任志杰，李倩，孫鈺佳，孔冬冬，劉良玉，侯聰聰，李樂(lè)攻

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物基因資源與低碳環(huán)境生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

0 引言

【研究意義】干熱風(fēng)或水分脅迫是阻礙作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量形成的重要逆境因子之一，作物在干熱風(fēng)或水分等非生物脅迫下，進(jìn)化出一套完整而復(fù)雜的應(yīng)對(duì)機(jī)制，Ca2+被認(rèn)為是啟動(dòng)這類復(fù)雜反應(yīng)的通用第二信使或干旱逆境因子，例如：滲透勢(shì)的改變、水分的變化、溫度的變化、機(jī)械刺激都會(huì)引起細(xì)胞鈣離子濃度的特征性反應(yīng)，這種變化啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)生理生化過(guò)程，傳遞和放大干旱逆境信號(hào)的作用[1-3]，因此，篩選鑒定水稻中感受干熱風(fēng)的鈣離子通道及相關(guān)基因不僅對(duì)研究水稻傳導(dǎo)干熱風(fēng)信號(hào)具有重要的生物學(xué)意義，同時(shí)也為培育耐干熱風(fēng)水稻的分子育種提供重要的基因資源和遺傳材料?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】盡管早期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的基因家族，如：谷氨酸受體類通道（glutamate receptor-like，GLRs）、環(huán)核苷酸門控離子通道（cyclic nucleotide-gated channels，CNGCs）和膜聯(lián)蛋白類通道（Annexins）等[4-5]，也發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)水分進(jìn)出細(xì)胞的水通道家族（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）[6]等。但是，上述通道本身沒(méi)有受體功能，也不能對(duì)細(xì)胞的水分變化做出直接的應(yīng)對(duì)反應(yīng)[4-5]。2014年HOU等[7]首次發(fā)現(xiàn)，模式植物擬南芥中存在一類受體類型的鈣離子通道，它們屬于 DUF221家族且廣泛存在于真核生物中，可以被滲透勢(shì)或機(jī)械門控激活，能夠感應(yīng)滲透/機(jī)械力的變化，這一結(jié)論后續(xù)被多個(gè)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)生物學(xué)研究者證實(shí)[8-10]，另外還發(fā)現(xiàn)果蠅的鈣離子透過(guò)性脅迫反應(yīng)陽(yáng)離子通道家族（CSCs）感應(yīng)粗粒食物介導(dǎo)適口性的功能[11]，也發(fā)現(xiàn)小鼠的CSCs感應(yīng)聲波變化，缺失導(dǎo)致嚴(yán)重耳聾[12]，該家族基因的功能成為神經(jīng)生物學(xué)研究者追逐的熱點(diǎn)。擬南芥兼具水分受體感應(yīng)和通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能的CSCs家族的發(fā)現(xiàn)，為分析水稻的水分變化感應(yīng)分子提供了線索和良好的研究基礎(chǔ)[7]。干熱風(fēng)是一種高溫、低濕并伴有一定風(fēng)力的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害，不定時(shí)發(fā)生，難以預(yù)測(cè)，嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量[13-16]，在水稻的揚(yáng)花期偶遇干旱或高溫也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的急劇下降，這類干熱風(fēng)逆境的共同之處就是嚴(yán)重影響作物細(xì)胞，尤其是防護(hù)性能不強(qiáng)的生殖細(xì)胞，造成細(xì)胞快速失水而導(dǎo)致花粉發(fā)育異常、結(jié)實(shí)率降低[17-25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】作物的CSCs家族研究剛剛起步，水稻中CSCs的同源基因有11個(gè)，其中只有OsCSC4被證明異源表達(dá)在擬南芥中具有類似AtCSC1的功能[26]。但是，到目前為止，水稻響應(yīng)干熱風(fēng)脅迫的受體或通道均未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，也未發(fā)現(xiàn)水稻生殖細(xì)胞感應(yīng)干熱風(fēng)的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)理。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究分析水稻CSC11的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性及調(diào)控活性的分子結(jié)構(gòu)域，獲得oscsc11突變體并分析干熱風(fēng)條件下的表型變化，這一分子功能的發(fā)現(xiàn)為理解作物響應(yīng)干熱風(fēng)傷害的分子機(jī)理研究提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：水稻（OryzasativaL.）品種為日本晴（Nipponbare），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所路鐵剛研究員課題組提供，擬南芥生態(tài)型Col-0；菌株：大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)細(xì)胞Trans10購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株GV3101由首都師范大學(xué)李樂(lè)攻教授實(shí)驗(yàn)室保存；動(dòng)物材料：雌性成熟非洲爪蟾（Xenopuslaevis）購(gòu)自美國(guó)Nasco公司?；蚯贸蛔凅w和GUS表達(dá)株系的遺傳轉(zhuǎn)化工作在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院路鐵鋼研究員課題組水稻轉(zhuǎn)化平臺(tái)完成，遺傳材料的擴(kuò)繁和表型分析工作在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊實(shí)驗(yàn)基地和北京首都師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓完成。

1.2 水稻總RNA提取和熒光定量PCR分析

分別取野生型日本晴水稻不同組織，用Trizol法（賽默飛）提取總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript ?II（賽默飛）體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（具體步驟參見(jiàn)說(shuō)明書）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物見(jiàn)表1，以水稻LOC_Os03g50885為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，根據(jù)公式2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[27]。

1.3 載體的構(gòu)建和水稻轉(zhuǎn)基因植株的獲得

依據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù) Rice Genome annotation project（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）提供的序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增OsCSC11啟動(dòng)子序列上下游引物，提取野生型日本晴水稻基因組DNA作為PCR模板，設(shè)計(jì)ProCSC11-F和ProCSC11-R引物（表1），將OsCSC11（LOC_Os03g04450）的啟動(dòng)子1 435 bp（1.435 kb upstream of the start codon）與β-glucuronidase（GUS） reporter融合構(gòu)建到p1300-GN表達(dá)載體中。水稻cDNA作為模板擴(kuò)增OsCSC11全長(zhǎng)CDS序列，將其構(gòu)建到pE3242-GFP載體中，OsCSC11-GFP融合表達(dá)重組載體用于蛋白亞細(xì)胞定位。利用 CRISPR/Cas9基因編輯方法，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)引物 Target-F/Target-R引物（表1），構(gòu)建pCAMBIA1300-Cas9基因敲除載體。采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的方法[28]，獲得GUS表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系以及OsCSC11敲除突變體株系。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 GUS報(bào)告基因活性分析

在不同發(fā)育時(shí)期，取穩(wěn)定表達(dá)ProCSC11-GUS轉(zhuǎn)基因植物的不同組織進(jìn)行GUS染色觀察，方法參考文獻(xiàn)[29]，使用萊卡倒置顯微鏡和蔡司體式顯微鏡SV11對(duì)染色組織進(jìn)行拍照記錄。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

利用聚乙二醇（PEG4000）介導(dǎo)的擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)重組蛋白 35S::OsCSC11-GFP和對(duì)照組 35S::GFP的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞，具體方法參考文獻(xiàn)[30]。通過(guò)基因槍法[31]將上述質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在激發(fā)光為488 nm的蔡司780激光共聚焦顯微鏡下，對(duì)表達(dá)GFP熒光蛋白的細(xì)胞進(jìn)行拍照記錄。

1.6 雙電極電壓鉗技術(shù)方法

將全長(zhǎng)OsCSC11和刪除 N端 156氨基酸后（OsCSC11ΔTM1-3）的基因序列分別構(gòu)建到蛙卵表達(dá)載體pGEMHE和pGEMHE-GFP中，以線性化的質(zhì)粒為模板，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 Ambion mMESSAGE mMACHINE T7（購(gòu)自賽默飛）進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成成熟的 cRNA（Capped-RNA），并稀釋到 500 ng·μL-1的濃度備用。通過(guò)顯微注射向每個(gè)蛙卵中注射32 nL的cRNA，對(duì)照組注射等體積的RNase-free ddH2O，在 ND96（96 mmol·L-1NaCl、2 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2、1.8 mmol·L-1CaCl2和 10 mmol·L-1HEPES/NaOH, pH7.4）溶液中，18℃孵育至少 48 h待蛋白表達(dá)。采用TEV200A放大器、Digidata 1440 A/D數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Dagan公司）和pCLAMP10.4軟件（Axon Instruments）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄[32-34]，記錄時(shí)電極液為3 mol·L-1KCl。刺激激活的通道活性分析所用的基礎(chǔ)溶液為 ND96，高滲溶液為 ND96+500 mmol·L-1Mannitol，電壓鉗制在-100 mV；組成型離子通道活性分析時(shí)在基礎(chǔ)灌流液（2 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2和 10 mmol·L-1MES-Tris，pH5.6）中分別加入 20 mmol·L-1的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+進(jìn)行離子選擇性分析，用 D-甘露醇調(diào)節(jié)滲透勢(shì)至 220 mosmol·kg-1，電壓從-140 mV遞增至+40 mV，每次遞增10 mV，鉗制電位設(shè)置為0，電壓刺激持續(xù)時(shí)間設(shè)置為2 s。

1.7 花粉粒的活力測(cè)定

在授粉前，將成熟期穎花的雄蕊取下，且每種材料取3株獨(dú)立的株系進(jìn)行I2-KI染色，在蔡司體式顯微鏡SV11下進(jìn)行觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 OsCSC11蛋白序列是具有特異結(jié)構(gòu)域（Motifs）的獨(dú)立亞家族

鈣離子透過(guò)性脅迫反應(yīng)陽(yáng)離子通道家族（CSCs）是近年發(fā)現(xiàn)的一種類似動(dòng)物瞬時(shí)受體電位通道（transient receptor potential channels，TRPs）的兼具受體和通道雙重功能的離子通道[7]，它們廣泛存在于真核生物中。模式植物擬南芥有 15個(gè)成員，水稻有11個(gè)成員，經(jīng)序列比對(duì)（圖1），擬南芥和水稻的CSCs成員分別歸屬4個(gè)亞家族，其中，水稻OsCSC11和擬南芥AtCSC15同屬較為獨(dú)立的第四亞家族，與其他成員的同源性較低。

蛋白質(zhì)序列分析顯示 CSCs家族蛋白具有 8—10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrance domain，TM），并且都具有DUF221功能結(jié)構(gòu)域，是一類典型的膜蛋白。將OsCSC11與已報(bào)道的5個(gè)擬南芥CSCs成員進(jìn)行蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，它們同源性較高，在N端3個(gè)TMs（包含 Loop的區(qū)域）、第六至第九 TMs（不包含 Loop區(qū)）和 DUF221功能區(qū)都很保守，推測(cè)OsCSC11很可能與擬南芥CSCs具有類似的功能。而OsCSC11在第三個(gè)TM和第九個(gè)TM之間有較特異的7個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖2），這些較獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在進(jìn)化過(guò)程中可能賦予了 OsCSC11不同于其他同源蛋白的特有功能，縱觀全長(zhǎng)蛋白序列，這一家族特有的前 3個(gè)TMs，可能是這種受體類通道的受體結(jié)構(gòu)域，而其余的部分則非常類似典型的 6個(gè)跨膜離子通道，如：Shaker-type鉀離子通道或CNGCs等。

2.2 OsCSC11在葉片和花藥中表達(dá)量相對(duì)較高

基因的組織或時(shí)空表達(dá)模式與其功能直接相關(guān)。取野生型水稻不同組織的 cDNA作為模板，利用qRT-PCR方法檢測(cè)OsCSC11的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因在葉片、葉鞘和雄蕊中表達(dá)量相對(duì)較高，在根、莖以及不同發(fā)育時(shí)期的穗組織中相對(duì)較低（圖 3-A）。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)ProCSC11-GUS轉(zhuǎn)基因植物的不同組織進(jìn)行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsCSC11的啟動(dòng)子在幼苗地上部分、葉片，以及雄蕊的花粉粒中活性較高（圖 3-B—圖3-E），表明OsCSC11很可能主要在葉片和雄蕊發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.3 OsCSC11定位于細(xì)胞質(zhì)膜

蛋白的亞細(xì)胞定位有助于理解和分析 OsCSC11的功能。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒35S-OsCSC11-GFP和對(duì)照質(zhì)粒35S-GFP通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體及洋蔥表皮細(xì)胞。在488 nm激發(fā)光下檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)OsCSC11-GFP融合蛋白的原生質(zhì)體在細(xì)胞質(zhì)膜上有較強(qiáng)的GFP熒光信號(hào)，表達(dá)對(duì)照組質(zhì)粒的原生質(zhì)體中，熒光信號(hào)在胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)膜上均可檢測(cè)到（圖 4-A）；同時(shí)，洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的結(jié)果也顯示OsCSC11-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)膜，而表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒的洋蔥表皮細(xì)胞在胞質(zhì)和質(zhì)膜上也可檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖4-B），表明OsCSC11是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜蛋白。

2.4 OsCSC11介導(dǎo)干旱誘導(dǎo)的鈣信號(hào)

2.4.1 OsCSC11全長(zhǎng)處于靜息狀態(tài)被高滲透溶液激活 已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)CSCs家族一些成員是被高滲脅迫/機(jī)械刺激激活的離子通道，那么OsCSC11是否也有類似的通道活性呢？通過(guò)顯微注射，將 OsCSC11-GFP融合蛋白表達(dá)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞質(zhì)膜上有特異的GFP熒光信號(hào)（圖5-D），與其在植物細(xì)胞中的質(zhì)膜定位結(jié)果一致。利用雙電極電壓鉗方法，在蛙卵表達(dá)系統(tǒng)中驗(yàn)證OsCSC11的電生理功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)OsCSC11的蛙卵在外加高滲溶液時(shí)（模擬機(jī)械刺激/膜擾動(dòng)）產(chǎn)生了（4.27±1.50）μA的內(nèi)向電流，而對(duì)照組注射水的蛙卵在相同條件下只能檢測(cè)到（0.19±0.02）μA的背景電流（圖5-A和圖5-B），這表明OsCSC11全長(zhǎng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性可以被高滲溶液激活。

2.4.2 刪除 N端跨膜域/受體結(jié)構(gòu)域的 OsCSC11ΔTM1-3具有組成性的鈣通道活性 結(jié)合研究較多的典型離子通道（CNGC、GLR家族）的蛋白結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步對(duì) OsCSC11蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn) OsCSC11蛋白在TM3和TM9之間有7個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域（圖2），為了進(jìn)一步探索OsCSC11蛋白作為離子通道的特性，將OsCSC11的N端3個(gè)跨膜域（第1—156個(gè)氨基酸）刪除并命名為 OsCSC11ΔTM1-3，將OsCSC11ΔTM1-3和OsCSC11ΔTM1-3-GFP的cRNA注射表達(dá)在卵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)刪除N端3個(gè)跨膜域的OsCSC11ΔTM1-3仍然在質(zhì)膜上表達(dá)（圖 5-D），電生理試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在未施加高滲溶液刺激的情況下，表達(dá)了 OsCSC11ΔTM1-3的蛙卵就可以記錄到非常明顯的組成型鈣離子內(nèi)流信號(hào)（3 μA），而對(duì)照組和OsCSC11全長(zhǎng)蛋白在同樣條件下未檢測(cè)到明顯的電流（0.2 μA背景電流）（圖5-C—圖5-E）。對(duì)OsCSC11ΔTM1-3的離子選擇性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) OsCSC11ΔTM1-3可以同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)二價(jià)鈣離子和鎂離子，對(duì)一價(jià)金屬離子鈉離子和鉀離子沒(méi)有明顯的轉(zhuǎn)運(yùn)活性（圖5-F）。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsCSC11ΔTM1-3具有鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)特性，而全長(zhǎng)OsCSC11蛋白在無(wú)高滲脅迫刺激時(shí)檢測(cè)不到活性，由此推測(cè) OsCSC11的 TM1-3結(jié)構(gòu)域有可能具有受體功能，感應(yīng)高滲或機(jī)械脅迫，而 OsCSC11ΔTM1-3形成具有鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的通道，當(dāng)TM1-3結(jié)構(gòu)域感受到外界高滲或機(jī)械刺激時(shí)，引起通道結(jié)構(gòu)域的激活，介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.5 利用 CRISPR/Cas9基因編輯方法獲得 oscsc11突變體

體外功能研究表明 OsCSC11蛋白可以直接響應(yīng)高滲刺激介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)流，為了進(jìn)一步探究該蛋白在植物體內(nèi)的生理功能，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建OsCSC11功能缺失的突變體。在OsCSC11序列的N端選取一段靶序列作為編輯位點(diǎn)（圖6-A），構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化法獲得了不同編輯類型的水稻突變體，利用靶點(diǎn)檢測(cè)引物CSC11-CRI-F/ CSC11-CRI-R（表1）對(duì)Target上下游區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在84株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗中有53株Target靶點(diǎn)位置發(fā)生了編輯。經(jīng)過(guò)T2代分離鑒定獲得了2種類型突變體株系，分別命名為oscsc11-1和oscsc11-2，其中oscsc11-1在ORF第178—179 bp之間插入一個(gè)堿基T，也就是在野生型的第 179 bp處插入了堿基 T；oscsc11-2在ORF第178 bp（G）和第179 bp（T）處缺失了2個(gè)堿基。2種突變體的等位基因均造成移碼突變、提前終止。

2.6 oscsc11突變體雄蕊的耐干旱性顯著下降

2.6.1oscsc11突變體花藥彎曲與干熱風(fēng)誘導(dǎo)的表型類似 體外電生理學(xué)分析證明了 OsCSC11是高滲脅迫（模擬干旱或機(jī)械刺激）激活的離子通道，那么OsCSC11在水稻中生理功能如何？進(jìn)一步對(duì)已獲得的oscsc11突變體進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)oscsc11突變體在苗期和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期與野生型水稻沒(méi)有明顯差異，而在生殖生長(zhǎng)期時(shí)oscsc11突變體雄蕊不能正常頂出穎殼（圖7-A和圖7-B），剝開(kāi)穎殼后發(fā)現(xiàn)oscsc11突變體的雄蕊發(fā)育異常，花藥較野生型短，且部分出現(xiàn)一定程度的卷曲，花藥顏色與野生型相比較淺（圖 7-C和圖 7-D）。通常在水稻抽穗開(kāi)花期較多為高溫多風(fēng)天氣，野生型水稻的花藥偶遇長(zhǎng)時(shí)間的干熱風(fēng)刺激時(shí)，雄蕊的花藥組織會(huì)因脫水導(dǎo)致卷曲現(xiàn)象，oscsc11突變體雄蕊的表型與野生型雄蕊長(zhǎng)時(shí)間受到干熱風(fēng)刺激脫水之后的表型類似。為了更進(jìn)一步確定OsCSC11的功能與干熱風(fēng)造成的雄蕊脫水相關(guān)，對(duì)野生型和突變體的花粉含水量進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果顯示，oscsc11突變體花粉的含水量（花粉細(xì)胞中水組分的質(zhì)量占比）只有（12.87±2.2）%，而野生型含水量為（39.97±2.4）%，相比野生型，突變體的含水量下降了60%以上，表明oscsc11可能會(huì)對(duì)干熱風(fēng)表現(xiàn)出更敏感的表型。結(jié)合前面體外功能研究證實(shí)OsCSC11在高滲刺激（模擬干旱脫水環(huán)境）下通道活性可以被激活，傳導(dǎo)高滲刺激或模擬干旱信號(hào)的結(jié)果，可以推測(cè)：在水稻抽穗期，oscsc11突變體很可能是由于失去感受外界干熱風(fēng)的脅迫信號(hào)和離子通道功能，使得突變體不能將此信號(hào)有效地傳遞，導(dǎo)致生理應(yīng)對(duì)反應(yīng)缺失，因而出現(xiàn)干旱脫水的表型，由于生殖細(xì)胞更為敏感，花藥的表型變化更加劇烈。

2.6.2oscsc11突變體的花粉出現(xiàn)較多敗育現(xiàn)象 表達(dá)模式分析的結(jié)果表明OsCSC11在花粉中的表達(dá)量極高，且oscsc11突變體花粉含水量低，進(jìn)一步對(duì)野生型和oscsc11突變體的花粉進(jìn)行了花粉活力的測(cè)定。野生型、oscsc11-1和oscsc11-2各取3株不同的植株，每株至少取3個(gè)穎花的花粉，通過(guò)I2-KI染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型的花粉有 95%以上能被I2-KI很好著色，而oscsc11-1和oscsc11-2突變體只有30%—40%的花粉能被I2-KI著色（圖8-A和圖8-B），通過(guò)對(duì)花粉形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，突變體的花粉呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)（圖8-A）。同時(shí)，oscsc11的花粉含水量比野生型減少了60%以上（圖7-E），表明oscsc11-1和oscsc11-2突變體的花粉活力降低以及形態(tài)異?？赡苁怯捎趪?yán)重脫水造成的。電生理結(jié)果表明OsCSC11是一類高滲刺激（模擬干旱脫水環(huán)境）激活的鈣離子通道，鈣離子在花粉的發(fā)育以及延伸過(guò)程中具有非常重要的作用，由此推斷鈣離子在花粉發(fā)育的每一個(gè)生理過(guò)程中都有著不可替代的特殊作用，而oscsc11-1和oscsc11-2敏感表型則大多出現(xiàn)在中午水稻開(kāi)花時(shí)期，推測(cè)OsCSC11缺失導(dǎo)致植株難以感受環(huán)境干熱等不利刺激，沒(méi)有啟動(dòng)相應(yīng)的鈣離子信號(hào)和生理應(yīng)對(duì)過(guò)程，因此影響了水稻花粉正常發(fā)育。

3 討論

鈣離子作為通用的第二信使，參與了干旱、高溫、冷害和鹽害等多種非生物脅迫的逆境信號(hào)傳導(dǎo)[3-4]，鈣通道分子可以將胞外不同的逆境刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)特定的鈣信號(hào)[35-36]，進(jìn)而通過(guò)鈣信號(hào)解碼分子，如：鈣調(diào)素、CBLs、CDK、CIPKs調(diào)控相應(yīng)的生理過(guò)程[3,37]。植物的鈣信號(hào)編碼器分子與哺乳動(dòng)物產(chǎn)生鈣信號(hào)的分子類似，大致分為兩類，一類是單純的通道，如：CNGCs[38]、GLRs[37,39]等，2019年以來(lái)，人們已經(jīng)報(bào)道了3種鈣信號(hào)編碼復(fù)合體，如CNGC8/7-CNGC18-CaM2/3互作組成的分子開(kāi)關(guān)，能維持花粉管頂端的鈣波動(dòng)[33]；而CNGC2-CNGC4-CaMs互作編碼病理原初反應(yīng)的鈣信號(hào)[34]；另外CNGC15-NRT1.1組成硝酸根門控的鈣編碼器感應(yīng)硝態(tài)氮濃度的變化[40]，這些都是以 CNGCs為骨架裝配而成的鈣信號(hào)編碼器。另一類是2014年發(fā)現(xiàn)的受體類型的鈣離子通道CSCs/OSCAs，它是植物中第一個(gè)感受高滲反應(yīng)的受體類蛋白 CSCs家族[7]。同年，另外一個(gè)研究組也確認(rèn)了這一結(jié)果并將其命名為OSCAs[41]，隨后引起了結(jié)構(gòu)生物學(xué)家和動(dòng)物神經(jīng)生物學(xué)家的追逐與關(guān)注。近幾年，發(fā)現(xiàn)了擬南芥CSCs家族中的AtCSC1、AtCSC2、AtCSC8、AtCSC9和AtCSC14 5個(gè)成員，都屬于機(jī)械或牽張刺激敏感的陽(yáng)離子通道[9-10]。目前，有關(guān)水稻CSCs家族蛋白功能的研究很少，只有 OsCSC4被報(bào)道與擬南芥 CSC1具有類似的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[26]。本研究鑒定了OsCSC11的功能，明確了OsCSC11作為受體功能結(jié)構(gòu)域和通道功能結(jié)構(gòu)域的差別，發(fā)現(xiàn)了受體結(jié)構(gòu)域抑制通道本身活性的特點(diǎn)，細(xì)胞膜的牽張可以消除這種抑制作用，使處于靜息狀態(tài)的OsCSC11通道被激活，這一現(xiàn)象類似動(dòng)物TRPs蛋白[42-46]，溫度或壓力變化產(chǎn)生瞬時(shí)鈣電流或信號(hào)，將受體功能與通道功能整合到同一個(gè)分子中。這一發(fā)現(xiàn)揭示了作物受體類鈣通道產(chǎn)生或編碼鈣信號(hào)的完美分子基礎(chǔ)[47-48]，也為鈣信號(hào)編碼的研究提供了更為簡(jiǎn)潔的分子開(kāi)關(guān)模式。

另外，本研究所取得的進(jìn)展和結(jié)論為理解干熱風(fēng)造成的作物不育和減產(chǎn)提供了新的研究思路，由于干熱風(fēng)的不可預(yù)測(cè)性，它是造成小麥等農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，對(duì)開(kāi)花到乳熟期間的小麥危害極大，水稻在揚(yáng)花期偶遇干熱風(fēng)也會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。干熱風(fēng)造成的危害主要是3種物理性的逆境刺激引起，可以分解為干（即干旱）、熱（高溫）和風(fēng)（機(jī)械刺激），都影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。因此，干熱風(fēng)造成的傷害實(shí)際上是一種擾動(dòng)細(xì)胞膜的機(jī)械傷害，從現(xiàn)有的報(bào)道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物 CSCs介導(dǎo)粗粒食物的適口性[11]，哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)信號(hào)[12]，酵母、人與擬南芥和水稻的 CSCs功能類似[7,9,26]，可以被高滲溶液激活，這些特征背后的本質(zhì)功能就是傳遞機(jī)械力造成細(xì)胞膜形變效應(yīng)，也就是說(shuō)物理性刺激導(dǎo)致的任何膜的壓力或動(dòng)態(tài)變化都有可能激發(fā)CSCs蛋白的通道活性。雖然我們?cè)陔x體的條件下，只研究了模擬干旱/高滲溶液激活的OsCSC11，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的同源蛋白的功能研究和結(jié)構(gòu)解析，有理由推測(cè)OsCSC11也很可能被干熱風(fēng)，這類導(dǎo)致細(xì)胞膜型變的物理因素激活。當(dāng)然，這需要進(jìn)一步的研究將干熱風(fēng)這類混合的物理性刺激細(xì)分為干旱、高溫和機(jī)械刺激，再進(jìn)一步分辨出這三因素中其中誰(shuí)是調(diào)控 OsCSC11的主要刺激因素或者三者的綜合效應(yīng)都共同起作用。由于oscsc11突變體植株表現(xiàn)的雄蕊弱小、花藥表面蹙皺、彎曲以及花粉敗育等特征與已經(jīng)多次報(bào)導(dǎo)的水稻或小麥等作物遭遇干熱風(fēng)的傷害表型非常相似，因此，有理由相信OsCSC11的缺失阻斷了干熱風(fēng)逆境的感應(yīng)和信號(hào)傳遞，不能啟動(dòng)相應(yīng)的快速應(yīng)對(duì)機(jī)制，使水稻對(duì)抗干熱風(fēng)的能力減弱，因此，造成配子體發(fā)育異常的表型，這種干熱風(fēng)造成的快速失水現(xiàn)象與花粉成熟過(guò)程中的脫水是2個(gè)不同的生理反應(yīng)，前者是逆境刺激后的被動(dòng)過(guò)程，而后者緩慢的脫水過(guò)程屬于自發(fā)的主動(dòng)反應(yīng)，OsCSC11是否參與主動(dòng)過(guò)程的脫水反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。這一機(jī)制的揭示不僅解釋了水稻雄蕊受干熱風(fēng)傷害，導(dǎo)致減產(chǎn)的原因，也為其它更易被干熱風(fēng)危害的作物，如小麥等作物應(yīng)對(duì)不可預(yù)測(cè)的干熱風(fēng)造成的危害，提供了基因操作候選分子和研究思路。

4 結(jié)論

OsCSC11通常處于靜息狀態(tài)，可被高滲溶液激活介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，具有受體和通道雙重功能的作用方式，調(diào)控花藥水分含量和花粉發(fā)育，可能參與了水稻雄蕊應(yīng)對(duì)干熱風(fēng)的原初感應(yīng)過(guò)程。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所路鐵剛研究員課題組在水稻遺傳轉(zhuǎn)化方面給予的幫助，在此感謝。