能結(jié)構(gòu)域組成的報(bào)道[22],推測SMAD4△3剪接體的組成型核定位至少一部分是由于SMAD4的3號(hào)外顯子中所包含的核輸出信號(hào)(NES)被剔除了。

許多轉(zhuǎn)錄因子的差異剪接體蛋白質(zhì)因組成型核定位,進(jìn)而組成型激活(即不需要配體分子存在就能入核介導(dǎo)下游靶基因轉(zhuǎn)錄)下游介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),例如雄激素受體(androgen receptor,AR)的剪接體蛋白質(zhì)AR-Vs。目前已報(bào)道的AR-Vs均缺乏配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,但它們?nèi)匀荒軌蛟谌狈π奂に嘏潴w結(jié)合或AR全長蛋白質(zhì)的情況下實(shí)現(xiàn)核定位,組成型激活細(xì)胞中的AR信號(hào)。AR-Vs核定位的實(shí)現(xiàn),被認(rèn)為是基于AR-Vs所保留的核定位信號(hào)(NLS)的作用;但對(duì)于那些缺乏NLS序列的AR-Vs(如AR-V7)來說,促成這種高效核定位的一個(gè)因素很可能是它們?nèi)狈τ葾R六號(hào)外顯子編碼的NES[23]。盡管SMAD4△3剪接體的核定位現(xiàn)象及原因與AR-V7類似,但其并未展現(xiàn)出超越SMAD4全長蛋白質(zhì)的組成型激活下游TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力(圖5)。有研究顯示,大小在60 kD甚至是90 kD左右以下的蛋白質(zhì),可通過核孔復(fù)合體以自由擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞核[24]。在TGF-β/Smads信號(hào)通路未被激活的情況下,由于SMAD4全長蛋白質(zhì)的大小約為60 kD且一般以單體形式存在于細(xì)胞中[25],所以SMAD4單體及相對(duì)分子質(zhì)量小于全長的各種剪接體單體均可自由入核。但在該信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄被激活的過程中,SMAD4蛋白與R-SMAD蛋白異源復(fù)合體的形成是必需的;此時(shí)SMADs復(fù)合物的相對(duì)分子質(zhì)量大于核孔自由擴(kuò)散的極限蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量,該復(fù)合物將以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞饺牒?繼而激活下游的轉(zhuǎn)錄。在我們的研究結(jié)果中,SMAD4△3剪接體的轉(zhuǎn)錄激活能力不及SMAD4全長蛋白質(zhì)。盡管SMAD4全長蛋白質(zhì)只有極少數(shù)占比的全細(xì)胞分布情況(約1%),但該小部分核內(nèi)分布的SMAD4,極可能是以與R-SMAD蛋白形成具有高轉(zhuǎn)錄激活能力的蛋白復(fù)合體形式存在;而相反地,SMAD4△3剪接體則可能因其NES序列缺失導(dǎo)致單體分子過度入核,阻礙了大部分具有高轉(zhuǎn)錄激活能力的SMAD4△3與R-SMAD蛋白形成復(fù)合體。這也就合理解釋了SMAD4△3剪接體的組成型核定位并未組成型激活下游轉(zhuǎn)錄的原因。而其顯著高于其他5種SMAD4剪接體的轉(zhuǎn)錄激活能力,則可能是因?yàn)槠浔Ａ袅送暾亩ㄎ挥?號(hào)外顯子和7號(hào)外顯子整個(gè)區(qū)域的SMAD轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(SMAD activation domain),該位點(diǎn)被認(rèn)為是SMAD4轉(zhuǎn)錄激活所必需的[1]。

圖5 SMAD4全長及剪接體在HEK-293T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性分析用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測SBE報(bào)告基因的激活情況。與flag-SMAD4△3組相比,##P＜0.01,###P＜0.001;與空載體組相比,**P＜0.01,***P＜0.001。Fig.5 Analysis of transcriptional activity of the full-length SMAD4 and the splicing variants in HEK-293T cellsThe activation of SBE luciferase reporter was detected by dualluciferase reporter assays.##P＜0.01,###P＜0.001,compared with flag-SMAD4△3;**P＜0.01,***P＜0.001,compared with vector.

經(jīng)典的TGF-β/SMAD4信號(hào)通路通過R-SMADs/SMAD4激活誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯相關(guān)因子(如p15、p21和p27等)和凋亡相關(guān)靶蛋白(如GADD45β、Bim等)的轉(zhuǎn)錄,抑制早期腫瘤的發(fā)生發(fā)展,該過程依賴于SMAD4自身的核定位和轉(zhuǎn)錄激活能力。但近年來有文獻(xiàn)報(bào)道了SMAD4不依賴其自身轉(zhuǎn)錄激活功能而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的例子,如Chao等[26]發(fā)現(xiàn)SMAD4能促進(jìn)p53的入核,從而上調(diào)p53介導(dǎo)的下游促凋亡靶基因的轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致酪氨酸激酶抑制劑誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。因此,盡管本研究中SMAD4△3剪接體未表現(xiàn)出超越SMAD4全長蛋白質(zhì)的組成型轉(zhuǎn)錄激活能力,但其能否通過自身的組成型核定位特性來促進(jìn)某些轉(zhuǎn)錄因子的入核,進(jìn)而參與細(xì)胞的一些生命活動(dòng)過程,依然值得深入探討。

另外,早在20年前,Pierreux等[12]就利用flag標(biāo)簽對(duì)SMAD4全長及剪接體的亞細(xì)胞定位進(jìn)行過研究。在未進(jìn)行任何處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH 3T3中,研究者能觀察到顯著的外源性人源 SMAD4全長、SMAD4△6、SMAD4△5-6和SMAD4△4-7的胞質(zhì)分布以及SMAD4△3的胞核分布,這與我們?cè)贖EK-293T中的觀察結(jié)果相對(duì)應(yīng);但另兩種剪接體蛋白質(zhì)SMAD4△4與SMAD4△4-6在NIH 3T3細(xì)胞中的分布,卻與我們觀察到的在HEK-293T細(xì)胞中的胞質(zhì)定位不同,前者主要分布在細(xì)胞核,而后者則呈現(xiàn)胞核和胞質(zhì)的均勻分布。這提示,同一種蛋白質(zhì)剪接體在不同細(xì)胞類型中發(fā)揮的功能以及機(jī)制不盡相同。

綜上所述,我們對(duì)SMAD4全長及剪接體在人胚腎細(xì)胞系HEK-293T中的亞定位及轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了研究,為后續(xù)深入研究SMAD4剪接體的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。