劉方晨，賈憲波 ，吳良泉，方 宇，趙 恪，林俊杰，陳龍軍，張 慧，林陳強(qiáng)，陳濟(jì)琛

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建 福州 350003；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】靈菌紅素類（Prodiginines）是微生物源的三吡啶類紅色次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌、除藻、抗植物病原體以及其他重要的生物活性[1?4]，在醫(yī)藥、環(huán)境治理、紡織染料乃至化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和市場價(jià)值。根據(jù)其烷基側(cè)鏈的不同分為靈菌紅素（prodigiosin，PG）、間環(huán)丙菌素（metacycloprodigiosin，MPG）、十一烷基靈菌紅素（undecylprodigiosin，UPG）、壬烷基靈菌紅素（nonylprodigiosin，NPG）、環(huán)丙烷靈菌紅素（cycloprodigiosin，CPG）等。其中PG是該類色素的典型代表之一，主要出現(xiàn)在微生物生長的后期[5]，是一種暗紅色的粉末，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[6]。作為靈菌紅素家族中的一員，PG主要是沙雷氏菌屬、放線菌屬、假單胞菌屬、海洋類細(xì)菌等的次生代謝產(chǎn)物[7]，其中黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）所產(chǎn)生的PG生物活性較好，因此被作為生產(chǎn)PG的模式菌株[8]。研究發(fā)現(xiàn)，該菌合成靈菌紅素對溫度有較為嚴(yán)格的要求，在溫度高于37 ℃以及低于20 ℃時(shí)色素合成被完全抑制[9]，28 ℃為其生產(chǎn)靈菌紅素的最佳溫度[10]，但其受溫度調(diào)控的機(jī)制尚不明確?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黏質(zhì)沙雷氏菌合成PG是由兩個(gè)復(fù)雜的分叉途徑共同完成的，而這兩個(gè)分叉途徑已被闡明。這兩個(gè)分支合成了兩個(gè)前體物質(zhì)，分別是2-甲基-3-n-戊基吡咯（MAP）和4-甲氧基-2,2′-雙吡咯-5-甲醛（MBC），再由MAP和MBC的縮合生成PG[11]。靈菌紅素生物合成途徑由pig基因簇基因共同參與，pig基因簇有pigA-pigN共14個(gè)編碼基因，其中pigB、pigD和pigE參與了MAP的合成，而pigA、pigF、pigG、pigH、pigI、pigJ、pigK、pigL、pigM和pigN則參與了MBC的合成。PG合成的前體物質(zhì)主要有脯氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、絲氨酸、組氨酸、二辛烯醛、丙二酰-CoA和乙酰- CoA[12]。靈菌紅素合成基因簇不僅能夠在黏質(zhì)沙雷氏菌中合成靈菌紅素，也能在其他菌株中異源合成靈菌紅素，Thomson等[13]首次將黏質(zhì)沙雷氏菌完整的PG生物合成基因簇克隆下來在歐文氏菌（Erwinia carotovora）中成功表達(dá)并合成目的產(chǎn)物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】黏質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素受溫度調(diào)控的機(jī)制目前尚未被闡明，其對溫度的具體要求不明確，這對靈菌紅素的規(guī)?；a(chǎn)造成阻礙。因此，從分子水平研究其受溫度調(diào)控的機(jī)制意義重大。本研究將靈菌紅素合成基因簇與不同類型啟動(dòng)子相連接后于大腸桿菌中異源表達(dá)，探究更換啟動(dòng)子是否能夠令其在相對高溫（37 ℃）合成色素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究供試菌株黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02為本課題組前期篩選保藏的靈菌紅素高產(chǎn)菌株[14]，為了探究其pig基因簇能否在大腸桿菌中表達(dá)并合成PG，并探究其在37 ℃不產(chǎn)靈菌紅素的原因是其pig基因簇啟動(dòng)子在37 ℃不表達(dá)或表達(dá)量降低，還是pigA-N編碼合成的靈菌紅素前體所用的蛋白在37 ℃無活性。本研究通過構(gòu)建3種包含不同啟動(dòng)子與pig基因簇的重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中探究其能否在大腸桿菌中合成靈菌紅素，并通過RTqPCR來檢測37 ℃與28 ℃條件下培養(yǎng)的FZSF02菌株pigA、pigF、pigN基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，進(jìn)而驗(yàn)證其在37 ℃條件下不能合成PG究竟是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，還是因?yàn)槭艿胶铣蒔G所需要的酶的影響，抑或是受到兩者的綜合調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件 本研究供試菌株和質(zhì)粒詳情見表1，如無特殊注明：大腸桿菌在37 ℃培養(yǎng)，黏質(zhì)沙雷氏菌在28 ℃培養(yǎng)，使用LB培養(yǎng)基（酵母粉0.5% w/v、胰蛋白胨1% w/v、氯化鈉1%w/v），固體培養(yǎng)基含2%瓊脂。抗生素如無特殊注明則為：100 mg·L?1ampicillin（Amp），100 mg·L?1K anamycin（Kan）。

1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌DNA提取試劑盒（百泰克DP2001）PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase（R050A）、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（R045A）、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 DNA片段純化試劑盒（9761）均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2X SanTaq PCR Mix（生工B532061）快速質(zhì)粒小提試劑盒（DP105）、培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒（DP430）均購自天根生化科技（北京）有限公司；TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（AT311-03）、PerfectStart Green qPCR SuperMix試劑盒（TG-AQ601-02）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增儀（ABI-Veriti? 96-Well）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI-QuantStudio? 6 Flex）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-6 B）以及凝膠成像分析系統(tǒng)（uvitec-Essential V4）。

表 1 供試菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 pig基因簇的克隆 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒從黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02中提取其基因組DNA，并以提取的FZSF02基因組DNA為模板，以設(shè)計(jì)的ExpF和ExpR為引物，利用擴(kuò)增長片段的高保真DNA聚合酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到pig基因簇序列；PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，68 ℃退火加延伸 10 min，共33個(gè)循環(huán)。

1.2.2 E.Coli DH5α（pTOPO-ppPig）重組菌株的構(gòu)建及鑒定 利用零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒pTOPO-ppPig，重組質(zhì)粒的構(gòu)建所用引物、菌株、質(zhì)粒分別如表1和表2所示。利用DNA純化試劑盒將上述克隆出的pig基因簇DNA進(jìn)行純化，根據(jù)pTOPO平末端克隆試劑盒說明書，構(gòu)建10 μL的克隆反應(yīng)體系：pTOPO-Blunt Simple Vctor（30 ng·μL?1）1 μL、10×Enhancer 1 μL、pig基因簇DNA純化產(chǎn)物8 μL。室溫反應(yīng)20 min后，轉(zhuǎn)入E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，冰上放置2 min后，加入0.89 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床孵育2 h；菌體均勻涂布于含有Amp的LB平板上，28 ℃培養(yǎng)過夜，挑取紅色的單菌落，利用M13F和M13R引物進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物送至上海博尚生物技術(shù)有限公司測序，利用NCBI B LAST對發(fā)回的結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.2.3 E.coli DH5α（pTOPO-kpPig）重組菌株的構(gòu)建及鑒定 以實(shí)驗(yàn)室保存的pTOPO-kan質(zhì)粒利用KanproF2和KanproR2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增將質(zhì)粒線性化，得到一條不含Kan抗性基因的線性化載體。使用無縫克隆試劑盒將純化的pig基因簇DNA與純化的線性化載體相連接，連接體系為10 μL：線性化載體3.5 μL、pig基因簇DNA3.5 μL、酶3 μL。37 ℃靜置30 min后，再次轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，余下步驟與1.2.2相同。

1.2.4 E.coli BL21（pEASY-Pig）重組菌株的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 利用pEASY?- Blunt E2 表達(dá)試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒pEASY-Pig，克隆反應(yīng)體系為：pig基因簇DNA 4 μL、pEASY?- Blunt E2 Expression Vctor 1 μL。室溫反應(yīng)5 min后，轉(zhuǎn)入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化操作與1.2.2相同，挑取數(shù)個(gè)長勢良好的單菌落，接種入1.5 mL離心管，孵育至渾濁后，用T7P、T7T引物(見pEASY質(zhì)粒說明書)進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳后條帶在21 000 bp左右的即為陽性克隆子，已驗(yàn)證為陽性的菌株取少量菌液劃線于加入Amp和IPTG（0.5 mmol·L?1）的LB固體培養(yǎng)基，置于 28 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)并誘導(dǎo)其合成靈菌紅素。

1.2.5 比色法測定靈菌紅素 取少量菌體，溶于5 mL酸性甲醇中，靜置15 min后，10 000 r·min?1超速離心5 min，取上清液，利用紫外分光光度計(jì)測定其在535 nm吸光度（靈菌紅素酸性條件下在535 nm處 有特征吸收）[14]。

表 2 供試引物Table 2 Primers used in this study

1.2.6 野生型FZSF02菌株在不同溫度條件下（28 ℃/37 ℃）pigA、pigN和pigF基因轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR測定 將野生型FZSF02菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，放置于28 ℃培養(yǎng)作為種子液，在OD600值達(dá)到1.0～1.5時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，接種量為1%，37 ℃和28 ℃樣品各設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)共接種6瓶，接種后分別置于28 ℃與37 ℃條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜后利用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取其總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為RT-qPCR模板。設(shè)計(jì)FZSF02的16S rRNA基因引物，以及pigA、pigF和pigN基因引物（如表2所示），按照qPCR試劑盒說明書進(jìn)行反映，檢測各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平，以16S rRNA作為內(nèi)參基因，以37 ℃的基因轉(zhuǎn)錄水平作為對照（CK），每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)，計(jì)算28 ℃溫度條件下各基因轉(zhuǎn)錄水平與其的倍數(shù)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種重組菌株的成功構(gòu)建

通過構(gòu)建3種不同啟動(dòng)子的pig基因簇重組菌株，研究啟動(dòng)子在溫度調(diào)控PG合成的機(jī)制中的作用，利用表2中的引物，用長片段高保真DNA聚合酶分別PCR擴(kuò)增出完整的pig基因簇、完整的pig基因簇和啟動(dòng)子，其中得到片段大小為20 984 bp、21 390 bp。瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1-A所示，1、2泳道依次為pig基因簇、pig基因簇和pig啟動(dòng)子。

按照方法中所述利用上述片段與相應(yīng)載體連接構(gòu)建出3種重組質(zhì)粒（圖2）并轉(zhuǎn)入相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞中，在帶有Amp的LB固體平板上，篩選出長勢良好的重組菌株單菌落。分別利用T7引物與M13引物對pEASY質(zhì)粒和兩個(gè)pTOPO質(zhì)粒所連接的片段進(jìn)行PCR驗(yàn)證，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后如圖1-B所示，pTOPO-ppPig、pTOPO-kpPig、pEASY-Pig重組質(zhì)粒所連片段（泳道1、2、3），3個(gè)泳道的條帶均在大于15 000 bp處有明顯條帶，與預(yù)期相符。將PCR驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送樣測序，測序結(jié)果與NCBI中菌株FZSF02靈菌紅素合成基因簇進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)其匹配度為100%，可知得到的質(zhì)粒即為目的質(zhì)粒，測序 陽性質(zhì)粒按照上述的質(zhì)粒名稱進(jìn)行命名。

2.2 pig基因簇在3種重組菌株中均成功表達(dá)

經(jīng)驗(yàn)證為陽性的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，將其再次劃線于Amp抗性LB平板上，其中pTOPO-ppPig和pTOPOkpPig重組菌株啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，不需誘導(dǎo)即可啟動(dòng)基因表達(dá)，將其分別在28 ℃與37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒后的大腸桿菌能否在對應(yīng)條件下合成靈菌紅素，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)48 h的培養(yǎng)后，28 ℃培養(yǎng)條件下瓊脂平板上菌株變成紅色，但與野生型FZSF02的產(chǎn)量仍有差距，而37 ℃培養(yǎng)條件下的重組菌株無色素合成。而pEASY-Pig重組菌株經(jīng)鑒定后劃線于帶有Amp抗性和IPTG的LB固體平板上，IPTG可以誘導(dǎo)T7強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)，該菌株在28 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下均能夠合成PG。通過比色法測定靈菌紅素結(jié)果如表3所示，pTOPOppPig和pTOPO-kpPig重組菌株在37 ℃培養(yǎng)條件下535 nm吸光度幾乎為0，pEASY-Pig重組菌株在37 ℃培養(yǎng)條件下535 nm吸光度為0.026，雖然吸光度較小但可以確定該菌株在37 ℃有合成靈菌紅素，且遠(yuǎn)小于該菌株28 ℃靈菌紅素合成量。

圖 1 pig基因簇、pig基因簇和pig啟動(dòng)子序列以及3種重組質(zhì)粒所連片段的驗(yàn)證PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR amplification results on pig gene cluster, pig gene cluster and pig promoter, and validation on sequences of 3 recombinant plasmid segments

試驗(yàn)結(jié)果表明黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02的pig基因簇能夠在不同啟動(dòng)子的作用下在大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄，并合成目的產(chǎn)物靈菌紅素。然而只有攜帶T7啟動(dòng)子的重組菌株在37 ℃合成少量的靈菌紅素。

2.3 RT-qPCR的檢測

對pigA、pigF、pigN等基因在不同溫度發(fā)酵后轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行RT-qPCR檢測，以16S rDNA作為內(nèi)參基因，利用SYBR?Green法實(shí)時(shí)定量分析在不同培養(yǎng)溫度下（28 ℃與37 ℃）的基因轉(zhuǎn)錄水平，并用2???CT的方法計(jì)算37 ℃培養(yǎng)條件與28 ℃培養(yǎng)條件下的基因轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)關(guān)系（圖4）。結(jié)果顯示，與28 ℃培養(yǎng)條件下相比，37 ℃培養(yǎng)條件下各基因的轉(zhuǎn)錄水平呈下調(diào)趨勢，pigA、pigF和pigN基因分別下調(diào)了2倍、3倍、2倍以上。推測在37 ℃培養(yǎng)條件下野生型黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02不合成PG是因?yàn)槠鋚ig基因簇中的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，導(dǎo)致其編碼合成的蛋白（酶）的數(shù)量下降，進(jìn)而影響PG的合成。

3 討論與結(jié)論

黏質(zhì)沙雷氏菌合成PG有嚴(yán)苛的溫度要求，一般在24～30 ℃，最適溫度為28 ℃，在37 ℃培養(yǎng)條件下PG的合成受到抑制[15]，高溫抑制靈菌紅素合成的機(jī)制尚不明了[16]。有可能是調(diào)控PG合成的pig基因簇及其操縱子在37 ℃轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平下調(diào)或不表達(dá)，也可能是參與PG前體MAP和MBC合成的某種或幾種酶失去活性。有研究表明，溫度對OmpR家族的CpxR雙組分調(diào)控系統(tǒng)以及pig基因簇啟動(dòng)子有調(diào)控作用并影響PG的合成[17]。ERIC等[18]發(fā)現(xiàn)PG生物合成操縱子在37 ℃的轉(zhuǎn)錄低于30 ℃，并能夠調(diào)控色素的合成。Andrea等證明[19]黏質(zhì)沙雷氏菌調(diào)控色素合成的pig基因簇能夠在惡臭假單胞菌KT2440中異源表達(dá)，并高效的合成靈菌紅素。本研究應(yīng)用異源表達(dá)和pig基因轉(zhuǎn)錄水平兩種方案探討?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的溫度依賴性的內(nèi)在機(jī)制。

圖 2 3種重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程Fig. 2 Construction of 3 recombinant plasmids

圖 3 3種重組菌株在28 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下靈菌紅素的合成情況Fig. 3 Prodigiosin synthesis of 3 recombinant strains cultured at 28 ℃ and 37 ℃

表 3 菌株在535 nm下的吸光度Table 3 Absorbance at 535 nm of recombinant strains

圖 4 粘質(zhì)沙雷氏菌在不同溫度條件下所選基因的轉(zhuǎn)錄水平倍數(shù)變化Fig. 4 Expressions of selected genes of S. marcecens at different temperatures

通過構(gòu)建不受溫度影響的啟動(dòng)子與pig基因簇連接的重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中異源表達(dá)，進(jìn)而驗(yàn)證啟動(dòng)子在溫度調(diào)控中的影響，并進(jìn)一步探究溫度調(diào)控PG生物合成可能的機(jī)制。首先將FZSF02中的pig基因簇本身的啟動(dòng)子和pig基因簇一同轉(zhuǎn)入大腸桿菌，觀察pig基因簇在本身啟動(dòng)子的作用下能否在大腸桿菌中的表達(dá)，結(jié)果顯示pig基因簇可以在其本身啟動(dòng)子的啟動(dòng)下在大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。隨后利用不受溫度影響的T7啟動(dòng)子和通用型啟動(dòng)子（可在37 ℃表達(dá)）在大腸桿菌中啟動(dòng)pig基因簇合成PG，結(jié)果顯示3種重組菌株都可以在28 ℃合成PG。其中只有攜帶T7啟動(dòng)子的重組菌株在37 ℃合成少量的PG，推測是由于T7強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于pig基因簇本身啟動(dòng)子和通用型啟動(dòng)子，這意味著該菌株可以編碼合成更多靈菌紅素前體合成所需要的蛋白（酶），這些蛋白（酶）在37 ℃并不是完全失活，而是活性大大降低了，所以擁有超量蛋白（酶）的pEASY-Pig重組菌株才能在37 ℃合成少量靈菌紅素。而另外兩種菌株則因?yàn)楹铣蒑AP與MBC的蛋白（酶）在37 ℃條件下失去活性或活性大幅降低而無法合成PG。所以，該試驗(yàn)證明黏質(zhì)沙雷氏菌菌株只在低溫下合成靈菌紅素與pig基因簇所編碼的蛋白在37 ℃高溫下活性降低或失活有關(guān)。

pigF與pigN基因參與了MBC合成的關(guān)鍵步驟，編碼直接或間接參與MBC合成的蛋白（酶）：氧甲基轉(zhuǎn)移酶（PigF）和氧化還原酶（PigN），PigA也參與合成MBC前體物質(zhì)；它們的轉(zhuǎn)錄水平反映了MBC的合成水平[9]。本研究利用RT-qPCR分析了FZSF02菌株pig基因簇中的pigA、pigF和pigN基因在37 ℃與28 ℃的轉(zhuǎn)錄水平差異，發(fā)現(xiàn)在37 ℃培養(yǎng)條件下上述3種基因的轉(zhuǎn)錄水平相對于28 ℃出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，這與徐紅等[20]的研究是一致的。上述3個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)了約59%、69.8%以及61.8%，導(dǎo)致其編碼合成參與靈菌紅素前體合成的蛋白（酶）減少，進(jìn)而MBC的合成量減少，最終導(dǎo)致靈菌紅素合成量減少。且FZSF02菌株在28 ℃培養(yǎng)條件下色素產(chǎn)量較高，37 ℃培養(yǎng)條件下幾乎沒有色素合成（表3）。該試驗(yàn)說明在黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02菌株中pig基因簇上的相關(guān)基因除其翻譯的蛋白活性受溫度影響外，基因簇本身的轉(zhuǎn)錄水平也受溫度控制，即低溫有利于啟動(dòng)子啟動(dòng)該基因簇的轉(zhuǎn)錄。

綜上，初步推測黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02不能在37 ℃合成PG，一方面是由于pig基因簇在37 ℃轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，導(dǎo)致其編碼的合成MBC與MAP所需要的酶量減少；另一方面是因?yàn)?7 ℃嚴(yán)重影響相關(guān)酶的活性。所以，溫度影響?zhàn)べ|(zhì)沙雷氏菌合成PG的內(nèi)在機(jī)制是綜合性的。

本研究通過重組菌株成功異源表達(dá)pig基因簇并合成靈菌紅素，給出了黏質(zhì)沙雷氏菌FZSF02在37 ℃合成PG受到抑制的原因及相關(guān)證據(jù)，增進(jìn)了對黏質(zhì)沙雷菌合成PG的認(rèn)識，為規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)PG提供了一定理論依據(jù)。