郭青青，郭海磊，劉娜女，奚緒光

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

解旋酶是一類可以水解三磷酸腺苷釋放能量并打開核酸之間氫鍵的一類分子“馬達(dá)”蛋白，廣泛存在于病毒、細(xì)菌和真核生物中[1-2]，參與細(xì)胞的多種代謝過程，如DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及RNA剪切等生命活動(dòng)[3-5]。編碼解旋酶的基因一旦發(fā)生突變或缺失，將無法表達(dá)相應(yīng)的蛋白，進(jìn)而引起多種嚴(yán)重的遺傳性疾病，如Bloom綜合癥、Werner綜合癥、Rothmund-Thomson綜合癥等[6-8]。根據(jù)解旋酶的序列保守性、結(jié)構(gòu)相似性及解旋方向性，可以將其分為6個(gè)超家族：SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6[9]。SF1和SF2是其中最大的兩個(gè)超家族，SF1是目前研究得最清楚的超家族；SF2是含有眾多亞家族的超家族，其中研究較多的是DEAD-box、DEAH/RHA和Snf2等亞家族[10-12]。

富含鳥嘌呤的核酸序列可以通過4個(gè)鳥嘌呤自行組裝成四鏈體結(jié)構(gòu)，即G4結(jié)構(gòu)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，能夠形成G4結(jié)構(gòu)的基因序列多存在于特定的基因組區(qū)域，例如端粒、核糖體DNA、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子區(qū)域[13-15]等。由于位置的特殊性，G4結(jié)構(gòu)可能參與了基因表達(dá)調(diào)控的許多生物學(xué)過程[16-17]。G4結(jié)構(gòu)主要有兩類，即DNA G4結(jié)構(gòu)和RNA G4結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)，人類細(xì)胞中的DNA G4結(jié)構(gòu)在DNA復(fù)制、修復(fù)以及維持染色體的穩(wěn)定等方面起著重要的作用。在DNA復(fù)制過程中，DNA G4結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)會(huì)阻礙復(fù)制的順利進(jìn)行，此時(shí)就需要解旋酶來進(jìn)行修復(fù)[18]。真核細(xì)胞中有許多解旋酶，其中不少參與G4結(jié)構(gòu)的解旋活動(dòng)[19-20]。

DHX36(也稱為RHAU或G4R1)是SF2超家族中DEAH/RHA亞家族的成員，是對(duì)含有G4結(jié)構(gòu)的底物具有較高親和力的一類ATP依賴型RNA解旋酶[19-21]。DHX36的基本組成是解旋酶核心區(qū)域以及位于兩側(cè)的N端和包含OB域的C端區(qū)域。目前，人們對(duì)DHX36 N端區(qū)域的研究較為深入，根據(jù)生物信息學(xué)分析，將其分為兩個(gè)部分：富含甘氨酸區(qū)和RSM區(qū)[22]。Lattman等[23]發(fā)現(xiàn)，DHX36 N端的RSM區(qū)是參與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合和解旋活動(dòng)必不可少的部分，截去N端區(qū)域后蛋白不具有解旋活性。還有研究表明，DHX36的RSM區(qū)氨基酸序列能夠識(shí)別端粒上的G4結(jié)構(gòu)并參與端粒延伸的調(diào)控[24]。說明DHX36的N端區(qū)域是參與G4結(jié)構(gòu)解旋的重要部位。據(jù)報(bào)道，DHX36能夠與G4結(jié)構(gòu)相互作用，從而對(duì)轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行調(diào)控，其還在小鼠心臟發(fā)育和造血過程中發(fā)揮重要作用[25-26]。Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，果蠅DHX36(DmDHX36)N端的RSM區(qū)和C端的OB域是參與G4結(jié)構(gòu)結(jié)合及解旋的主要部位。

目前，因人DHX36(hDHX36)蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)難度較大，因此有關(guān)hDHX36的酶學(xué)特征和結(jié)構(gòu)研究相對(duì)較少。本研究選擇與hDHX36同源性較高且可在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的牛(Bostaurus)DHX36(BtDHX36)解旋酶為材料，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高純度野生型BtDHX36蛋白、RSM區(qū)突變體蛋白(BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A)和OB域突變體蛋白(BtDHX36Y862A)，利用熒光各向異性法(FA)和快速停流-熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)，比較野生型BtDHX36及其突變體對(duì)底物結(jié)合和解旋活性的差異，旨在為牛DHX36的酶學(xué)特征和結(jié)構(gòu)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、載體及菌種 野生型BtDHX36蛋白編碼的基因序列(載體PBHM-BtDHX36)，由Bio-Matik公司合成；表達(dá)載體pET15b、大腸桿菌菌株Top10、BL21(DE3)和質(zhì)粒pET15b-sumo-DmDHX36均由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物大分子實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑、柱材及儀器 T4 DNA ligase、Prime STAR DNA polymerase，購自Takara公司；EcoRⅠ、XhoⅠ、NdeⅠ等限制性內(nèi)切酶，購自NEB公司；Ni-NTA Beads、Hi Trap SP HP預(yù)裝柱，購自GE healthcare公司；低溫超高壓破碎儀，購自JNBIO公司；超聲波破碎儀，購自寧波江南儀器廠；AKTA purifier蛋白純化儀，購自GE healthcare公司。

1.2 方 法

1.2.1 DNA底物的準(zhǔn)備 根據(jù)文獻(xiàn)[28]，設(shè)計(jì)用于DNA結(jié)合試驗(yàn)的底物16nt-ssDNA、Telomere G4和用于解旋試驗(yàn)的底物Telomere G4-16T序列，交給生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中16nt-ssDNA和Telomere G4底物均標(biāo)記熒光素(fluorescein，F(xiàn))，Telomere G4-16T底物標(biāo)記熒光素(fluorescein，F(xiàn))和六氯熒光素(hexachloroflourescein，HF)，底物序列見表1。16nt-ssDNA底物用ddH2O稀釋后備用；Telomere G4和Telomere G4-16T底物分別置于退火緩沖液(100 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5)中，100 ℃加熱使其變性5 min，然后緩慢冷卻至室溫，備用。

1.2.2 野生型BtDHX36及其突變體表達(dá)載體的構(gòu)建 野生型BtDHX36及其突變體表達(dá)載體構(gòu)建流程如圖1所示。將含有BtDHX36基因的載體PBHM-BtDHX36用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，得到野生型BtDHX36基因片段。使用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pET15b-sumo-DmDHX36質(zhì)粒為模板，以sumo-F為上游引物(序列：5′-GCCATATGAGCGATAGCGAAGT-3′)，sumo-R為下游引物(序列：5′-CAGATTGGCGGCGAATTCCA-3′)，擴(kuò)增具有促進(jìn)蛋白溶解作用的sumo基因片段，PCR擴(kuò)增體系為50 μL：5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus)10 μL、Prime STAR DNA polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4.0 μL、sumo-F和sumo-R(10 μmol/L)各1 μL、模板(30 ng/μL)1 μL、ddH2O 32.5 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min后，16 ℃保溫。對(duì)sumo基因片段進(jìn)行NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切,使用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pET15b載體。將BtDHX36、sumo基因片段、pET15b按照3∶3∶1物質(zhì)的量比加入連接體系，16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Top10克隆菌，涂至平板后于37 ℃培養(yǎng)8 h，對(duì)菌落進(jìn)行PCR、質(zhì)粒EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，最終獲得野生型重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36。

采用Overlap PCR 在BtDHX36中引入點(diǎn)突變，用突變后的BtDHX36基因片段構(gòu)建4種BtDHX36突變體(mutant)(RSM區(qū)突變體BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A和OB域突變體BtDHX36Y862A)的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行菌落PCR、質(zhì)粒EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，具體方法同上。

1.2.3 野生型BtDHX36及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將鑒定正確的野生型重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑選單克隆進(jìn)行活化，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液在600 nm處的吸光度(OD600)為0.7～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度0.3 mmol/L)，18 ℃誘導(dǎo)14 h后取樣。將樣品進(jìn)行4 500 r/min離心(10 min)，收集菌體沉淀，按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶10加入裂解Buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.9，500 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)5%甘油，5 mmol/L咪唑)復(fù)溶，先利用低溫超高壓破碎儀破菌4次，再使用超聲波打斷DNA雙鏈以降低溶液黏度，然后于12 000 r/min離心45 min，分別留取部分上清液和沉淀樣品。用0.45 μm濾膜過濾上清液，將其載入Ni-NTA親和層析柱，使用Elute Buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.9，500 mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)10%甘油，300 mmol/L咪唑)洗脫，留取部分洗脫樣品。將含有目的蛋白的洗脫樣品按1∶1 000的物質(zhì)的量比加入sumo酶，4 ℃酶切過夜，留取部分酶切樣品。用稀釋Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.9，體積分?jǐn)?shù)10%甘油)稀釋蛋白樣品至NaCl終濃度為80 mmol/L，然后使用Hi Trap SP HP柱梯度洗脫，將得到的洗脫樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)，合并較純組分并用30 ku的Millipore超濾管離心濃縮，分裝后立即用液氮速凍，置于-80 ℃保存。對(duì)上述各步所得樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。同法對(duì)BtDHX36突變體蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)與純化。

1.2.4 野生型BtDHX36體外最佳底物結(jié)合條件試驗(yàn) 以16nt-ssDNA為底物，檢測(cè)野生型BtDHX36與底物的體外最佳結(jié)合條件，考察因素包括KCl、MgCl2濃度、反應(yīng)溫度、pH，反應(yīng)體系150 μL，其中含5 nmol/L熒光標(biāo)記底物的16nt-ssDNA、野生型BtDHX36蛋白(0，4，8，12，16，20，24，36，50，100，200，300 nmol/L)和Buffer(20 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5)。分別在不同的KCl濃度(0，50和100 mmol/L)、反應(yīng)溫度(25，30和37 ℃)、MgCl2濃度(0，2和5 mmol/L)、pH(6.5，7.5和8.5)下孵育5 min，用Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)測(cè)定每種反應(yīng)條件下的各向異性值(Δr)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。用Origin軟件擬合蛋白濃度與Δr的曲線，由此曲線獲得理論最大各向異性值(Δrmax)，用希爾方程Δr=Δrmax×P/(Kd+P)，計(jì)算平衡解離常數(shù)(Kd)，式中P為解旋酶的濃度。以Kd為判定指標(biāo)，確定野生型BtDHX36蛋白與16nt-ssDNA的體外最佳結(jié)合條件。

1.2.5 野生型BtDHX36及其突變體的底物結(jié)合活性差異分析 在最佳底物結(jié)合條件下，以Telomere G4為底物，檢測(cè)野生型BtDHX36及其4種突變體(BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A、BtDHX36Y862A)蛋白與底物結(jié)合活性的差異。具體操作為：使用酶標(biāo)板加樣，結(jié)合反應(yīng)體系為150 μL/孔，其中含5 nmol/L底物和不同濃度(0，5，10，15，20，30，40，60，100，200，400 nmol/L)的上述5種蛋白，振蕩混勻，37 ℃孵育5 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)得到其對(duì)應(yīng)的Δr，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。用Origin軟件擬合蛋白濃度與Δr的曲線，由此曲線獲得Δrmax，進(jìn)而得到結(jié)合比例(Δr/Δrmax), 用Origin軟件擬合蛋白濃度與結(jié)合比例的曲線。使用希爾方程計(jì)算Kd，比較5種蛋白結(jié)合活性的差異。

1.2.6 野生型BtDHX36及其突變體的解旋活性差異分析 利用Bio-Logic SFM-400停流裝置結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理，以Telomere G4-16T為底物，測(cè)定得到野生型BtDHX36及其突變體蛋白的解旋動(dòng)力學(xué)曲線，并以速率常數(shù)為指標(biāo)分析野生型BtDHX36及突變體蛋白的解旋活性差異。試驗(yàn)重復(fù)3次，所有解旋數(shù)據(jù)均參考Zhang等[29]的方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型BtDHX36及其突變體的載體構(gòu)建與蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

2.1.1 野生型BtDHX36表達(dá)載體的鑒定及蛋白純化 野生型BtDHX36經(jīng)菌落PCR鑒定,得到2.8 kb的片段(圖2-A)，與預(yù)期結(jié)果一致。挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)了約2.8 kb的目的基因片段(圖2-B)。將重組質(zhì)粒pET15b-sumo-BtDHX36轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn)野生型BtDHX36蛋白(108 ku)，結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白在沉淀和上清液中均有表達(dá)，但主要存在于沉淀中(圖2-C泳道1)。上清液樣品經(jīng)Ni-NTA親和層析純化可得到大量目的蛋白(圖2-C泳道3)，經(jīng)sumo酶切后獲得了不帶sumo標(biāo)簽的蛋白(圖2-C泳道4)；經(jīng)SP柱梯度洗脫后得到相對(duì)較純的野生型BtDHX36(圖2-C泳道5)；最終濃縮得到純度大于95%的野生型BtDHX36蛋白(圖2-C泳道6)。

A.野生型BtDHX36菌落PCR鑒定結(jié)果，M.DS5000 DNA Marker，1.菌落PCR結(jié)果;B.野生型BtDHX36重組質(zhì)粒的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果，M.DS5000 DNA Marker，1.雙酶切產(chǎn)物;C.野生型BtDHX36蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化結(jié)果，1.菌體破碎沉淀，2.菌體破碎上清液，3.Ni-NTA柱洗脫液，4.不帶sumo標(biāo)簽的蛋白，5.Hi Trap SP HP離子柱純化后的蛋白，6.濃縮結(jié)果，M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白MarkerA.The wild-type BtDHX36 colony PCR identification results,M.DS5000 DNA Marker,1.Colony PCR results;B.Identification results of wild-type BtDHX36 recombinant plasmid by EcoRⅠ and XhoⅠ double digestion,M.DS5000 DNA Marker,1.Double digestion products;C.Induced expression and purification results of wild-type BtDHX36 protein,1.Bacterial crushing precipitate,2.Bacterial crushing supernatant,3.Ni-NTA column eluent,4.Protein without sumo tag,5.His Trap SP HP ion column purified protein,6.Concentration result,M.Standard protein Marker圖2 野生型BtDHX36表達(dá)載體鑒定及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化Fig.2 Identification of wild-type BtDHX36 expression vector and induced expression and purification of protein

2.1.2 BtDHX36突變體表達(dá)載體的鑒定及蛋白純化結(jié)果 BtDHX36突變體表達(dá)載體的鑒定及蛋白純化結(jié)果見圖3。

A.BtDHX36突變體菌落PCR鑒定結(jié)果，M.DS5000 DNA Marker；B.BtDHX36突變體重組質(zhì)粒的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，M.DS5000 DNA Marker；C.突變體濃縮結(jié)果，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1～4.分別代表突變體BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A和BtDHX36Y862AA.PCR identification results of BtDHX36 mutant colonies,M is DS5000 DNA Marker;B.BtDHX36 mutant recombinant plasmid identified by EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ double digestion results,M is DS5000 DNA Marker;C.Mutant concentration results,M is the standard protein Marker;1-4.Results of mutant BtDHX36R63AI65A,BtDHX36Y69A,BtDHX36K76AN77AK78A,BtDHX36Y862A,respectively圖3 BtDHX36突變體表達(dá)載體鑒定及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化Fig.3 Identification of BtDHX36 mutant expression vector and induced expression and purification of protein

4種BtDHX36突變體表達(dá)載體經(jīng)菌落PCR鑒定，均獲得了與野生型BtDHX36一致的結(jié)果(圖3-A)。挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)與野生型BtDHX36長度一樣(2.8 kb)的片段(圖3-B)。4種BtDHX36突變體經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)純化后，均獲得與野生型一致的純化結(jié)果，并得到純度大于95%的BtDHX36突變體蛋白(圖3-C)。

2.2 野生型BtDHX36解旋酶體外最佳底物結(jié)合條件的確定

由圖4-A可知，當(dāng)KCl濃度為50 mmol/L時(shí)，野生型BtDHX36解旋酶與16nt-ssDNA底物的平衡解離常數(shù)Kd值最小，為(16.2±0.1) nmol/L，表明此時(shí)蛋白與底物親和力最強(qiáng)；由圖4-B可以看出，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，Kd值最小，因此BtDHX36結(jié)合底物的最佳反應(yīng)溫度為37 ℃；由圖4-C可知，當(dāng)MgCl2濃度為2 mmol/L時(shí)，Kd值最小，說明此時(shí)蛋白與底物親和力最強(qiáng)；由圖4-D可以看出，20 mmol/L Tris-HCl的pH過高或過低都不利于蛋白與底物的結(jié)合，當(dāng)pH為7.5時(shí)，Kd值最小。綜上可知，野生型BtDHX36與16nt-ssDNA底物的體外最佳結(jié)合條件為：KCl 50 mmol/L、MgCl22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反應(yīng)溫度37 ℃。

圖4 野生型BtDHX36解旋酶與16nt-ssDNA底物的體外最佳結(jié)合條件Fig.4 In vitro optimal binding conditions of wild-type BtDHX36 helicase and 16nt-ssDNA substrate

2.3 野生型BtDHX36及其突變體與底物結(jié)合活性的比較

從圖5-A可以看出，野生型BtDHX36蛋白、RSM區(qū)突變體蛋白(BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A、BtDHX36K76AN77AK78A)和OB域突變體蛋白(BtDHX36Y862A)均能高效結(jié)合Telomere G4底物。圖5-B顯示，野生型BtDHX36蛋白Kd值最小，為(56.5±0.4) nmol/L，表明其與底物的結(jié)合活性較突變體強(qiáng)；RSM區(qū)突變體蛋白BtDHX36R63AI65A、BtDHX36Y69A和BtDHX36K76AN77AK78A的Kd值較大，分別為(71.4±0.5)，(75.8±0.2)和(62.7±0.4) nmol/L，表明其與底物的結(jié)合活性有所下降；OB域突變體BtDHX36Y862A結(jié)合該底物的Kd值最高，達(dá)到了(87.6±0.4) nmol/L，表明OB域位點(diǎn)Y862A突變的酶蛋白對(duì)底物結(jié)合活性有較明顯影響。說明各突變位點(diǎn)均可降低酶蛋白與Telomere G4的結(jié)合活性。

2.4 野生型BtDHX36及其突變體解旋活性的比較

圖6結(jié)果顯示，野生型BtDHX36及其突變體對(duì)Telomere G4-16T均有解旋活性，但解旋比例存在差異，野生型蛋白、RSM區(qū)突變體BtDHX36K76AN77AK78A和OB域突變體BtDHX36Y862A的解旋比例接近80%，RSM區(qū)突變體BtDHX36R63AI65A和BtDHX36Y69A的解旋比例相對(duì)較低，分別為63%和51%。就解旋速率來講，野生型BtDHX36、OB域突變體BtDHX36Y862A和RSM區(qū)突變體BtDHX36K76AN77AK78A的解旋速率常數(shù)均在0.40～0.50 s-1，差異不明顯；RSM區(qū)突變體BtDHX36R63AI65A和BtDHX36Y69A的解旋速率在0.10～0.22 s-1，較野生型下降明顯，表明這些位點(diǎn)的突變嚴(yán)重影響了BtDHX36蛋白的解旋速率。從以上結(jié)果可以看出，OB域突變對(duì)蛋白解旋影響不大，但RSM區(qū)不同位點(diǎn)的突變能不同程度地影響蛋白解旋的比例和速率，其中RSM區(qū)位點(diǎn)R63AI65A突變與Y69A突變的酶蛋白既影響了解旋比例又影響了解旋速率，表明這些位點(diǎn)在Telomere G4-16T底物解旋方面發(fā)揮著重要作用。

A.與底物結(jié)合比例；B.與底物結(jié)合的Kd值A(chǔ).Binding fraction on Telomere G4 substrate;B.Kd value on substrate圖5 野生型BtDHX36及其突變體與Telomere G4底物結(jié)合活性的比較Fig.5 Comparison of wild-type BtDHX36 and its mutants with Telomere G4 substrates binding activity

A.解旋動(dòng)力學(xué)曲線；B.解旋速率常數(shù)A.Unbinding kinetic curves;B.Reaction rate constant圖6 野生型BtDHX36及其突變體蛋白對(duì)Telomere G4-16T解旋活性的比較Fig.6 Comparison of the unbinding activity of wild-type BtDHX36 and its mutant proteins on Telomere G4-16T

3 討 論

Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，果蠅DHX36(DmDH-X36)的RSM區(qū)是特異性識(shí)別G4結(jié)構(gòu)的重要部位。Srinivansan等[30]研究表明，RSM區(qū)不僅起到與G4結(jié)構(gòu)親和的作用，而且還能促進(jìn)RNA雙鏈和RNA-G4結(jié)構(gòu)的重塑。BtDHX36與人類DHX36的序列同源性為91%，且研究表明，不同物種DHX36解旋酶的N端RSM區(qū)高度保守[31]，這說明RSM區(qū)在不同物種間可能發(fā)揮相似的生物學(xué)功能，且這種功能是細(xì)胞生存所必需的。本試驗(yàn)比較了野生型BtDHX36與其突變體蛋白對(duì)Telomere G4-16T底物解旋活性的差異，發(fā)現(xiàn)相較于OB域氨基酸的突變，RSM區(qū)氨基酸突變對(duì)蛋白解旋Telomere G4-16T底物的影響更大，且RSM區(qū)位點(diǎn)R63AI65A突變與Y69A突變的酶蛋白均能在解旋比例和速率兩方面影響解旋活性。這預(yù)示著在生物體內(nèi)，BtDHX36解旋酶可能更傾向于在富含G4結(jié)構(gòu)的端粒附近發(fā)揮生物學(xué)功能，且N端的RSM區(qū)在這種功能中起著無可替代的作用。

FA是一種根據(jù)熒光偏振原理研究生物大分子和核酸互作的一種手段，該方法具有靈敏性高、檢測(cè)濃度低等優(yōu)點(diǎn)[32-33]。本研究采用FA法，首先確定了BtDHX36與16nt-ssDNA結(jié)合的最適條件為KCl 50 mmol/L、MgCl22 mmol/L、20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5、反應(yīng)溫度37 ℃；在此基礎(chǔ)上檢測(cè)了野生型BtDHX36及其突變體對(duì)Telomere G4底物的結(jié)合活性差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各突變體酶蛋白與Telomere G4的結(jié)合活性均低于野生型酶蛋白。FRET技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，能在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)-核酸間相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究。本研究利用FRET技術(shù)分析了野生型BtDHX36及其突變體對(duì)Telomere G4-16T解旋活性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OB域Y862A突變對(duì)酶蛋白的解旋活性無明顯影響，說明該位點(diǎn)可能不直接參與BtDHX36對(duì)含有G4結(jié)構(gòu)底物的解旋活動(dòng)；RSM區(qū)R63AI65A和Y69A突變均對(duì)酶蛋白的解旋活性有明顯影響，降低了酶蛋白解旋含有G4結(jié)構(gòu)底物的比例和速率，說明這2個(gè)位點(diǎn)是參與蛋白解旋G4結(jié)構(gòu)的重要位點(diǎn)。