汪 貞 范德玲 周林軍 古 文 葛海虹 朱 偉

(1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，江蘇 南京 210042；2.生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京 100029)

生態(tài)危害評估是定性和(或)定量評估生物體、系統(tǒng)或(亞)種群暴露于化學(xué)物質(zhì)中的潛在危害性，是化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險評估的首要任務(wù)。生態(tài)危害評估包括基于單一物種和基于生態(tài)系統(tǒng)兩種尺度的研究[1]。物種敏感度分布曲線(SSD)法是基于單一物種毒性測試數(shù)據(jù)的生態(tài)危害評估方法之一，被廣泛用于推導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)。水生微宇宙技術(shù)是一種通過人工構(gòu)建、模擬水生態(tài)系統(tǒng)組成和過程的試驗?zāi)Ｐ?，通過開展毒性測試進(jìn)而評估外源物質(zhì)進(jìn)入水生環(huán)境后的歸趨和對生物的危害。早在20世紀(jì)初，很多學(xué)者開始對微宇宙系統(tǒng)開展一系列研究，分析不同營養(yǎng)級生產(chǎn)者、消費者和分解者的關(guān)系，生物豐度和理化性質(zhì)聯(lián)系，種間競爭和生物多樣性等，微宇宙技術(shù)已成為歐美等發(fā)達(dá)國家化學(xué)品高層次生態(tài)風(fēng)險評估的重要方式之一。

四溴雙酚A是一種大量生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用的溴化阻燃劑，據(jù)統(tǒng)計，每年有約12萬t四溴雙酚A及其衍生物為市場所需[2]，占總溴化阻燃劑市場的60%左右[3]。四溴雙酚A雖然能以共價鍵的形式結(jié)合聚合物且不易溶于水，但是未結(jié)合的部分很容易釋放到生態(tài)環(huán)境中[4]。我國環(huán)渤海地區(qū)、長江流域、云南洱海、珠江三角洲等水域均有四溴雙酚A檢出，個別水域檢出質(zhì)量濃度甚至高達(dá)4.77 μg/L[5-8]。四溴雙酚A對水生生物存在毒性并具有遷移性、持久性和蓄積性等特點[9-10]，會對環(huán)境造成長久的污染，更可能通過食物鏈的生物富集性和生物放大作用擴(kuò)散到整個生態(tài)系統(tǒng)中。國內(nèi)目前缺乏含有四溴雙酚A的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，因此針對四溴雙酚A的綜合生態(tài)風(fēng)險評估難以進(jìn)行。

本研究通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化微宇宙系統(tǒng)試驗?zāi)M真實的生態(tài)環(huán)境來評估四溴雙酚A在水生環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險。通過微宇宙系統(tǒng)試驗得到四溴雙酚A的無顯著效應(yīng)濃度(NOEC)，并與采用SSD法[11]推導(dǎo)出的四溴雙酚A在水環(huán)境中的預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC)進(jìn)行對比，探索兩種生態(tài)危害評估方法的差異性，這對于提高我國化學(xué)品危害評估的系統(tǒng)性和科學(xué)性具有參考價值，也為我國開展不同層次的四溴雙酚A環(huán)境危害評估提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

Agilent 1290型高效液相色譜(美國Agilent公司)，QTRAP 4500型質(zhì)譜(美國AB公司)，DM2500型光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)，DR2800型分光光度計(美國哈希公司)，HQ 40d型多參數(shù)水質(zhì)分析儀(美國哈希公司)，2100Q型便攜式濁度分析儀。

四溴雙酚A(分析純)，纖維素(生物試劑級)，幾丁質(zhì)(生物試劑級)。試驗用到的輪蟲培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[12]，T82MV培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[13]，魯哥氏液配制參考文獻(xiàn)[14]。

1.2 供試生物

試驗用的6種藻類，包括小球藻(Chlorella)、四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)和鐮形纖維藻(Ankistrodesmusfalcatus)，均購自中國科學(xué)院淡水藻種庫；萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)從南京師范大學(xué)引入；中華新米蝦(Neocaridinadenticulatasinensis)購自南京本地市場；大型溞(Daphniamagna)由本實驗室培養(yǎng)。所有生物培養(yǎng)方法均參考文獻(xiàn)[12]。

1.3 微宇宙試驗方法

參照美國材料實驗協(xié)會(ASTM)的微宇宙技術(shù)導(dǎo)則開展為期63 d的微宇宙試驗[13]。在體積5 L的燒杯中裝入200 g石英砂、0.5 g纖維素、0.5 g幾丁質(zhì)和3 L T82MV培養(yǎng)基以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化微宇宙系統(tǒng)。實驗室溫度維持在20～22 ℃，光照約為3 000 lux，明暗周期為12 h∶12 h。試驗第0天加入6種藻類，每種藻類初始細(xì)胞濃度為104個/mL，第4天加入大型溞16只、萼花臂尾輪蟲90只和中華新米蝦12只。試驗第7天，根據(jù)溶解氧(DO)、pH、大型溞數(shù)量等指標(biāo)剔除差異較大的微宇宙系統(tǒng)，向穩(wěn)定的微宇宙系統(tǒng)中分別加入80.00、400.00、2 000.00、10 000.00 μg/L四溴雙酚A，同時設(shè)置空白對照組(ck組)，每個處理做6個平行取平均值。

試驗第7天開始，每周兩次測定微宇宙系統(tǒng)pH、葉綠素a和物種豐度等參數(shù)，四溴雙酚A濃度每周測定1次。DO每周測定2次，每次測定記錄3次DO數(shù)據(jù)，分別為早上光周期開始前、下午光周期結(jié)束前以及第2天光周期開始前，計算微宇宙系統(tǒng)光合作用產(chǎn)氧量以及呼吸作用耗氧量，計算式分別見式(1)、式(2)。試驗期間每周向微宇宙系統(tǒng)加入輪蟲培養(yǎng)液1滴(約0.05 mL)、6種藻的混合液10 mL(每種藻的接種細(xì)胞濃度均為104個/mL)以補充取樣損失，根據(jù)需要加入大型溞和中華新米蝦使其在每個微宇宙系統(tǒng)內(nèi)的數(shù)量保持在3只以上。當(dāng)某物種全部死亡后，不再另行補充。

P=DO2-DO1

(1)

R=DO2-DO3

(2)

式中：P為微宇宙系統(tǒng)光合作用產(chǎn)氧量，mg/L；R為微宇宙系統(tǒng)呼吸作用耗氧量，mg/L；DO1、DO2、DO3分別為早上光周期開始前、下午光周期結(jié)束前以及第2天光周期開始前微宇宙系統(tǒng)的DO質(zhì)量濃度，mg/L。

1.4 分析方法

水質(zhì)指標(biāo)：DO、pH采用哈希HQ 40d型多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定；葉綠素a采用分光光度法測定；濁度采用濁度分析儀測定。

物種豐度：中華新米蝦、大型溞豐度采用抽樣肉眼計數(shù)；取攪拌均勻的微宇宙水樣用魯哥氏液固定，在顯微鏡下用浮游生物計數(shù)板對萼花臂尾輪蟲、藻類進(jìn)行計數(shù)。

四溴雙酚A濃度測定：取10 mL水樣離心后取其上清液過0.45 μm濾膜，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)試驗期間四溴雙酚A濃度變化，采用時間加權(quán)計算微宇宙系統(tǒng)四溴雙酚A平均暴露濃度[16]；物種豐度數(shù)據(jù)和理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)化后，用單因素方差分析和Dunnett’s檢驗確定空白對照組與處理組差異的顯著性。引起顯著性差異的濃度為最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)，比LOEC小的上一級濃度視為無顯著效應(yīng)濃度(NOEC)，最后以各采樣時間點的最敏感NOEC作為系統(tǒng)整體水平的NOEC。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 微宇宙系統(tǒng)中的水質(zhì)參數(shù)

2.1.1 四溴雙酚A在微宇宙系統(tǒng)中的暴露濃度

由于四溴雙酚A在水中的溶解度較低，微宇宙系統(tǒng)中浮游植物和懸浮顆粒物能有效吸附疏水性四溴雙酚A，浮游動物也能通過消化道和體表對其進(jìn)行吸收，加上其自身的可降解性，試驗期間四溴雙酚A處理組的暴露濃度均逐漸減小(見圖1)，通過對初始質(zhì)量濃度為80.00、400.00、2 000.00、10 000.00 μg/L的四溴雙酚A進(jìn)行時間加權(quán)平均運算，得到微宇宙系統(tǒng)水體中四溴雙酚A的平均質(zhì)量濃度分別為10.80、55.11、259.42、1 356.61 μg/L，下文中四溴雙酚A在微宇宙系統(tǒng)中暴露濃度均用時間加權(quán)平均濃度表示。

圖1 微宇宙系統(tǒng)中四溴雙酚A變化趨勢Fig.1 Trend of tetrabromobisphenol A measured in microcosms

2.1.2 微宇宙系統(tǒng)中DO和pH的變化

試驗過程中，微宇宙系統(tǒng)光合作用產(chǎn)氧量、呼吸作用耗氧量、光合呼吸比率(P/R)及pH變化見圖2。顯著性分析結(jié)果表明，各四溴雙酚A處理組及與ck組之間的光合作用產(chǎn)氧量、呼吸作用耗氧量均無明顯差異，第30天時，各微宇宙系統(tǒng)的呼吸作用耗氧量均達(dá)到最低值，此后一周內(nèi)，呼吸作用耗氧量又逐漸回升。光合呼吸比率可用于評價微宇宙系統(tǒng)能量流動方向，本研究構(gòu)建的微宇宙系統(tǒng)光合呼吸比率基本保持在1以下，說明系統(tǒng)內(nèi)呼吸作用耗氧量大于光合作用產(chǎn)氧量，能量大多向較高營養(yǎng)級的大型溞、萼花臂尾輪蟲及中華新米蝦方向流動。

圖2 微宇宙DO和pH變化Fig.2 Dynamics of DO and pH in microcosms

pH可以反映微宇宙系統(tǒng)內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)種群的代謝情況。試驗過程中，各微宇宙系統(tǒng)的pH均在6.5～9.5波動，顯著性分析結(jié)果表明，4個四溴雙酚A處理組與ck組的pH沒有顯著性差異，表明四溴雙酚A沒有顯著擾亂微宇宙系統(tǒng)中生物種群的正常代謝。

2.1.3 微宇宙系統(tǒng)濁度和葉綠素a的變化

微宇宙系統(tǒng)濁度與葉綠素a的變化見圖3。濁度可以反映微宇宙系統(tǒng)水體中顆粒物含量，與藻細(xì)胞濃度以及各種生物的代謝產(chǎn)物濃度有關(guān)。試驗中各微宇宙系統(tǒng)的濁度變化趨勢相近，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，四溴雙酚A處理組與ck組的濁度沒有顯著性差異。葉綠素a反映了微宇宙系統(tǒng)內(nèi)藻類生物量的變化。試驗前28天，各微宇宙系統(tǒng)的葉綠素a變化幅度較小，28 d后葉綠素a變化幅度較大。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，除個別暴露時間點外，四溴雙酚A處理組與ck組的葉綠素a沒有顯著性差異。

圖3 微宇宙系統(tǒng)濁度和葉綠素a的變化Fig.3 Dynamics of turbidity and chlorophyll a in microcosms

2.2 微宇宙系統(tǒng)中物種豐度的變化

2.2.1 浮游動物豐度變化

微宇宙系統(tǒng)浮游動物豐度變化見圖4。由圖4(a)可見，四溴雙酚A處理組的大型溞豐度變化與ck組總體比較相似，且大型溞豐度與四溴雙酚A的暴露濃度沒有明顯的相關(guān)性，高濃度暴露組(259.42、1 356.61 μg/L)大型溞豐度在28 d后均高于低濃度暴露組(10.80、55.11 μg/L)及ck組，這可能與中華新米蝦豐度變化有關(guān)。數(shù)據(jù)顯著性分析結(jié)果也表明，四溴雙酚A處理組與ck組大型溞豐度變化沒有顯著差異。

由圖4(b)可知，試驗第4～28天，各微宇宙系統(tǒng)中的萼花臂尾輪蟲豐度均處于較低水平，28 d后，ck組萼花臂尾輪蟲豐度開始逐漸升高，四溴雙酚A處理組的萼花臂尾輪蟲豐度在試驗第49～63天均顯著下降?？傮w看來，萼花臂尾輪蟲豐度并未隨四溴雙酚A暴露濃度的升高而出現(xiàn)規(guī)律性變化。

圖4 微宇宙系統(tǒng)大型溞、萼花臂尾輪蟲以及中華新米蝦的豐度變化Fig.4 Changes of daphnia,rotifer and shrimp abundances in microcosms

由圖4(c)可知，四溴雙酚A處理組中華新米蝦豐度急劇減少，在試驗第7～14天一直處于下降趨勢，第38～63天，中華新米蝦豐度基本穩(wěn)定。微宇宙系統(tǒng)的中華新米蝦豐度變化存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，四溴雙酚A暴露濃度越高，中華新米蝦受到的影響越大，死亡率越高。

2.2.2 浮游植物豐度變化

微宇宙系統(tǒng)總藻豐度變化見圖5。由圖5可見，試驗第0～7天所有微宇宙系統(tǒng)的總藻豐度均呈指數(shù)增長，隨后總藻豐度在生態(tài)系統(tǒng)中的捕食者和四溴雙酚A的相互作用下呈現(xiàn)波動變化。試驗后期(第49～63天)，各微宇宙系統(tǒng)的總藻豐度均有不同程度的下降，這可能與大型溞和中華新米蝦的種群豐度穩(wěn)定有關(guān)。四溴雙酚A處理組與ck組相比，總藻豐度沒有顯著差異。

圖5 微宇宙系統(tǒng)總藻豐度變化Fig.5 Changes of total algae species abundances in microcosms

2.3 微宇宙系統(tǒng)對四溴雙酚A的生態(tài)危害綜合評估

參照ASTM的微宇宙技術(shù)導(dǎo)則，以不同物種的豐度以及理化指標(biāo)作為生態(tài)危害效應(yīng)的終點，對四溴雙酚A處理組和ck組在不同暴露時間點的物種豐度和理化指標(biāo)進(jìn)行顯性方差分析，結(jié)果見表1。整個微宇宙系統(tǒng)存在一條4個營養(yǎng)級的食物鏈(藻類-萼花臂尾輪蟲-大型溞-中華新米蝦)，其中中華新米蝦作為頂級捕食者在暴露初期(14～28 d)的LOEC一直維持最高水平(1 356.61 μg/L)，與ck組相比，中華新米蝦豐度顯著下降，說明四溴雙酚A的毒性作用是影響中華新米蝦豐度的關(guān)鍵因素。在不同暴露時間點、不同四溴雙酚A暴露濃度下，大型溞豐度與ck組均未出現(xiàn)顯著差異，說明大型溞受四溴雙酚A毒性影響較小。此外，高pH可能減少四溴雙酚A對大型溞的毒性[17]。萼花臂尾輪蟲的豐度變化與大型溞和中華新米蝦均不相同，具體表現(xiàn)在LOEC在第49～56天維持在55.11 μg/L，在此階段四溴雙酚A處理組的中華新米蝦、大型溞豐度與ck組相比均未發(fā)生顯著增減，萼花臂尾輪蟲豐度卻出現(xiàn)顯著下降，這可能是微宇宙系統(tǒng)試驗后期四溴雙酚A濃度降低促使大型溞豐度回升，影響了萼花臂尾輪蟲種群恢復(fù)，在試驗第63天LOEC下降至10.80 μg/L，表明四溴雙酚A的生物毒性也會導(dǎo)致萼花臂尾輪蟲豐度顯著減少。藻類作為生產(chǎn)者也受到類似的捕食壓力，試驗第7天四溴雙酚A處理組藻類豐度與ck組沒有顯著差異。四尾柵藻、羊角月牙藻和鐮形纖維藻均為藻類中的優(yōu)勢種群且對四溴雙酚A的暴露具有較高抗性，所以在各暴露時間結(jié)點均未觀測到與ck組的顯著差異，優(yōu)勢種群的主導(dǎo)地位使得其余藻類的變化不明顯。當(dāng)大型溞和中華新米蝦種群處于穩(wěn)定期，羊角月牙藻豐度出現(xiàn)顯著下降，羊角月牙藻在第42、56天的LOEC為259.42 μg/L，可能是受到捕食脅迫作用導(dǎo)致?？傇遑S度在不同暴露時間點、不同四溴雙酚A暴露濃度下與ck組間差異均不顯著，表明四溴雙酚A化學(xué)暴露對藻類的影響較小。葉綠素a受到藻類豐度影響明顯，但葉綠素a在試驗第21天的LOEC為1 356.61 μg/L，葉綠素a濃度顯著升高，這可能是由于捕食者大量減少導(dǎo)致，后續(xù)試驗期間各四溴雙酚A處理組的葉綠素a均未出現(xiàn)連續(xù)的顯著變化，因此認(rèn)為葉綠素a受藻類豐度和捕食者壓力的共同作用影響。

表1 物種豐度以及理化指標(biāo)在不同暴露時間點的LOEC1)

從理化指標(biāo)來看，由于微宇宙系統(tǒng)的穩(wěn)定性，pH在整個試驗過程中均保持在穩(wěn)定的水平，說明微宇宙系統(tǒng)內(nèi)部化學(xué)變化較小。pH在多營養(yǎng)級系統(tǒng)比單一營養(yǎng)級系統(tǒng)的波動小[18]，說明生物的多樣性(浮游動物和植物)對水體的pH有一定的緩沖作用。P/R在第42天的LOEC為1 356.61 μg/L，P/R顯著下降，說明微宇宙系統(tǒng)中藻類作為生產(chǎn)者其光合作用產(chǎn)氧量不及消費者(大型溞、萼花臂尾輪蟲和中華新米蝦等浮游動物)的呼吸耗氧量，但是從整個試驗周期來看，未發(fā)生兩個或兩個以上連續(xù)暴露時間的P/R顯著變化，可見四溴雙酚A作為外源污染物沒有明顯干擾微宇宙系統(tǒng)種群間的能量交換。

文獻(xiàn)[11]利用SSD法推導(dǎo)出的四溴雙酚A的PNEC為42.9 μg/L。本研究根據(jù)微宇宙系統(tǒng)試驗各指標(biāo)的綜合評估，得出四溴雙酚A在7～56 d的NOEC為10.80 μg/L，63 d的NOEC低于10.80 μg/L。與基于單物種毒性試驗得出的PNEC(42.9 μg/L)相比低約75%?？梢?，根據(jù)SSD法估算出的生態(tài)風(fēng)險值與模擬生態(tài)環(huán)境下實際NOEC值存在較大的差距。

水生態(tài)危害評估方法中，微宇宙系統(tǒng)和基于單一物種的SSD法所估算出的生態(tài)危害濃度并不存在簡單的外推關(guān)系[12]。微宇宙系統(tǒng)試驗?zāi)芴峁㏒SD法所不能實現(xiàn)的物種間關(guān)系的代謝變化、暴露于化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)部水環(huán)境和物質(zhì)間的因果關(guān)系等信息，但仍存在可重復(fù)性差和龐雜數(shù)據(jù)合理分析不足等弊端。利用微宇宙系統(tǒng)的方法估計四溴雙酚A的生態(tài)危害性，通過不同營養(yǎng)級構(gòu)成的小型生態(tài)系統(tǒng)實現(xiàn)區(qū)域或整個生態(tài)系統(tǒng)的危害評估，直觀地反映生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各因子相互作用的結(jié)果，可以對基于SSD法所估算出四溴雙酚A的PNEC進(jìn)行互補與對比，為四溴雙酚A水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié) 論

(1) 四溴雙酚A微宇宙系統(tǒng)中，pH基本保持穩(wěn)定，沒有顯著性變化，P/R值總體小于1。四溴雙酚A的化學(xué)暴露是影響中華新米蝦豐度的關(guān)鍵因素，但其對藻類、大型溞、萼花臂尾輪蟲的影響不顯著。

(2) 通過對微宇宙系統(tǒng)中物種豐度，系統(tǒng)理化指標(biāo)等的觀察分析，得到微宇宙系統(tǒng)7～56 d的NOEC為10.80 μg/L，63 d的NOEC低于10.80 μg/L，低于基于單物種毒性試驗得出的PNEC(42.9 μg/L)，產(chǎn)生差異的原因可能是微宇宙系統(tǒng)的種間競爭和各營養(yǎng)級在不同介質(zhì)中的交互作用的影響。

(3) 利用微宇宙系統(tǒng)評估四溴雙酚A的生態(tài)危害性，通過不同營養(yǎng)級構(gòu)成的小型生態(tài)系統(tǒng)能夠更直觀地反映生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各因子相互作用的結(jié)果，為四溴雙酚A水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)支持。