趙 靜,汪惠麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

民以食為天,食以安為先,食品安全是關(guān)系到國計(jì)民生的頭等大事。近年來,國內(nèi)一些地方接連出現(xiàn)的鎘大米事件引起衛(wèi)生部門等的高度重視。環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及食品加工等過程均可能引起食品鎘污染[1]。鎘(Cadmium,Cd)是一種蓄積性的重金屬元素,即便在很低的濃度水平上,也會對人體和其他生物造成危害[2]。鎘可通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積,進(jìn)而引起人體各種急性、慢性毒性作用,鎘積累能造成結(jié)締組織損傷、生殖系統(tǒng)功能障礙、腎損傷、致畸和致癌等危害,包括影響兒童生長和智力發(fā)育[3-5]。鎘可以破壞機(jī)體血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),損傷學(xué)習(xí)記憶[6],但其具體神經(jīng)毒性機(jī)制尚不清楚。

PC12細(xì)胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤,是一個(gè)常用的神經(jīng)細(xì)胞株,膜上有NGF受體,NGF誘導(dǎo)后長出神經(jīng)突起,因此廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究[7]。

需氧細(xì)胞在代謝過程中會產(chǎn)生一系列活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。鎘作為過渡金屬可通過Fenton反應(yīng)將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基,作用于質(zhì)膜,造成膜的脂質(zhì)過氧化。同時(shí),鎘可以直接與抗氧化酶中的金屬相互作用,抑制酶的活力,使自由基的清除受到影響,從而加重細(xì)胞的氧化損傷[8]。

本文研究選擇形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能方面均具有神經(jīng)元特性的PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?用不同濃度氯化鎘處理PC12細(xì)胞,觀察細(xì)胞存活率、神經(jīng)發(fā)生和細(xì)胞內(nèi)ROS變化,以探究鎘的神經(jīng)毒性效應(yīng)和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器耗材

5%的二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(Thermo Fisher Scientific 公司)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(康寧,96孔板、24孔板、d=90 mm的大皿)、細(xì)胞培養(yǎng)蓋片(Corolina Science and Math)、載玻片、熒光顯微鏡、高壓滅菌鍋、pH計(jì)(雷磁PHSJ-3F)、恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)(CT14RD)、酶標(biāo)儀、移液槍、水平搖床(TanonTs-92)。

1.1.2 主要試劑

Poly-L-lysine hydrobromide(Sigma-aldrich)、DMEM(Thermo、Fisher-Gibco)、抗熒光淬滅劑(Solarbio-s2100)、氯化鎘(阿拉丁化學(xué)試劑)、二甲基亞砜(國藥試劑)、MTT(碧云天生物技術(shù)公司)、FBS(浙江天杭生物科技有限公司)、HS(維森特生物技術(shù)(南京)有限公司)、PBST緩沖液、胰蛋白酶-EDTA消化液(KGY0012,KeyGEN BioTECH)、ROS活性氧試劑盒、抗熒光淬滅劑、NGF。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中使用的PC12細(xì)胞購于上海中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。從液氮中取出凍存的細(xì)胞置于37 ℃水浴鍋解凍,3 000 r/min離心3 min,棄上清,用1 mL已預(yù)熱的含有10%胎牛血清和1% PS的高糖DMEM培養(yǎng)基懸浮,并吸取細(xì)胞溶液均勻加在含有8 mL培養(yǎng)基的大皿里,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代前預(yù)熱培養(yǎng)基、1×PBS和0.25%胰蛋白酶,并將培養(yǎng)皿和操作臺照紫外30 min。棄掉培養(yǎng)基,用3 mL 1×PBS洗1次,再用1 mL胰蛋白酶消化(放于37 ℃培養(yǎng)箱消化1 min)。待消化完全后,加入3 mL培養(yǎng)基混勻結(jié)束消化過程,并將細(xì)胞溶液分裝到2個(gè)離心管,3 000 r/min離心3 min。充分去除上清液,加入1 mL事先在培養(yǎng)箱中預(yù)熱過的培養(yǎng)基DMEM制備懸浮液,連續(xù)吹打10次(盡量避免氣泡)混勻,按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤肱囵B(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。大皿、24孔板和96孔板分別為9 mL、500 μL和100 μL體系。

1.2.2 MTT比色法

MTT法又稱MTT比色法,是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)色結(jié)晶甲瓚,并沉積在細(xì)胞中。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀在540 nm或720 nm波長處測定其吸光值(OD值),可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,及OD值在0～0.7區(qū)間的可信度比較高。該方法已廣泛用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。MTT溶液由MTT粉和1×PBS配置,并使用0.22 μm無菌濾膜過濾,質(zhì)量濃度為5 mg/mL,配置和保藏過程要避光。取處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞,利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),6×103個(gè)/孔的濃度接種于96孔板,過夜培養(yǎng);進(jìn)行不同濃度的鎘(0.1、0.5、2.5 μmol/L)處理,培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)基,每個(gè)孔加入20 μL MTT溶液,操作過程避光,并將培養(yǎng)皿用錫紙包裹避光,放置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO,搖床上低速震蕩15 min,然后用酶標(biāo)儀在540 nm波長下測吸光值。每個(gè)處理重復(fù)6個(gè)孔,取各孔均值,計(jì)算細(xì)胞存活率,其公式如下:

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD均值/空白對照組OD均值)×100%。

1.2.3 ROS檢測

活性氧檢測試劑盒(reactive oxygen species assay kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能透過細(xì)胞膜,細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光即可得知細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

24孔板中加入事先清洗并照過紫外的細(xì)胞爬片,每孔加入300 μL PLL包被過夜,PLL回收,用無菌水清洗24孔板,每孔500 μL,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min孵育后吸出,重復(fù)3次。將細(xì)胞接種于24孔板過夜,鎘處理后培養(yǎng)24 h,吸出培養(yǎng)基,每孔加入500 μL已經(jīng)預(yù)熱的含ROS的DMEM(V(ROS)∶V(DMEM)=1∶1 000,未加PS和FBS),該操作避光,混勻后用錫紙覆蓋放置于培養(yǎng)箱中孵化30 min。吸出DMEM,用已滅菌的1×PBS洗3次,每次換槍頭,加入已預(yù)熱的無血清的DMEM覆蓋,以紫外光340 nm波長激發(fā),在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞分化檢測

本實(shí)驗(yàn)以未分化PC12細(xì)胞為模型,細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)兩代后即可用于實(shí)驗(yàn)。24孔板中加入事先清洗并照過紫外的細(xì)胞爬片。每孔加入300 μL PLL包被過夜,PLL回收,用無菌水清洗24孔板,每孔500 μL,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min孵育后吸出,重復(fù)3次。將未分化PC12細(xì)胞接種于24孔板,增殖培養(yǎng)過夜至細(xì)胞密度約為30%,用含有50 ng/mL NGF和鎘的分化培養(yǎng)基全換液,鎘處理的濃度為0.1、0.5 μmol/L。每隔24 h用同上的分化培養(yǎng)基進(jìn)行半換液,至培養(yǎng)96 h。用熒光顯微鏡在20倍率下進(jìn)行拍片,并用Image J software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)突起總長度、一級分支數(shù)目、二級分支數(shù)目,并進(jìn)行sholl analysis。每組至少統(tǒng)計(jì)20個(gè)細(xì)胞。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析組間差異均采用T-test和One-way ANOVA分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎘處理對細(xì)胞存活率的影響

PC12細(xì)胞是一個(gè)常用的神經(jīng)細(xì)胞株,為了研究鎘的神經(jīng)毒性,實(shí)驗(yàn)采用PC12細(xì)胞作為細(xì)胞模型。鎘對PC12細(xì)胞存活率的影響如圖1所示,由圖1可知,與空白對照組(鎘濃度為0)相比,0.1 μmol/L的鎘處理24 h對細(xì)胞存活率沒有顯著影響;0.5 μmol/L 和2.5 μmol/L的鎘處理PC12細(xì)胞24 h分別降低細(xì)胞存活率11.6%和43.4%;鎘在一定濃度范圍內(nèi),對PC12細(xì)胞存活率的降低呈劑量依賴性。

圖1 鎘對PC12細(xì)胞存活率的影響

2.2 不同濃度鎘處理對細(xì)胞分化的影響

由于未分化PC12細(xì)胞在NGF誘導(dǎo)后長出神經(jīng)突起,因此本實(shí)驗(yàn)用鎘處理未分化PC12細(xì)胞以研究鎘對神經(jīng)元分化即神經(jīng)發(fā)生的影響。由于鎘處理劑量為2.5 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率不足對照組的80%,因此分化實(shí)驗(yàn)選擇較低濃度的鎘處理。鎘對PC12細(xì)胞突起總長度的影響如圖2所示,由圖2可知,0.1、0.5 μmol/L鎘暴露組的細(xì)胞突起總長度比對照組的分別減少22.7%和48.9%。

圖2 鎘對PC12細(xì)胞突起總長度的影響

鎘對PC12細(xì)胞一級分支數(shù)量的影響如圖3 所示,由圖3可知,0.1、0.5 μmol/L 鎘暴露組的細(xì)胞一級分支數(shù)量比對照組的分別降低9%和26.6%。鎘對PC12細(xì)胞二級分支數(shù)量的影響如圖4所示,由圖4可知,0.1、0.5 μmol/L鎘暴露組的二級分支數(shù)量比對照組的分別減少13.3%和82.9%。鎘處理對交點(diǎn)數(shù)的影響如圖5所示,由圖5可知,鎘暴露后突起末端距離胞體中心點(diǎn)距離減小;且隨著暴露劑量的增大,同一距離下的交點(diǎn)數(shù)隨著鎘濃度增加而逐漸減小,此指標(biāo)主要綜合反映突起長度和數(shù)量。綜上,鎘對神經(jīng)發(fā)生有明顯抑制作用,且呈劑量依賴性。

圖3 鎘對PC12細(xì)胞一級分支數(shù)量的影響

圖4 鎘對PC12細(xì)胞二級分支數(shù)量的影響

圖5 鎘對交點(diǎn)數(shù)的影響

2.3 鎘對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

鎘對PC12細(xì)胞ROS水平的影響如圖6所示,圖6a～圖6c分別為0(空白對照組)、0.1 、0.5 μmol/L鎘暴露后細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光信號。由圖6可知,隨著鎘暴露劑量的增加,細(xì)胞內(nèi)ROS熒光信號越強(qiáng);更多的PC12細(xì)胞出現(xiàn)突起消失,細(xì)胞變成圓球狀。以上分析表明鎘能導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)活性氧增加,導(dǎo)致氧化損傷,且氧化損傷呈劑量依賴性。

圖6 鎘對PC12細(xì)胞ROS水平的影響

3 結(jié) 論

近年來鎘的毒理學(xué)作用及其機(jī)制研究,已取得重要進(jìn)展,但關(guān)于鎘的神經(jīng)毒性及其機(jī)制尚不清楚[9]。由于食品鎘污染而食源性攝入鎘,或者空氣鎘污染而通過呼吸道吸入鎘,鎘可以進(jìn)入人體并在人體積累,因此關(guān)于鎘慢性暴露導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷問題亟待解決。因?yàn)檫^去研究認(rèn)為鎘不能通過血腦屏障,所以隨后的鎘神經(jīng)毒性一直被忽視。近年來研究發(fā)現(xiàn)鎘能夠損傷并通過發(fā)育期大鼠的血腦屏障[10],因此探究鎘暴露對大腦神經(jīng)元毒性作用對研究鎘的神經(jīng)毒性具有重要的意義。本文直接對PC12細(xì)胞鎘暴露,以探究大腦中神經(jīng)元鎘暴露后可能出現(xiàn)的損傷情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鎘的毒性很大,PC12細(xì)胞暴露0.5 μmol/L鎘24 h,細(xì)胞存活率顯著下降,且毒性作用呈劑量依賴性。因?yàn)榄h(huán)境中鎘暴露通常是長時(shí)間低劑量的慢性暴露,所以后續(xù)的分化和活性氧檢測實(shí)驗(yàn)選擇了更低濃度的鎘暴露。0.1 μmol/L鎘暴露24 h不影響PC12細(xì)胞存活率,但出現(xiàn)明顯氧化損傷和神經(jīng)發(fā)生抑制。鎘暴露引起細(xì)胞內(nèi)ROS增加可能是引起細(xì)胞損傷的內(nèi)在機(jī)制,這是由于伴隨著細(xì)胞內(nèi)ROS上升出現(xiàn)突起消失、存活率降低現(xiàn)象。

綜上所述,鎘神經(jīng)毒性作用呈劑量依賴性,鎘可能通過減少神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞突起、引起氧化損傷而損傷神經(jīng)系統(tǒng)。本文只探究了鎘可能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷情況,應(yīng)該在離體神經(jīng)元細(xì)胞和在體基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證,并且進(jìn)一步探究鎘導(dǎo)致?lián)p傷的機(jī)制。本文結(jié)論對于鎘導(dǎo)致的損傷修復(fù)有一定的借鑒意義,根據(jù)鎘導(dǎo)致氧化損傷現(xiàn)象,嘗試?yán)每寡趸烊划a(chǎn)物修復(fù)鎘造成的損傷。