余海軍，羅代兵，楊祎祎，田新平*

（1.碧江區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧水產(chǎn)中心，貴州銅仁554300；2.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水生生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384）

羊布魯氏菌?。ê喎Q羊布?。┦且环N以布魯氏菌為致病菌引起的人羊共患的傳染性疾病[1]，其病菌對外部環(huán)境有較強的適應力、耐低溫、耐干燥，能夠長期生存于動物、水及土壤中。布魯氏菌寄生在動物的細胞中，藥物防控無效，發(fā)生流行后，不進行治療，立即撲殺，無害化處理[2]。羊布病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類動物疫病，在國內(nèi)被列為二類動物疫病[3]，不僅對養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成極大影響，也對人畜造成不可低估的危害。目前，對羊布病常使用的實驗室診斷方法為血清學檢測，包括虎紅平板凝集（RBT）、試管凝集（SAT）、膠體金免疫層析和酶聯(lián)免疫吸附試驗。本研究基于虎紅平板凝集試驗初篩定性、試管凝集和酶聯(lián)免疫吸附試驗復檢定量，對御諾乳業(yè)奶山羊場438份樣本進行血清學分析研究，探究其對于羊布病檢測的有效性，為及時了解和掌握羊布病的疫情動態(tài)、做好羊布病有效防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究在貴州省銅仁市碧江區(qū)御諾乳業(yè)奶山羊場采集羊血液樣本，將采集的438份樣本分別標號（A1-A81、B1-B112、C1-C56、C61-C98、D1-D151）放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)，待其分離血清，用于后續(xù)的血清學研究。

1.2 血清學檢測方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗

取30μL虎紅平板凝集抗原于檢查卡上，分別與等體積的受檢血清和標準陽性血清混勻，室溫靜置5 min，觀察結(jié)果。

1.2.2 試管凝集試驗

本研究采用微量法對虎紅平板凝集試驗篩選出的陽性樣本，按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）操作測定[4]。第一步將受檢血清和抗原對照在U型板中稀釋，每份血清有4孔；第二步將稀釋的抗原100μL加入第一步稀釋好的血清中，稀釋度為1∶25、1∶50、1∶75、1∶100；第三步將試驗組和對照組充分混勻后，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，室溫放置2 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

本研究選用競爭性ELISA抗體檢測試驗對虎紅平板凝集試驗篩選出的陽性樣本進行檢測，具體步驟按照試劑盒說明書操作，最后使用酶標儀對受檢血清、標準陽性、陰性血清進行OD值的測定。

1.3 結(jié)果判定

虎紅平板凝集試驗根據(jù)檢查卡中出現(xiàn)不同程度的顆粒狀或玫瑰花瓣狀凝集，判定為標準陽性血清，而標準陰性血清無變化。

試管凝集試驗根據(jù)受檢血清出現(xiàn)1孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，2~4孔孔底均呈現(xiàn)白色點狀凝集，判定為可疑；受檢血清出現(xiàn)1、2孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，3、4孔孔底呈現(xiàn)白色點狀凝集，判定為陽性；受檢血清出現(xiàn)1~4孔孔底均呈現(xiàn)白色點狀，判定為陰性。

競爭性ELISA抗體檢測試驗結(jié)果根據(jù)酶標儀測定450 nm波長處的OD值，按照以下公式計算數(shù)據(jù)以判定結(jié)果。

式中：ODNC為陰性血清的平均OD值；ODPC為陽性血清的平均OD值；ODS為受檢血清的OD值；當ODNC>0.5，且陽性血清抑制率>60%時，試驗結(jié)果有效，否則重新試驗；當樣本抑制率≥50%判定為陽性，否則為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎紅平板凝集試驗結(jié)果（見圖1）

在布病血清學檢測研究中，虎紅平板凝集試驗操作簡單、耗時短，由于其敏感性高、特異性低，因而被廣泛用于布病的初篩[5-7]。由圖1可知，本試驗438份羊血清，虎紅平板凝集試驗初篩147份陽性，291份陰性。

2.2 試管凝集試驗結(jié)果（見圖2）

試管凝集試驗對初篩的147份陽性樣品進行復核。由圖2可知，A14、B37、C72、D65、D75、D76、D80、D90、D93、D116為陰性，D131為可疑，其余136份均為陽性。

2.3 競爭性ELISA抗體檢測試驗結(jié)果（見圖3）

對147份初篩陽性血清進行競爭性ELISA抗體檢測試驗。由圖3可知，ODNC為0.825 5，陽性血清抑制率為89.30%（0.737/0.825 5），判定試驗結(jié)果有效，樣本抑制率約為0.413（即樣本OD值≤0.413為陽性，反之為陰性）；通過復核篩選出136份陽性，11份陰性。

3 討論

羊布病嚴重影響羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此針對布病的診斷和綜合防控，有利于保障養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益[8]。目前，布病的診斷檢測存在著2種方法，即血清學檢測和病原學檢測。病原學是通過從疑似患病羊組織、乳汁、分泌物中分離出菌落，涂片染色鏡檢，根據(jù)菌落顏色診斷[9-10]；但由于此方法周期長、操作技術(shù)和實驗室設(shè)備要求高、試驗人員存在感染風險，不能廣泛推廣應用[11-12]。血清學檢測是通過從疑似患病羊血液中分離血清，與抗原試劑混合反應，根據(jù)理化反應現(xiàn)象和試驗儀器數(shù)據(jù)讀取診斷。對比病原學檢測，血清學檢測周期短、試驗儀器要求不高、降低試驗人員的感染風險。因此，在國內(nèi)外均采用血清學試驗檢測布病[13]。

本研究采用血清學檢測對羊布病進行診斷，通過虎紅平板凝集對438份樣本初篩，試管凝集和競爭性ELISA抗體檢測對初篩的陽性樣本進行復核。結(jié)果表明，虎紅平板初篩出147份陽性樣本，試管凝集復核陽性樣本有136份、可疑1份；競爭性ELISA抗體檢測復核有136份，診斷率達92.5%，在一定程度上證明血清學檢測對于羊布病診斷具有有效性。同時，在血清學分析中發(fā)現(xiàn)，D131樣本ELISA抗體檢測結(jié)果為0.470，大于樣本抑制率，故可以診斷為陰性樣本；而試管凝集結(jié)果顯示其屬于可疑樣本，無法診斷其陰、陽性，對照虎紅平板結(jié)果也無法診斷，結(jié)果見圖4?；谝陨辖Y(jié)果，可以推斷出在布病陽性樣本復核中，競爭性ELISA抗體檢測靈敏度高于試管凝集檢測，與齊景文等[14]提出的觀點一致，即ELISA抗體檢測用于羊布病復核較為理想。

由于缺乏基礎(chǔ)研究，對于羊布病缺乏準確的診斷手段，同時也嚴重阻礙與之相關(guān)的凈化研究和發(fā)展。羊布病研究工作者任重道遠，還有大量的基礎(chǔ)研究任務需要完成。因此，需要更多的研究人員參與研究，為動物科學、農(nóng)業(yè)科學和環(huán)境科學等學科提供有效且可信的科研資料，為布病深入研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究通過血清學檢測對貴州碧江地區(qū)所采集的438份羊血清進行分析，運用虎紅平板試驗初篩出147份陽性，試管凝集和競爭性ELISA抗體檢測對初篩的147份陽性進行復核得136份陽性，表明92.5%的樣本能診斷為陽性，證明血清學檢測能有效診斷羊布病。