石國良，武強(qiáng)，楊念婉，黃聰，劉萬學(xué)，錢萬強(qiáng)，萬方浩,?

1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東青島 266109；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部基因組分析實(shí)驗(yàn)室/廣東嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518120

0 引言

【研究意義】蘋果蠹蛾（Cydiapomonella）屬鱗翅目卷蛾科，寡食性害蟲，主要以幼蟲鉆蛀蘋果、梨、桃和杏等水果的果實(shí)危害，該蟲原產(chǎn)歐洲，20世紀(jì)50年代入侵我國，是我國重要的檢疫對(duì)象[1-3]。幾丁質(zhì)普遍存在于許多無脊椎動(dòng)物以及大多數(shù)真菌和藻類的細(xì)胞壁中，昆蟲幾丁質(zhì)主要存在于表皮、圍食膜和氣管等組織中，對(duì)維持外骨骼和組織的形狀和大小以及蛻皮過程的順利完成起著至關(guān)重要的作用[4-5]。昆蟲蛻皮和生長發(fā)育必須經(jīng)歷周期性去舊表皮和合成新表皮的過程，這一過程伴隨著幾丁質(zhì)的合成和降解[6]。幾丁質(zhì)代謝酶參與昆蟲表皮和圍食膜中幾丁質(zhì)的形成，在昆蟲蛻皮發(fā)育等生命活動(dòng)中具有重要的生理功能[7-10]。因此，著手于參與昆蟲幾丁質(zhì)代謝途徑的酶的研究以開發(fā)新型殺蟲劑成為研究熱點(diǎn)[11-14]，如除蟲脲是幾丁質(zhì)合成抑制劑，已經(jīng)被用作殺蟲劑廣泛使用[15]。【前人研究進(jìn)展】幾丁質(zhì)脫乙?；福╟hitin deacetylase，簡稱CDA，EC 3.5.1.41）是一種催化幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖的修飾酶，在幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[16]。根據(jù)功能域和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 CDA可分為 5大類，第 1類和第 2類都含有幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChBD）、低密度脂蛋白受體（LDLa）和催化域（CDA）3個(gè)功能域，第3類和第4類都含有催化域CDA，但其他功能域部分或全部缺失，第5類只含有CDA功能域[17-18]，各類CDA基因分布于昆蟲不同組織/器官并且在不同時(shí)期差異表達(dá)，表明其在昆蟲各發(fā)育時(shí)期發(fā)揮著不同的生理功能[19]。另外，蛻皮激素（20E）對(duì)昆蟲的發(fā)育、變態(tài)和繁殖等起著至關(guān)重要的作用，幾丁質(zhì)酶的活性也受蛻皮激素誘導(dǎo)的反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在一些鱗翅目昆蟲中，幾丁質(zhì)酶基因受到20E的影響，在家蠶（Bombyxmori）CDA2的研究中，經(jīng)蛻皮激素誘導(dǎo)后BmCDA表達(dá)量上調(diào)[20]。其中CDA2屬于第1類，在多種昆蟲中其CDA2存在兩個(gè)可變剪切轉(zhuǎn)錄本，通過RNAi技術(shù)抑制云杉卷葉蛾（Choristoneurafumiferana）[21]和美國白蛾（Hyphantriacunea）[22]幼蟲中CDA2兩個(gè)剪切體的表達(dá)后，其幼蟲的生長發(fā)育均受到抑制甚至死亡；而對(duì)中華稻蝗（Oxyachinensis）[6]CDA2的研究發(fā)現(xiàn)，該基因的兩個(gè)剪切體中只有OcCDA2a在其蛻皮過程中發(fā)揮重要作用，OcCDA2b則對(duì)其正常發(fā)育無顯著影響。【本研究切入點(diǎn)】蘋果蠹蛾作為我國重要的入侵害蟲，近年來呈現(xiàn)出快速擴(kuò)張的趨勢(shì)，對(duì)我國蘋果產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，亟需開發(fā)更加高效的防控技術(shù)。而 CDA作為幾丁質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)昆蟲的生長發(fā)育具有重要功能，是新型殺蟲劑的重要作用靶標(biāo)之一，對(duì)蘋果蠹蛾CDA2的研究有助于防控蘋果蠹蛾新型農(nóng)藥的開發(fā)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定蘋果蠹蛾CDA2的序列及其可變剪切情況，分析其基因結(jié)構(gòu)并檢測(cè)在不同發(fā)育時(shí)期、組織以及注射蛻皮激素后兩個(gè)剪切體（CpCDA2a和CpCDA2b）的表達(dá)情況，比較二者的蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，為后續(xù)篩選和開發(fā)以幾丁質(zhì)合成相關(guān)通路為靶標(biāo)的新型殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019—2020年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx

蘋果蠹蛾原始種群于2013年11月從甘肅省酒泉市果園采集，使用人工飼料在室內(nèi)飼養(yǎng)并建立穩(wěn)定種群，已連續(xù)飼養(yǎng)60余代。飼養(yǎng)溫度為（26±0.5）℃，相對(duì)濕度為（70 ±10）%，光周期為16L∶8D。

1.2 試驗(yàn)試劑

總RNA提取所需試劑為組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒，購于北京金百特生物技術(shù)有限公司；cDNA第一鏈合成所需試劑為 Hifair?Ⅲ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于上海翊圣生物科技有限公司；RT-qPCR所需試劑為Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox），購于上海翊圣生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增所需試劑為TransStart Taq DNA Polymerase、10×TransStart Taq Buffer、dNTPs，均購于TransGen Biotech；凝膠回收試劑盒購于北京天漠科技開發(fā)有限公司；克隆試劑盒pClone007 Simple Vector Kit和感受態(tài)細(xì)胞 Tsurbo Chemically Competent Cell購于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；引物合成和測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司（簡稱生工）完成。

1.3 目的基因的鑒定、擴(kuò)增和克隆測(cè)序

在NCBI網(wǎng)站下載部分已發(fā)表的昆蟲CDA2蛋白序列，然后以這些蛋白序列為查詢序列（query），通過本地 BLAST在蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行比對(duì)，鑒定蘋果蠹蛾CDA2的全長CDS序列。

根據(jù)其序列信息，使用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)其基因全長克隆引物（表1）。采用RNA提取試劑盒提取蘋果蠹蛾5齡幼蟲的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行如下循環(huán)，95℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離出含有目的條帶的膠塊，使用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后按照試劑盒說明書將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pClone007 Simple Vector載體上，用移液槍吸取 5 μL連接產(chǎn)物輕輕加入置于冰上并剛解凍的50 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置5 min，42℃水浴熱激45 s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，靜置2 min，加入500 μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，然后取200 μL均勻涂布到含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)，從平板中挑選單克隆菌落，通過菌落PCR篩選陽性克隆，搖菌培養(yǎng)后送生工測(cè)序。

表1 本研究中所用引物信息Table 1 Information of primers used in this study

1.4 生物信息學(xué)分析

CpCDA2a和CpCDA2b的CDS序列分別通過本地BLAST與蘋果蠹蛾基因組數(shù)據(jù)比對(duì)得到外顯子和內(nèi)含子的位置信息，并用IBS1.0軟件繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖。通過Pfam網(wǎng)站（https://pfam.xfam.org）和CDD網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)其蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽和功能域預(yù)測(cè)，并用IBS1.0軟件繪制示意圖。通過MEGA7.0軟件對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)并通過GeneDoc軟件展示。從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫獲取其他昆蟲中已鑒定的 CDA2氨基酸序列，并使用 MEGA7.0軟件采用鄰接法（neighborjoining，NJ）進(jìn)行聚類分析。通過網(wǎng)站 https://web.expasy.org/protparam對(duì)其蛋白分子量、等電點(diǎn)和氨基酸含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，蛋白親/疏水分析通過網(wǎng)站 https://web.expasy.org/protscale進(jìn)行，蛋白 N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)分別通過網(wǎng)站 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc和http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang進(jìn)行預(yù)測(cè)，蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)示意圖由Phyre2 Server網(wǎng)站（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi?id=index）和PyMol Molecular Graphics System（ver.2.2.3）軟件完成。

1.5 熒光定量PCR（RT-qPCR）

基于CpCDA2a和CpCDA2b的可變剪切分析，使用Vector NTI軟件分別設(shè)計(jì)基因的RT-qPCR引物（表1），上游共同引物在第2個(gè)外顯子上，下游引物分別在其差異外顯子上（圖1-A）。將cDNA稀釋10倍作為模板，反應(yīng)體系為Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox）10 μL，模板 1 μL，上游和下游定量引物分別0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，熔解曲線程序?yàn)?5℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以Cpβ-tubulin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用R version 3.5.1軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD法進(jìn)行顯著性分析，使用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行作圖。

1.6 不同發(fā)育時(shí)期和幼蟲不同組織的相對(duì)表達(dá)量分析

通過蘋果蠹蛾不同發(fā)育時(shí)期，包括卵、1—3齡幼蟲、4齡早期幼蟲、4齡中期幼蟲、4齡晚期幼蟲、5齡早期雌雄幼蟲、5齡中期雌雄幼蟲、1日齡雌雄蛹、5日齡雌雄蛹、9日齡雌雄蛹、雌雄成蟲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（未發(fā)表），采用 RSEM（RNA-Seq by Expectation Maximization）方法計(jì)算各樣本中CpCDA2a和CpCDA2b的FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）值，作為蘋果蠹蛾不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。收集蘋果蠹蛾4齡第2天幼蟲，在解剖鏡下快速解剖收集表皮、頭、中腸、馬氏管、唾液腺、血淋巴和脂肪體，迅速凍于液氮中，共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用RNA提取試劑盒分別提取7個(gè)組織部位的總RNA，以1 μg總RNA為模板使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組 DNA后合成第一鏈 cDNA。采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)CpCDA2a和CpCDA2b在蘋果蠹蛾幼蟲不同組織的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 注射蛻皮激素（20E）后CpCDA2a和CpCDA2b的表達(dá)分析

選取5齡第2天蘋果蠹蛾幼蟲進(jìn)行20E處理。先將20E溶于含0.1%二甲基亞砜（DMSO）的PBS緩沖液，配置成1 μg·μL-1的溶液，將此濃度的20E溶液采用顯微注射方法注射到幼蟲胸足位置。對(duì)照組注射等體積的PBS緩沖液，分別于注射后24 h和48 h取樣，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，分析CpCDA2a和CpCDA2b在注射20E后不同時(shí)間的表達(dá)動(dòng)態(tài)。采用GraphPad Prism6.0軟件的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)（T-test）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 CpCDA2a和CpCDA2b的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白結(jié)構(gòu)域分析

基于已知昆蟲的CDA2序列信息，通過同源比對(duì)在蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了蘋果蠹蛾CDA2的兩個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本，分析發(fā)現(xiàn)與其他昆蟲中類似，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本也是可變剪切體，將其分別命名為CpCDA2a和CpCDA2b。通過PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的序列一致，兩個(gè)基因的CDS長度分別為1 629和1 611 bp，分別編碼542和536個(gè)氨基酸。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，兩個(gè)基因均包含5個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其中第3個(gè)外顯子存在差異（圖1-A）。

功能域分析表明，CpCDA2a和CpCDA2b蛋白均具有信號(hào)肽（SP）、幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChBD）、低密度脂蛋白受體域（LDLa）和幾丁質(zhì)脫乙?；呋颍–DA）功能域，其中僅有ChBD存在差異，CpCDA2a和CpCDA2b的ChBD分別包含62個(gè)和56個(gè)氨基酸（圖1-B）。另外，通過不同昆蟲CDA2蛋白兩個(gè)剪切體差異區(qū)域序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，各昆蟲兩個(gè)剪切體的差異序列大部分在ChBD結(jié)構(gòu)域中，其中CpCDA2a和CpCDA2b共有18個(gè)差異氨基酸序列，均分布于ChBD結(jié)構(gòu)域中（圖2）。

2.2 CDA2蛋白聚類進(jìn)化分析

選取不同昆蟲CDA2氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示相同目昆蟲的CDA2均以較高的置信度聚為一支，其中蘋果蠹蛾CpCDA2a和CpCDA2b與云杉卷葉蛾 CfCDA2a 和 CfCDA2b進(jìn)化關(guān)系最近。并且除直翅目的兩種昆蟲外，本研究所選其他昆蟲均為本物種的CDA2a和CDA2b首先聚為一支，再與近緣種聚到一起，而直翅目中的飛蝗（Locusta migratoria）和中華稻蝗首先是不同物種的同一剪切類型分別聚為一支，然后兩種剪切類型再聚到一起（圖 3），對(duì)其序列分析發(fā)現(xiàn)這可能與本研究所選取的不同目中的不同昆蟲間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度有關(guān)。另外，黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）中兩個(gè)剪切體分別又存在兩個(gè)不同的亞型，可能是在基因組上發(fā)生了擴(kuò)增現(xiàn)象，這在進(jìn)化上值得進(jìn)一步深入分析。

2.3 CpCDA2a和CpCDA2b的蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用 Phyre2在線網(wǎng)站和 PyMol軟件構(gòu)建CpCDA2a和CpCDA2b蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。從圖中可以看出，蘋果蠹蛾兩個(gè)CDA2蛋白的三維結(jié)構(gòu)整體上十分相似（圖4-A、4-C）。根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果可知，兩個(gè)CDA2蛋白間的差異序列位于ChBD功能域，所以將兩個(gè)蛋白該區(qū)域的序列分別獨(dú)立構(gòu)建了三維結(jié)構(gòu)模型（圖4-B、4-D），發(fā)現(xiàn)兩者的ChBD功能域均含有 5個(gè)β-轉(zhuǎn)角，但CpCDA2a的 ChBD比 CpCDA2b多了1個(gè)α-螺旋，并且CpCDA2a的ChBD中有2個(gè)β-轉(zhuǎn)角均比CpCDA2b的ChBD對(duì)應(yīng)的2個(gè)β-轉(zhuǎn)角長約3個(gè)氨基酸，其中1個(gè)的氨基酸序列差異較大，這些結(jié)構(gòu)上的差異會(huì)導(dǎo)致其分子特性發(fā)生變化，也可能會(huì)造成其功能上的分化。

2.4 CpCDA2a和CpCDA2b的蛋白理化性質(zhì)

CpCDA2a和CpCDA2b蛋白的氨基酸長度分別為542和536 aa，兩個(gè)蛋白的分子量相近、等電點(diǎn)相同，均具有2個(gè)相同的N-糖基化位點(diǎn)和5個(gè)相同的O-糖基化位點(diǎn)，但CpCDA2a在差異位置（T37）比CpCDA2b多1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（表2）。

表2 CpCDA2a和CpCDA2b蛋白性質(zhì)Table 2 Protein property of CpCDA2a and CpCDA2b

親/疏水分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)蛋白親水和疏水氨基酸都在整個(gè)肽鏈中的分布比較均勻，分別占總氨基酸的65.10%和34.90%，第11位氨基酸分值最高2.967，第28位分值最低為-3.144。而兩者在 61—76區(qū)域親/疏水性有較大差異（圖 5），如圖中灰色方框所示，在此區(qū)域其氨基酸親/疏水分值最高峰都在第 76位，CpCDA2a為0.667，而CpCDA2b則高達(dá)1.322；最低峰都在第67位，CpCDA2a為-1.956，遠(yuǎn)低于CpCDA2b的-1.333；并且從61—67位兩者氨基酸親/疏水分值都呈下降趨勢(shì)，但 CpCDA2a的下降趨勢(shì)更劇烈，且該區(qū)段其每個(gè)氨基酸親/疏水分值都小于CpCDA2b所對(duì)應(yīng)位置的氨基酸分值。

2.5 CpCDA2a和CpCDA2b在蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段的差異表達(dá)分析

CpCDA2a和CpCDA2b在蘋果蠹蛾各發(fā)育階段均有表達(dá)，且相同基因在不同發(fā)育階段的雌、雄蟲間的表達(dá)量均無顯著差異，其中CpCDA2a在幼蟲期的蛻皮前后（4齡末期、5齡初期和4齡初期）、卵期以及蛹中期顯著高表達(dá)，而幼蟲各齡期的中期以及蛹末期和成蟲中表達(dá)量較低；CpCDA2b在蛹的前期和中期顯著極高表達(dá)，幼蟲期的蛻皮前后和卵期顯著高表達(dá)，而幼蟲各齡期的中期以及蛹末期和成蟲中表達(dá)量均較低。另外，CpCDA2a在4齡末和5齡初幼蟲中高表達(dá)，且其表達(dá)量顯著高于CpCDA2b，約為其3—5倍；而CpCDA2b在蛹前期和中期高表達(dá)，且其表達(dá)量顯著高于CpCDA2a，約為其2—5倍，值得注意的是在預(yù)蛹期時(shí)CpCDA2b的表達(dá)量極低，化蛹第1天急劇升高，除此之外，在其他發(fā)育階段兩個(gè)基因的表達(dá)量基本無明顯差異（圖6）。

2.6 CpCDA2a和CpCDA2b在蘋果蠹蛾幼蟲不同組織特異表達(dá)分析

CpCDA2a和CpCDA2b在7個(gè)組織中均有表達(dá)，且都是在表皮中表達(dá)量最高，頭部次之，但CpCDA2b在頭部的表達(dá)量與表皮相差較小，無顯著差異，而CpCDA2a在頭部的表達(dá)量顯著低于表皮；其他組織中兩個(gè)基因的表達(dá)量均較低，而在血淋巴中幾乎不表達(dá)，這與其生物學(xué)功能是相符的（圖7）。

2.7 注射20E后CpCDA2a和CpCDA2b的表達(dá)分析

為了分析CpCDA2a和CpCDA2b的表達(dá)是否受蛻皮激素的影響，選取5齡第2天蘋果蠹蛾幼蟲，分別注射20E溶液和對(duì)照緩沖液，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)基因的表達(dá)情況（圖8）。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比在注射20E后兩個(gè)基因表達(dá)量均呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，但CpCDA2a在注射20E后24 h和48 h的表達(dá)量與對(duì)照相比差異均不顯著，而注射20E后CpCDA2b在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，在24 h為對(duì)照的40倍左右，48 h時(shí)其表達(dá)量有所回落，但仍達(dá)到對(duì)照表達(dá)量的20倍。

3 討論

幾丁質(zhì)脫乙酰基酶（CDA）是一種糖酯酶家族的金屬酶，它能夠催化幾丁質(zhì)β-1,4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０坊猓纬擅撘阴锥≠|(zhì)（即殼聚糖），在幾丁質(zhì)代謝中起重要作用[23-25]。CDA已在真菌、細(xì)菌和昆蟲等物種中被廣泛發(fā)現(xiàn)并研究，在昆蟲中CDA可通過使幾丁質(zhì)脫乙?；纬蓺ぞ厶莵韰⑴c昆蟲發(fā)育過程中表皮、氣管和腸道等器官的形成，調(diào)節(jié)其幼蟲蛻皮過程，還具有抵抗病原菌的功能[16,20,26]。在赤擬谷盜（Triboliumcastaneum）[18]中根據(jù)包含功能域的不同，將其9個(gè)CDA分為5類，其中CDA1和CDA2屬于第1類，而且CDA2包含兩個(gè)可變剪切轉(zhuǎn)錄本，并且已在多種昆蟲中被鑒定和研究[6,21-22,27]。與其他昆蟲的CDA2相似，蘋果蠹蛾CDA2也存在兩個(gè)可變剪切轉(zhuǎn)錄本，分別命名為CpCDA2a和CpCDA2b，兩者的蛋白序列均包含信號(hào)肽以及幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChBD）、低密度脂蛋白受體域（LDLa）和幾丁質(zhì)脫乙?；呋颍–DA）3個(gè)功能域。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，個(gè)別關(guān)鍵位置氨基酸的差異都可能導(dǎo)致其功能活性方面的較大變化，CpCDA2a和CpCDA2b僅在ChBD功能域區(qū)域有18個(gè)氨基酸的差異，通過對(duì)其三維結(jié)構(gòu)的模擬與比較發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)存在較大差異，這很可能導(dǎo)致其可以結(jié)合并催化水解的幾丁質(zhì)類型間的不同，從而使其在功能上存在較大差異。進(jìn)一步分析了兩者親/疏水性、等電點(diǎn)和糖基化修飾位點(diǎn)等，其中親/疏水性在差異區(qū)域有顯著區(qū)別，這可能與其需結(jié)合催化的幾丁質(zhì)類型相適應(yīng)；而且該差異區(qū)中 CpCDA2a比CpCDA2b多一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，糖基化是一種重要的蛋白修飾類型，對(duì)維持蛋白的空間構(gòu)象和保護(hù)其免受蛋白水解酶的降解具有重要意義，這表明兩個(gè)蛋白間發(fā)揮功能的環(huán)境和條件可能也存在差異。

CDA在昆蟲的不同發(fā)育階段和組織中的表達(dá)模式存在多樣性，這與其所發(fā)揮的生物學(xué)功能相關(guān)。目前，研究者已對(duì)褐飛虱（Nilaparvatalugens）[28]、橘小實(shí)蠅（Bactroceradorsalis）[29]、馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsadecemlineata）[30]、云杉卷葉蛾[21]、家蠶[19]、中華稻蝗[6]及美國白蛾[22]等多種昆蟲中CDA2的發(fā)育階段和組織表達(dá)情況進(jìn)行了研究。對(duì)中華稻蝗CDA2的研究發(fā)現(xiàn)，OcCDA2a在前腸中表達(dá)量最高，其次是表皮和后腸，而OcCDA2b在表皮中表達(dá)量最高，其次是前腸，根據(jù)其不同的表達(dá)特點(diǎn)，推測(cè)其功能發(fā)生了分化[6]。本研究中蘋果蠹蛾CDA2的兩個(gè)剪切體都是在表皮中表達(dá)量最高，其中CpCDA2a僅在表皮中特異性顯著高表達(dá)，而CpCDA2b除在表中顯著高表達(dá)外，頭部的表達(dá)量也與其相近，推測(cè)該基因的兩個(gè)剪切體在幼蟲的發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能也有一定程度的差異。在發(fā)育階段表達(dá)方面，多種昆蟲中CDA2兩個(gè)剪切體均在蛻皮第1天后表達(dá)量最高，之后逐漸下降，可能參與新表皮的鞣化和骨化[6]，本研究中蘋果蠹蛾CDA2兩個(gè)剪切體在幼蟲期都是蛻皮前后的表達(dá)量最高，推測(cè)其在昆蟲蛻皮和新表皮的形成過程發(fā)揮重要作用，而且它們?cè)诓煌l(fā)育階段的總體表達(dá)模式也有較大差異，CpCDA2a主要在幼蟲期高表達(dá)，而CpCDA2b主要在化蛹前期和中期高表達(dá)，因此CpCDA2b對(duì)蘋果蠹蛾蛹?xì)ぶ袔锥≠|(zhì)的合成和代謝具有更重要的作用。另外，對(duì)5齡幼蟲注射20E后，兩個(gè)剪切體均表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)，其中CpCDA2b顯著且劇烈上調(diào)，結(jié)合其不同發(fā)育階段中幼蟲蛻皮前后的表達(dá)量顯著高于幼蟲齡期中間階段，表明其在幼蟲蛻皮過程中也發(fā)揮重要作用，而CpCDA2a的上調(diào)趨勢(shì)不顯著，其在幼蟲蛻皮過程中的作用有待通過RNAi等技術(shù)進(jìn)一步深入研究。

在其他昆蟲中開展的 RNAi試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了昆蟲CDA2不同剪切體的功能特異性。如通過RNAi降低赤擬谷盜TcCDA2a的表達(dá)量后，主要影響其股脛關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)，而TcCDA2b表達(dá)量下調(diào)則導(dǎo)致背側(cè)褶皺[13]；在馬鈴薯甲蟲中，干擾LdCDA2a既不影響食物攝取，也不影響發(fā)育時(shí)間，而干擾LdCDA2b后幼蟲生長發(fā)育遲緩，發(fā)育期延長，不能正常蛻皮最終死亡[30]。在美國白蛾、中華稻蝗和飛蝗中，干擾CDA2a的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致非正常生物型和高死亡率，而CDA2b表達(dá)降低后不影響昆蟲的正常生長發(fā)育[6,22,31]。另外，趙盼等從酶學(xué)角度研究了飛蝗CDA2兩個(gè)剪切體的差異[32]，為RNAi后導(dǎo)致飛蝗表型不同可能是由于它們催化功能不同的推斷提供了理論支持。但由于蘋果蠹蛾 RNAi效果很差且不穩(wěn)定[33]，無論通過注射還是飼喂CDA2的dsRNA，均不能顯著降低其表達(dá)量（未發(fā)表數(shù)據(jù)），后續(xù)可通過RNAi技術(shù)體系的優(yōu)化來進(jìn)一步驗(yàn)證兩個(gè)剪切體的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

克隆并驗(yàn)證了蘋果蠹蛾CDA2的全長 cDNA序列，該基因存在兩個(gè)可變剪切體CpCDA2a和CpCDA2b；通過綜合分析CpCDA2a和CpCDA2b分子特性、發(fā)育階段和組織表達(dá)譜、以及注射蛻皮激素后表達(dá)動(dòng)態(tài)等，推測(cè)兩者可能都參與了蘋果蠹蛾蛻皮和新表皮形成過程，但由于可變剪切序列差異所導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上的差異，造成了兩者在功能上的分化，該研究結(jié)果為蘋果蠹蛾綠色新型農(nóng)藥開發(fā)中的靶標(biāo)選擇提供了科學(xué)依據(jù)。