劉現(xiàn)穩(wěn),朱 舟,劉成龍,張立群,韋韓忠,唐 維

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

獼猴桃富含多種氨基酸、礦質(zhì)元素,營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特,被譽(yù)為“水果之王”[1]。獼猴桃大多屬于雌雄異株植物,不同品種獼猴桃的開花時(shí)間變異較大。開花時(shí)間的差異對(duì)獼猴桃生產(chǎn)、獼猴桃屬物種分化有著重要的影響。植物開花時(shí)期的差異一直是研究的熱點(diǎn)。獼猴桃開花時(shí)間調(diào)控的分子機(jī)制依然模糊。因此深入研究獼猴桃開花相關(guān)基因的功能以及分子調(diào)控機(jī)制有重要的生物學(xué)意義。

對(duì)模式植物擬南芥開花時(shí)間的研究表明:春化作用、溫度、赤霉素、自主途徑、光周期途徑相互作用共同控制開花[2]。在植物開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,LEAFY(LFY)基因是開花信號(hào)途徑中的最關(guān)鍵整合子,在花原基起始的早期表達(dá),并激活花分生組織特征基因和花器官形態(tài)特征基因APETALA1(AP1)和CAULIFLOWER(CAL)的表達(dá),從而決定了原基的花分生組織屬性。LFY基因不僅是植物成花途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因,而且是激活下游花分生組織屬性基因和花器官?zèng)Q定基因的關(guān)鍵調(diào)控因子[3]。

LFY基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,在進(jìn)化過程中比較保守,都含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,且內(nèi)含子的位置極為保守。LFY的同源基因編碼的氨基酸序列中一般具有5’端脯氨酸富集區(qū)、中央酸性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。擬南芥中LFY還含有與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)表明LFY基因具有轉(zhuǎn)錄因子的特征[4]。在許多有花和無(wú)花植物中LFY同源基因已經(jīng)被分離克隆,功能研究表明其在植物生殖、生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用[5]。但是在獼猴桃中LFY同源基因的研究并不多。

本文以毛花獼猴桃‘華特’為實(shí)驗(yàn)材料,從花芽組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將擬南芥LFY基因在‘紅陽(yáng)’獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[6-7](http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)中進(jìn)行比對(duì),得到了獼猴桃的LFY基因同源序列,并以‘華特’獼猴桃cDNA為模板,用特異性引物擴(kuò)增出目的基因,命名為AeLFY-like1。測(cè)序結(jié)果表明AeLFY-like1基因序列全長(zhǎng)2 432 bp,有3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子,含有1 095 bp的完整的編碼框,編碼364個(gè)氨基酸。3個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為379、353、363 bp,2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為420、917 bp。毛花獼猴桃LFY-like蛋白與中華獼猴桃LFY-like蛋白有99.73%同源性,僅有部分SNP的差異。其基因結(jié)構(gòu)與許多已克隆的大部分植物的LFY基因結(jié)構(gòu)相似,顯示出LFY基因的序列結(jié)構(gòu)在不同物種間進(jìn)化上的保守性[8]。本研究通過克隆毛花獼猴桃LFY同源基因,為從分子水平上了解獼猴桃成花機(jī)理提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)為獼猴桃的物種分化、進(jìn)化研究提供序列信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 載體、菌株和植物材料

克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物表達(dá)載體pART27-MCS-GFP(帶有CaMV35S植物組成型啟動(dòng)子和GFP標(biāo)簽蛋白)由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV2260由實(shí)驗(yàn)室保存;煙草(Nicotianabenthamiana)、毛花獼猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)植株種植于合肥工業(yè)大學(xué)屯溪路校區(qū)人工氣候培養(yǎng)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Pfu高保真DNA聚合酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物RNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于愛必夢(mèng)生物科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)于TaKaRa公司;引物設(shè)計(jì)采用Primmer Premmier5.0軟件,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;實(shí)驗(yàn)樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 序列分析及氨基酸序列同源性分析

運(yùn)用 NCBI的BLAST在線軟件程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行檢索;用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTP在線比對(duì)、查找AeLFY蛋白序列的同源蛋白序列,并應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)分析。用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 ‘華特’獼猴桃AeLFY-like1基因克隆

使用植物RNA提取試劑盒從‘華特’獼猴桃花芽材料中提取總RNA,取1 μg總RNA為模板,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA?！A特’AeLFY-like1基因序列特異性引物AeLFY-like1 F/R見表1所列,用于對(duì)其編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、純化,然后與pEASY-Blunt Simple Cloning Vector克隆載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR鑒定,將陽(yáng)性克隆送測(cè)序。

1.2.3AeLFY-like1-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述測(cè)序陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。酶切片斷進(jìn)行膠回收,然后與雙酶切回收的pART27-MCS-GFP表達(dá)載體片斷進(jìn)行連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化,并進(jìn)行菌落PCR鑒定,質(zhì)粒酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV2260,獲得陽(yáng)性克隆后,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 基因煙草瞬時(shí)表達(dá)與亞細(xì)胞定位

本文采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法。將帶有構(gòu)建正確的AeLFY-like1-GFP表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在含有利福平(Rif)和壯觀霉素(Spec)的LB培養(yǎng)板28 ℃培養(yǎng)2 d,挑取單克隆于2 mL LB/Rif/Spec培養(yǎng)液中,28 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)。吸取300 μL菌液于2.7 mL LB/Rif/Spec培養(yǎng)液中,28 ℃培養(yǎng)5 h。然后將菌液4 000 r/min離心6 min后重懸于3 mL誘導(dǎo)緩沖液Ⅰ(IM培養(yǎng)液、200 mmol/L乙酰丁香酮、25 mg/mL壯觀霉素)中,28 ℃培養(yǎng)5～8 h。將菌液4 000 r/min離心6 min收集細(xì)胞,以2 mL誘導(dǎo)緩沖液Ⅱ(50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、蒸餾水、200 mmol/L乙酰丁香酮)重懸細(xì)胞,測(cè)定、調(diào)節(jié)OD600=0.5,注射于4周左右大小煙草植株的葉片中。36 h后即可撕取注射區(qū)域葉片的表皮細(xì)胞,經(jīng)4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察,并確定AeLFY-like1蛋白在細(xì)胞中的定位。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采集毛華獼猴桃根、莖、葉、成花、花芽材料,分別提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,獼猴桃肌動(dòng)蛋白(actin)基因作為內(nèi)參,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。該反應(yīng)在Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR總體系含cDNA 30 ng、SYBR ? Green PCR Master 5.0 μL、定量引物AeLFYqF/R各 0.2 μL,序列信息見表1所列,用 ddH2O補(bǔ)足到 10.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 10 min,95 ℃15 s,60 ℃ 1 min,39個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及溶解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛花獼猴桃LFY同源基因的克隆

使用毛花獼猴桃花芽組織材料提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板,使用特異性引物擴(kuò)增得到獼猴桃LFY同源基因如圖1所示,擴(kuò)增條帶約1 100 bp,實(shí)際測(cè)序結(jié)果顯示AeLFY-like1基因?yàn)? 095 bp。電泳結(jié)果與目的片段大小一致。圖1中,M為DNA Marker;L1為陰性對(duì)照;L2為目的片段。

2.2 毛花獼猴桃AeLFY-like1基因結(jié)構(gòu)分析

AeLFY-like1基因序列全長(zhǎng)2 432 bp,有3個(gè)外顯子與2個(gè)內(nèi)含子,含有1 095 bp的完整的編碼框,編碼364個(gè)氨基酸?；蚪Y(jié)構(gòu)如圖2所示,3個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為379、353、363 bp,2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為420、917 bp。

AeLFY-like1基因編碼的氨基酸序列也具有5’端脯氨酸富集區(qū)、中央酸性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,這些功能結(jié)構(gòu)域與其轉(zhuǎn)錄因子功能相對(duì)應(yīng)。獼猴桃LFY基因結(jié)構(gòu)與大部分植物基因結(jié)構(gòu)一致,顯示出其在不同物種進(jìn)化過程中的保守性。

2.3 AeLFY-like1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將AeLFY-like1基因編碼的氨基酸序列與多種植物的LFY蛋白同源序列進(jìn)行比對(duì),運(yùn)用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)化樹信息如圖3所示。圖3中,Ae為毛花獼猴桃;Ac為中華獼猴桃;Cs為野茶樹;Cc為山核桃;Ps為豌豆;Gs為野生大豆;Gm為大豆;Sl為番茄;Nt為煙草;Lc為荔枝;Pc為黃連木;Vv為葡萄;At為擬南芥;Os為水稻;Zm為玉米;分支點(diǎn)的數(shù)字為Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比;標(biāo)尺代表每一位點(diǎn)氨基酸替換率。毛花獼猴桃和中華獼猴桃這2個(gè)獼猴桃品種的LFY同源蛋白序列以100%的支持率聚在同一枝上,表明在不同品種獼猴桃中,LFY基因高度保守。

獼猴桃科與茶科都屬于五椏果亞綱、杜鵑花目。由圖3可知,獼猴桃與茶樹同源性為95%,而與單子葉植物植物水稻、玉米親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果一致。在該系統(tǒng)進(jìn)化樹中,傳統(tǒng)分類學(xué)上親緣關(guān)系較近物種都聚集在一起。預(yù)測(cè)在分類學(xué)研究中,LFY蛋白是一個(gè)可以利用的分子標(biāo)記。

2.4 AeLFY-like1基因組織差異性分析

采集毛花獼猴桃的根、莖、葉、成花和花芽組織作為樣品材料,提取總RNA,以獼猴桃肌動(dòng)蛋白(actin)基因作為內(nèi)參,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同組織的AeLFY-like1基因的表達(dá)水平,如圖4所示。

組織圖4 AeLFY-like1基因在毛花獼猴桃不同組織和器官中的表達(dá)

由圖4可知,qRT-PCR結(jié)果表明AeLFY-like1基因在毛花獼猴桃不同組織和器官中表達(dá)量有明顯差異。AeLFY-like1基因主要在早期花芽組織中大量表達(dá),而在成花中表達(dá)量很低,其表達(dá)量與葉片組織中相近。在根與莖中AeLFY-like1基因基本不表達(dá)。推測(cè)在花芽發(fā)育過程中,AeLFY-like1基因的表達(dá)量逐漸減少,在發(fā)育到成花階段時(shí),AeLFY-like1基因表達(dá)量已經(jīng)下降到較低的水平。符合LFY同源基因在花原基起始的早期表達(dá)的特征。AeLFY-like1基因在促進(jìn)獼猴桃由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)階段、花序分化以及起始花器官發(fā)育發(fā)揮重要作用。

2.5 AeLFY-like1基因的亞細(xì)胞定位

本文將帶有AeLFY-like1-GFP表達(dá)載體的農(nóng)桿菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、誘導(dǎo)后注射煙草葉片,36 h后撕取煙草葉片表皮細(xì)胞,經(jīng)DAPI染料染色、制片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,檢測(cè)GFP與DAPI熒光信號(hào),進(jìn)行AeLFY-like1基因的亞細(xì)胞定位,其結(jié)果如圖5所示。圖5a為明場(chǎng)下觀察到的煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu);圖5b為488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下GFP發(fā)射出的綠色熒光;圖5c為358 nm激發(fā)波長(zhǎng)下DAPI發(fā)射出的藍(lán)色熒光;圖5d為Merge圖像,可以觀察到綠色熒光與藍(lán)色熒光的重疊。

圖5 AeLFY-like1基因亞細(xì)胞定位

從圖5可以看出,AeLFY-GFP融合蛋白定位在細(xì)胞核中,推測(cè)出AeLFY蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)植物開花。

3 結(jié) 論

本研究通過同源序列比對(duì)分析從毛花獼猴桃‘華特’基因組中克隆出LFY同源基因,命名為AeLFY-like1?；蛐蛄腥L(zhǎng)為2 432 bp,有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,含有1 095 bp的完整的編碼框,編碼364個(gè)氨基酸,與中華獼猴桃LFY蛋白同源性達(dá)到99.73%。同源性分析表明毛花獼猴桃的AeLFY-like1基因與其他植物L(fēng)FY基因在核酸和蛋白質(zhì)水平上十分相似,在N端和C端都含有高度保守的區(qū)域。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)獼猴桃LFY基因與茶科植物親緣關(guān)系最近,與單子葉植物水稻、玉米等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種間LFY基因編碼的蛋白質(zhì)也具有較高的同源性,表明其在不同物種中具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[9]。

亞細(xì)胞定位顯示AeLFY-like1表達(dá)產(chǎn)物定位在細(xì)胞核,與LFY基因家族的轉(zhuǎn)錄因子功能、亞細(xì)胞定位特征相一致。推測(cè)其在獼猴桃開花調(diào)控中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能,調(diào)控開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)獼猴桃植株開花。

組織差異性分析表明AeLFY-like1基因在花芽組織中的表達(dá)量最高。LFY基因家族在花原基起始早期表達(dá),是植物開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的早期基因。AeLFY-like1基因在促進(jìn)獼猴桃由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)階段、花序分化以及起始花器官發(fā)育發(fā)揮重要作用[10-11]。獼猴桃AeLFY-like1基因誘導(dǎo)植物成花過程以及調(diào)控植物開花時(shí)間的分子機(jī)理還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

本研究通過克隆毛花獼猴桃的LFY同源基因,分析了基因特征與同源性關(guān)系,初步鑒定了基因的功能,為獼猴桃的系統(tǒng)進(jìn)化研究、發(fā)育分析提供了一定的理論依據(jù)。