李帥帥，張 晨，張雨欣，鄧 茵，王子懿，阿依木古麗·阿不都熱依木

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030）

藏羊又稱藏系羊（Tibetan sheep），是我國(guó)特有的牛科品種。藏羊體質(zhì)強(qiáng)壯、抗嚴(yán)寒、耐粗飼，廣泛分布于海拔3 000~5 000 m的青藏高原地區(qū)。海拔高度與大氣含氧量呈負(fù)相關(guān)性變化，海拔越高，大氣含氧量越低[1]。藏羊長(zhǎng)期生活在高海拔、低氧、嚴(yán)寒的環(huán)境中。藏羊經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的生物進(jìn)化，對(duì)低氧、高寒、氣候多變的環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性，是高原牧區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)支柱。

缺氧誘導(dǎo)因子，也稱低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF），普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，是一種異源二聚體，主要由HIF-α和HIF-β2個(gè)亞單位組成。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子是細(xì)胞內(nèi)對(duì)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[2]。HIF-1α的激活在缺氧早期促進(jìn)下游基因，如促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等的表達(dá)，促進(jìn)組織缺氧時(shí)細(xì)胞的存活；但嚴(yán)重缺氧或長(zhǎng)期缺氧則導(dǎo)致下游基因如Bcl-2相互作用蛋白3（BNIP3）和NIX的表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死；同時(shí)也能通過(guò)穩(wěn)定p53的表達(dá)，引起細(xì)胞的凋亡。大鼠心肌細(xì)胞缺氧會(huì)導(dǎo)致HIF-1αmRNA及蛋白水平均顯著增加[3]。HIF-α在血管豐富的心、肺等組織中表達(dá)較強(qiáng)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、胎肺成纖維細(xì)胞系等血流豐富的組織細(xì)胞中含量較高，而在白細(xì)胞系中含量較低[4]。HIF在動(dòng)物低氧適應(yīng)方面起著重要作用，然而具體的分子機(jī)制還不清楚。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)組織學(xué)染色，觀察不同海拔生活的藏羊肺臟組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并用免疫組織化學(xué)SP法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)其HIF-1α的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究藏羊高原適應(yīng)性機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

藏羊樣品采自青海主月畜牧業(yè)屠宰場(chǎng)（海拔高度3 900 m）和甘南鑫旺屠宰場(chǎng)（海拔高度2 900 m）。選擇健康、1~2歲藏羊各5只，斷頸處死，檢查胸腔和腹腔無(wú)可視病理變化，取肺組織1 cm3，4%多聚甲醛固定，24 h后更換固定液復(fù)固定，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

染色切片每組隨機(jī)抽取5張切片，每張切片在400倍視野隨機(jī)選擇10個(gè)不同區(qū)域，用Image Proplus6.0軟件測(cè)量肺被膜厚度、肺泡大小、單位面積（1 mm2）內(nèi)肺泡與肺泡囊數(shù)量、并測(cè)量肺泡隔厚度。Gomori醛品紅染色切片中測(cè)量肺被膜彈性纖維厚度，按（肺彈性纖維厚度/肺被膜厚度）×100%計(jì)算肺被膜彈性纖維百分比。免疫組織化學(xué)SP染色切片檢測(cè)免疫陽(yáng)性產(chǎn)物光密度值（IOD）。

1.2.1 組織學(xué)染色

各組肺組織常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm；一部分切片用于常規(guī)H.E染色和Gomori醛品紅染色；另一部分用于免疫組織化學(xué)染色。

Gomori醛品紅染色：酸化高錳酸鉀氧化5 min，2%草酸漂白1 min，醛品紅染色15 min，70%酒精洗滌3次；橙黃G溶液滴染30 s，水洗終止染色，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟至水，采用微波檸檬酸抗原液修復(fù)法使抗原修復(fù)[5-6]，滴加A液室溫避光孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；滴加B液，室溫孵育30 min，加入一抗室溫孵育1 h（陰性對(duì)照組用PBS緩沖液替代一抗），PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；最后滴加D液室溫孵育20 min，DAB顯色，顯微鏡觀察；最后蘇木素復(fù)染，自來(lái)水反藍(lán)（復(fù)染細(xì)胞核），常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。陽(yáng)性呈黃褐色，陰性對(duì)照不著色。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22軟件SSR法統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔藏羊肺組織結(jié)構(gòu)差異（見(jiàn)圖1、表1、表2）

由圖1可知，藏羊肺被覆漿膜，主要由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，富含彈性纖維。藏羊肺泡上皮主要以單層扁平上皮為主，肺泡隔中含大量毛細(xì)血管。

由表1可知，較高海拔藏羊肺被膜厚度與較低海拔藏羊比較差異不顯著（P>0.05），但較高海拔藏羊被膜中彈性纖維含量極顯著高于較低海拔藏羊（P<0.01）。

表1 不同海拔藏羊肺臟被膜厚度及彈性纖維含量比較Tab.1 Comparison of lung sac thickness and elastic fiber content of Tibetan sheep at different altitudes

表2 不同海拔藏羊肺泡及肺泡隔比較Tab.2 Comparison of alveolar and alveolar septum of Tibetan sheep at different altitudes

由表2可知，較高海拔藏羊與較低海拔藏羊肺泡大小、單位面積內(nèi)肺泡數(shù)量均無(wú)顯著差異（P>0.05），但較高海拔藏羊單位面積內(nèi)肺泡囊數(shù)量（1 mm2面積內(nèi)）、肺泡隔厚度、肺泡隔中毛細(xì)血管數(shù)量均顯著高于較低海拔藏羊（P<0.05）。

2.2 不同海拔藏羊肺臟中HIF-1α的表達(dá)差異（見(jiàn)圖2）

由圖2可知，HIF-1α蛋白在肺臟細(xì)支氣管黏膜表達(dá)強(qiáng)度較強(qiáng)，微動(dòng)脈內(nèi)皮也有表達(dá)，肺泡隔中有少量表達(dá)。HIF-1α在細(xì)胞中主要位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)，較高海拔藏羊肺臟中HIF-1α蛋白的表達(dá)量高于較低海拔藏羊。

3 討論

高原動(dòng)物在長(zhǎng)期自然進(jìn)化中為適應(yīng)高原低氧環(huán)境，在形態(tài)學(xué)及生理學(xué)方面均表現(xiàn)出一些不同于平原動(dòng)物的特點(diǎn)[7-8]，尤其以心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的變化較為明顯。低氧是高原生存的不利因素之一。HIF是氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的低氧應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用[9]，通過(guò)調(diào)控靶基因，產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，如增加紅細(xì)胞數(shù)量、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝等。常氧下HIF蛋白也有表達(dá)，但很快被細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解，只有在缺氧條件下才會(huì)穩(wěn)定表達(dá)[10]。動(dòng)物在缺氧環(huán)境中，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平可在短時(shí)間內(nèi)迅速上升，如牦牛[11]、藏雞[12]以及人類[13]等。肺被膜中豐富的彈性纖維可有效提高肺臟回縮力，有利于肺殘氣排出，提高肺通氣效率[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較高海拔藏羊和較低海拔藏羊肺表面被膜厚度無(wú)顯著差異，但肺被膜中彈性纖維含量較高海拔藏羊顯著多于較低海拔藏羊，可能與藏羊能適應(yīng)較高海拔有關(guān)。研究表明，肺泡中豐富的毛細(xì)血管可以顯著提高肺泡的交換效率[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較高海拔藏羊肺泡隔和肺泡隔中毛細(xì)血管含量顯著高于較低海拔藏羊。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1α蛋白大量分布于細(xì)支氣管黏膜上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，肺泡間隔有少量分布，且較高海拔藏羊中HIF-1α的表達(dá)顯著高于較低海拔藏羊，其參與調(diào)解低氧適應(yīng)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。