劉 潔，王丹丹，陳 芳，谷建鋒，王 兆，趙曉娥，馬保華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

近年來，隨著一系列太空探測(cè)計(jì)劃的實(shí)施和發(fā)展，空間科學(xué)研究成為各國(guó)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈的領(lǐng)域。隨著載人飛行器的誕生，空間飛行對(duì)機(jī)體的影響，尤其是對(duì)生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育的影響是值得關(guān)注和研究的課題[1-2]。在空間胚胎發(fā)育研究中，由于空間的微重力條件，胚胎培養(yǎng)必須采用密閉培養(yǎng)的方式進(jìn)行[3]。密閉培養(yǎng)體系須在培養(yǎng)前對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行一次性充氣，胚胎發(fā)育的氧氣來源完全依賴于密閉培養(yǎng)體系[4]。因此，適宜的充氣時(shí)間對(duì)密閉胚胎的培養(yǎng)至關(guān)重要。

本試驗(yàn)在前期對(duì)小鼠4細(xì)胞胚胎研究的基礎(chǔ)上[5]，使用氣體為體積分?jǐn)?shù)5% O2、5% CO2、90% N2的標(biāo)準(zhǔn)氣對(duì)胚胎培養(yǎng)液持續(xù)充氣不同時(shí)間后，進(jìn)行小鼠4細(xì)胞胚胎密閉培養(yǎng)，通過檢測(cè)密閉培養(yǎng)過程中胚胎過氧化物產(chǎn)生和缺氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factors-1α,HIF-1α)累積的情況，以及對(duì)囊胚發(fā)育率、孵化率及囊胚總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定適宜于小鼠早期胚胎密閉培養(yǎng)的培養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)氣充氣時(shí)間，為空間環(huán)境下哺乳動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康普通級(jí)昆明系小鼠(Musmusculus)，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)室溫度18～22 ℃，07:00-20:00日光燈人工光照，20:00-07:00黑暗，自由采食、飲水。在雌鼠體質(zhì)量達(dá)到25 g左右、雄鼠體質(zhì)量達(dá)到35 g左右時(shí)用于試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG),寧波第二激素廠產(chǎn)品；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；兔源多克隆HIF-1α抗體和2′7′-二氯二氫熒光素二乙酯(2′7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFDA)，英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、鏈霉菌抗生物素過氧化物酶、DAB顯色試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；免疫染色固定液、免疫染色封閉液、免疫染色一抗稀釋液、免疫染色二抗稀釋液、抗熒光淬滅封片劑，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；高純標(biāo)準(zhǔn)氣(氣體組成為體積分?jǐn)?shù)5% O2、5% CO2、90% N2)，北京龍輝京城氣體有限公司產(chǎn)品；體視顯微鏡(SZ61)和數(shù)碼倒置熒光顯微鏡(IX71-FL/RC)，日本Olympus公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(HD-1360)，北京東聯(lián)哈爾濱儀器公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(FORMA 3111)，美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；超純水儀(UPT-1)，成都超純水科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 液體配制 胚胎操作液：添加體積分?jǐn)?shù)5% FBS的改良杜氏磷酸鹽緩沖液(modified Dulbecco’s phosphate buffer solution，mDPBS)。胚胎培養(yǎng)液：添加體積分?jǐn)?shù)10% FBS的CZB液。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠超數(shù)排卵處理及胚胎采集 小鼠超數(shù)排卵處理及胚胎采集參照劉潔[3]的方法進(jìn)行，具體操作如下：選擇陰道口黏膜輕微紅腫，陰道口緊閉、潔凈，陰道內(nèi)壁為粉紅色且濕潤(rùn)的雌性小鼠，于超數(shù)排卵當(dāng)天(第0天)16:00每只小鼠腹腔注射PMSG 10 IU，48 h后(第2天)腹腔注射hCG 10 IU，隨即將雌鼠與單籠飼養(yǎng)的雄鼠合籠(雌雄比例1∶1)，次日(第3天)上午07:00觀察其陰門栓形成情況，有陰門栓形成者為假定受孕母鼠，用于胚胎采集。第4天晚23:00，頸椎脫臼法處死假定受孕母鼠，無菌采集輸卵管，在盛有胚胎操作液的表面皿內(nèi)，用無菌注射針頭撕裂輸卵管，收集4細(xì)胞胚胎，用新鮮胚胎操作液進(jìn)行胚胎凈化處理和形態(tài)質(zhì)量鑒定后，挑選形態(tài)質(zhì)量合格者用于體外培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2.2 胚胎培養(yǎng) 胚胎培養(yǎng)參照谷建鋒等[5]的方法進(jìn)行，具體操作如下。

(1)胚胎常規(guī)微滴培養(yǎng)。每個(gè)培養(yǎng)液微滴體積為100 μL，于胚胎培養(yǎng)前在35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)用胚胎培養(yǎng)液制作微滴，上覆礦物油，置入CO2培養(yǎng)箱中預(yù)平衡2 h，培養(yǎng)前將50枚胚胎移入微滴，置入飽和濕度、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在胚胎培養(yǎng)的12,36,60和84 h取樣，備檢。

(2)胚胎密閉培養(yǎng)。在胚胎密閉培養(yǎng)前，用100 mL無菌玻璃瓶裝40 mL培養(yǎng)液，將高純標(biāo)準(zhǔn)氣通入胚胎培養(yǎng)液底部進(jìn)行緩慢充氣，減壓氣體與培養(yǎng)液之間的連接管道上用氣體細(xì)菌濾器二次過濾除菌，充氣速度以每分鐘形成180～200個(gè)連續(xù)小氣泡為度。各密閉培養(yǎng)組培養(yǎng)液充氣時(shí)間分別為30,60,90,120,150,180和240 min，充氣后的培養(yǎng)液立即用于胚胎密閉培養(yǎng)。使用200 μL PCR管(Axygen)作為胚胎培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時(shí)先用充氣胚胎培養(yǎng)液將PCR管潤(rùn)洗3次，隨即加入200 μL充氣培養(yǎng)液，并立刻移入100枚小鼠4細(xì)胞胚胎，蓋緊PCR管蓋并快速翻轉(zhuǎn)PCR管使管口向下、浸入熔化的石蠟中并迅速離開和翻轉(zhuǎn)，對(duì)PCR管進(jìn)行石蠟封口，以保證胚胎培養(yǎng)環(huán)境的氣密和液密。將密封好的PCR管放入飽和濕度、溫度37 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)的12，36，60和84 h取樣，備檢。

1.2.3 胚胎內(nèi)氧自由基產(chǎn)生情況的檢測(cè) 利用DCFDA染色技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)胚胎中過氧化物的產(chǎn)生和積累水平。首先對(duì)各充氣時(shí)間組密閉培養(yǎng)12 h的胚胎過氧化物產(chǎn)生和累積情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性者在下一個(gè)時(shí)間點(diǎn)繼續(xù)檢測(cè)，依次向后直至檢測(cè)結(jié)果呈陰性，每個(gè)培養(yǎng)管檢測(cè)9～13枚胚胎。檢測(cè)方法參照劉潔[2]的方法進(jìn)行。操作時(shí)，打開PCR管蓋，加入含0.5% DCFDA的PBS，使DCFDA的質(zhì)量濃度為25 μg/mL，并輕輕吹打混勻，蓋上管蓋，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，取出后避光，用細(xì)胞核染液(含10 μg/mL Hoechst 33342的PBS)染核3 min，用PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察，通過比較各組胚胎中綠色熒光的強(qiáng)弱，判斷胚胎中氧自由基產(chǎn)生和積累的情況。

1.2.4 HIF-1α蛋白表達(dá)的檢測(cè) 首先對(duì)各組培養(yǎng)84 h的胚胎HIF-1α蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性者繼續(xù)檢測(cè)上一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，直至檢測(cè)結(jié)果呈陰性時(shí)為止，每個(gè)培養(yǎng)管檢測(cè)9～13枚胚胎。檢測(cè)方法參照劉潔[3]的方法進(jìn)行。檢測(cè)時(shí)，對(duì)停止培養(yǎng)的胚胎室溫固定1 h，免疫染色封閉液中封閉1 h，兔源多克隆HIF-1α抗體中(1∶1 000倍稀釋)4 ℃孵育16 h，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育10 min，鏈霉素抗生物素過氧化物酶室溫處理10 min，最后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理，進(jìn)行上述每一步操作前均需使用PBS清洗胚胎3次。將顯色處理后的胚胎逐個(gè)置于載玻片上，用梯度酒精(體積分?jǐn)?shù)依次為70%，80%，95%，100%)脫水干燥，二甲苯透明，封片。于顯微鏡下觀察胚胎的著色情況，有明顯的棕色著色即表示其為HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性胚胎。

1.2.5 囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組胚胎培養(yǎng)至84 h停止培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況并拍照。計(jì)算各組囊胚發(fā)育率和孵化率，并進(jìn)行囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，先將各組囊胚在室溫條件下固定30 min，然后隨機(jī)選取9～13枚胚胎，將胚胎移入細(xì)胞核染液中處理5 min，PBS洗3次×5 min后，置于載玻片上，滴加抗熒光淬滅封片劑；加蓋蓋玻片并用指甲油封片，壓片置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)胚胎總細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 為減小試驗(yàn)誤差，各組試驗(yàn)均重復(fù)3次。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行組間差異顯著性的單因素方差分析，結(jié)果用“平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠胚胎培養(yǎng)過程中過氧化物的檢測(cè)

常規(guī)微滴培養(yǎng)小鼠胚胎各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的過氧化物檢測(cè)結(jié)果均為陰性。密閉培養(yǎng)小鼠胚胎過氧化物的檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，培養(yǎng)液充氣30,60,90,120,150 min的密閉培養(yǎng)組胚胎，體外培養(yǎng)12 h時(shí)過氧化物檢測(cè)為陰性(未見綠色熒光)；充氣180 min組和240 min組胚胎密閉培養(yǎng)12 h時(shí)，經(jīng)DCFDA處理后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，且充氣240 min組更為明顯,繼續(xù)培養(yǎng)至36 h時(shí)兩組均未觀察到綠色熒光。

2.2 小鼠胚胎培養(yǎng)過程中HIF-1α蛋白表達(dá)的檢測(cè)

充氣培養(yǎng)液密閉培養(yǎng)胚胎和常規(guī)微滴培養(yǎng)胚胎免疫組化染色結(jié)果見圖2。

A.藍(lán)色亮點(diǎn)為Hoechst 33342所染的細(xì)胞核；B.DCFDA染色結(jié)果，更強(qiáng)的綠色熒光代表更多過氧化物在胚胎內(nèi)產(chǎn)生1.在微滴中培養(yǎng)12 h的胚胎(對(duì)照組); 2～8.分別為培養(yǎng)液充氣30,60,90,120,150,180,240 min 組密閉培養(yǎng)12 h的胚胎；9,10.分別為培養(yǎng)液充氣180和240 min組密閉培養(yǎng)36 h的胚胎。標(biāo)尺=20 μmA.Bluish fluorescence shows nucleus stained by Hoechst 33342;B.Peroxide is labeled with DCFDA,stronger green fluorescence means more ROS was produced in embryo.1.Embryos cultured for 12 h in microdrop (control);2-8.Embryos cultured for 12 h in sealed-culture groups pretreated with reference gas for 30,60,90,120,150,180 and 240 min,respectively;9 and 10.Embryos cultured for 36 h in sealed-culture groups pretreated with reference gas for 180 and 240 min.Scale bar=20 μm圖1 體外充氣密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)小鼠早期胚胎中過氧化物水平的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 ROS levels of early-stage embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups in vitro

A.常規(guī)微滴培養(yǎng)84 h的胚胎(對(duì)照組)；B1.充氣30 min密閉培養(yǎng)12 h的胚胎；B2.充氣60 min密閉培養(yǎng)36 h的胚胎；B3.充氣90 min密閉培養(yǎng)60 h的胚胎；B4-B7.分別為充氣120,150,180,240 min密閉培養(yǎng)84 h的胚胎HIF-1α檢測(cè)陽(yáng)性的胚胎細(xì)胞顯棕色，陰性胚胎無特異性著色;標(biāo)尺=20 μmA.Embryo cultured for 84 h in microdrop group (control);B1.Embryo cultured for 12 h in the sealed-culture group pretreated with reference gas for 30 min;B2.Embryo cultured for 36 h in the sealed-culture group pretreated with reference gas for 60 min;B3.Embryo cultured for 60 h in the sealed-culture group pretreated with reference gas for 90 min;B4-B7.Embryos cultured for 84 h in the groups pretreated reference gas for 120,150,180,and 240 min,respectively.Embryos that tested positive for HIF-1α were brown,and those negative had no obvious staining;scale bar=20 μm圖2 體外充氣密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)小鼠早期胚胎中HIF-1α蛋白累積情況的檢測(cè)結(jié)果(DAB顯色)Fig.2 Accumulation of HIF-1α protein in early-stage embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups in vitro (staining by DAB)

如圖2-A所示，常規(guī)微滴培養(yǎng)組小鼠胚胎在培養(yǎng)過程中均未檢測(cè)到HIF-1α蛋白累積。用充氣30 min的培養(yǎng)液進(jìn)行密閉培養(yǎng)的小鼠胚胎，在培養(yǎng)到12 h時(shí)胚胎細(xì)胞即表現(xiàn)明顯的淺棕色團(tuán)塊狀著色，表明HIF-1α已經(jīng)開始出現(xiàn)積累(圖2-B1)；充氣60 min組的胚胎在密閉培養(yǎng)36 h時(shí)檢測(cè)到HIF-1α的積累(圖2-B2)；充氣90 min組的胚胎在培養(yǎng)60 h時(shí)檢測(cè)到HIF-1α的積累(圖2-B3)；充氣120 min組的胚胎在培養(yǎng)84 h時(shí)檢測(cè)到HIF-1α的積累(圖2-B4)；充氣150，180，240 min組的胚胎，直至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)都未檢測(cè)到HIF-1α的積累。

體外培養(yǎng)12和36 h的胚胎，由于細(xì)胞數(shù)較少，免疫組化染色處理后，胚胎呈不規(guī)則凹多邊形(圖2-B1,B2)。

2.3 小鼠胚胎體外發(fā)育情況及囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

充氣密閉培養(yǎng)及常規(guī)微滴培養(yǎng)84 h后，小鼠胚胎體外發(fā)育及囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(圖3，表1)顯示，充氣30和60 min密閉培養(yǎng)的小鼠胚胎囊胚發(fā)育率很低，有卵裂球碎裂、縮小等現(xiàn)象；充氣120 min以上各組均可獲得較高的囊胚發(fā)育率，且各組間均無顯著差異(P>0.05)；充氣30～90 min密閉培養(yǎng)各組和常規(guī)微滴培養(yǎng)組的囊胚孵化率均顯著低于充氣120～240 min密閉培養(yǎng)各組(P<0.05)，其中充氣90 min密閉培養(yǎng)組的囊胚發(fā)育率亦顯著低于充氣120～240 min密閉培養(yǎng)各組(P<0.05)。小鼠胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，微滴培養(yǎng)組和充氣120，150，180 min密閉培養(yǎng)組胚胎的平均總細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組(P<0.05)。

A.常規(guī)微滴培養(yǎng)84 h的胚胎對(duì)照組；B-H.分別為充氣30,60,90,120,150,180,240 min密閉培養(yǎng)組胚胎。標(biāo)尺=50 μmA.Embryo cultured for 84 h in microdrop (control);B-H.Embryos in sealed-culture groups pretreated with reference gas for 30,60,90,120,150,180,and 240 min,respectively.Scale bar=50 μm圖3 小鼠4細(xì)胞胚胎體外充氣密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)84 h后獲得的囊胚Fig.3 Blastocysts obtained 84 h after mouse 4 cell stage embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups in vitro

表1 小鼠4細(xì)胞胚胎體外密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)84 h的發(fā)育情況及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Developmental rates and total cell numbers of mouse 4 cell embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups for 84 h

3 討 論

前人對(duì)倉(cāng)鼠、家兔、獼猴等動(dòng)物的研究結(jié)果顯示，子宮與輸卵管腔中的氧氣體積分?jǐn)?shù)為2%～9%[6]。研究證明，當(dāng)胚胎培養(yǎng)體系中的氧氣體積分?jǐn)?shù)較低(約5%)時(shí)，其囊胚發(fā)育率高于在大氣氧環(huán)境下(約20%)培養(yǎng)的胚胎[7-11]，究其原因，可能與氧自由基對(duì)胚胎的損傷有關(guān)[12-14]。然而，胚胎培養(yǎng)環(huán)境中的氧含量過低，又會(huì)導(dǎo)致胚胎缺氧，同樣對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響[4]。在進(jìn)行小鼠胚胎密閉培養(yǎng)時(shí)，胚胎發(fā)育所需的氧氣完全依賴于密閉培養(yǎng)體系，而對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行充氣處理的時(shí)間直接影響了培養(yǎng)液中的溶氧量。因此，篩選出適宜的培養(yǎng)液充氣時(shí)間，對(duì)于建立和完善小鼠胚胎密閉培養(yǎng)體系十分重要。

本研究中對(duì)小鼠胚胎氧自由基產(chǎn)生的檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)液充氣時(shí)間≤150 min時(shí)，胚胎在培養(yǎng)12，36，60，84 h時(shí)均未檢測(cè)到氧自由基的累積；培養(yǎng)液充氣180和240 min，胚胎密閉培養(yǎng)12 h時(shí)檢測(cè)到了過氧化物，且充氣240 min組更為明顯，提示充氣時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使培養(yǎng)液的溶氧量超過胚胎正常發(fā)育的氧消耗量，導(dǎo)致胚胎在培養(yǎng)過程中積累過量的活性氧基團(tuán)。在對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)，盡管充氣時(shí)間在120～240 min的密閉培養(yǎng)各組在囊胚發(fā)育率和孵化率上差異不顯著(P>0.05)，但培養(yǎng)液充氣240 min的密閉培養(yǎng)組囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著低于充氣120～180 min的密閉培養(yǎng)組。這一結(jié)果說明在小鼠胚胎培養(yǎng)初期，胚胎中過多的氧自由基在一定程度上會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響。同時(shí)，在本研究中，微滴培養(yǎng)組的囊胚孵化率顯著低于培養(yǎng)液充氣120～240 min的密閉培養(yǎng)組，可能與微滴培養(yǎng)時(shí)胚胎始終暴露在相對(duì)較高的氧環(huán)境中有關(guān)。研究者對(duì)倉(cāng)鼠、家兔、獼猴等動(dòng)物的研究結(jié)果顯示，子宮腔的氧氣濃度略低于輸卵管，表明在生理?xiàng)l件下，胚胎發(fā)育原本就經(jīng)歷著一個(gè)從相對(duì)高氧到相對(duì)低氧的過程[15]。有研究者認(rèn)為，將早期胚胎持續(xù)暴露于20%的高氧環(huán)境下，會(huì)出現(xiàn)囊胚發(fā)育率降低、胚胎形態(tài)差異過大以及植入異常等現(xiàn)象[16]。此外，在微滴培養(yǎng)組的胚胎中并未檢測(cè)到過氧化物的積累，提示當(dāng)充氣時(shí)間超過180 min后，溶解在充氣培養(yǎng)液中的氧氣總量可能已經(jīng)超過了在大氣環(huán)境下液體中的溶氧量。

HIF-1由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠穩(wěn)定表達(dá)，并在氧充足的環(huán)境中快速被泛素化降解。但在缺氧環(huán)境下，HIF-1的泛素化降解通路受阻，導(dǎo)致其在細(xì)胞中出現(xiàn)累積[17-19]。因此，HIF-1α能夠作為檢驗(yàn)細(xì)胞是否缺氧的指標(biāo)物。在密閉培養(yǎng)體系中，胚胎發(fā)育所需的氧氣由充氣培養(yǎng)液提供，在培養(yǎng)過程中無法向體系中補(bǔ)充氧氣。因此在對(duì)培養(yǎng)液充氣處理時(shí)，需要保證培養(yǎng)液中充入了足夠支持細(xì)胞發(fā)育到囊胚的氧氣。在對(duì)各組小鼠胚胎HIF-1α蛋白檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液充氣時(shí)間為150,180和240 min的密閉培養(yǎng)組中，培養(yǎng)84 h后胚胎中HIF-1α蛋白檢測(cè)仍呈陰性，提示這3組的胚胎在發(fā)育過程中處于不缺氧的狀態(tài)，因此培養(yǎng)終止時(shí)在胚胎中未檢測(cè)到HIF-1α[20]。培養(yǎng)液充氣120 min的密閉培養(yǎng)組胚胎的HIF-1α累積在60 h時(shí)檢測(cè)為陰性，在84 h時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性，提示在此密閉培養(yǎng)組中，培養(yǎng)液中的溶氧量能支持胚胎發(fā)育60 h以上；進(jìn)一步對(duì)該組的囊胚發(fā)育率、孵化率和囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定，認(rèn)為雖然該組胚胎在培養(yǎng)末期發(fā)生了缺氧現(xiàn)象，但并未對(duì)胚胎發(fā)育造成可見的不利影響。培養(yǎng)液充氣90，60，30 min組胚胎在密閉培養(yǎng)早期即出現(xiàn)HIF-1α積累，表明胚胎在早期發(fā)育過程中即處于缺氧環(huán)境，HIF-1翻譯后降解受阻[21]。有研究報(bào)道，在缺氧條件下，HIF-1α調(diào)高p53的表達(dá)量并誘導(dǎo)合成p21，以抑制細(xì)胞周期依賴激酶的活性，同時(shí)使細(xì)胞周期停留在G1期，促使細(xì)胞凋亡[22]，因此導(dǎo)致了培養(yǎng)液充氣30，60，90 min組密閉培養(yǎng)的部分胚胎出現(xiàn)發(fā)育停滯和退化的現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

在使用氣體組成為體積分?jǐn)?shù)5% O2、5% CO2和90% N2標(biāo)準(zhǔn)氣的密閉培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)液充氣時(shí)間為120～150 min時(shí)，密閉培養(yǎng)體系中的胚胎在發(fā)育早期不會(huì)受到過多的活性氧損傷，在發(fā)育的后期也可盡量減少缺氧對(duì)胚胎發(fā)育的不利影響。據(jù)此認(rèn)為，充氣120～150 min的胚胎密閉培養(yǎng)條件可較好地支持小鼠4細(xì)胞胚胎體外發(fā)育至囊胚和孵化囊胚階段。