嚴(yán)憲才 吳志光 劉錦文 周耀輝 劉俊鋒 陳子良 （中山市中醫(yī)院急診科，中山528400）

膿毒癥是指有明確感染的全身炎癥反應(yīng)綜合征，發(fā)病率較高，且以每年1.5%～8.0%的速度增長(zhǎng)，病死率在37.4%～46.5%［1］。重癥膿毒癥表現(xiàn)為伴有器官功能障礙和/或組織灌注不足，若病情短期內(nèi)得不到有效逆轉(zhuǎn)，患者最終會(huì)因多臟器功能障礙死亡［2］。老年人機(jī)體功能退化，免疫力降低，抵御疾病能力較弱，老年重度膿毒病患者28 d病死率相對(duì)較高［3］。因此尋找預(yù)測(cè)老年重度膿毒病患者28 d病死風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，提前調(diào)整治療方案，對(duì)降低患者病死率意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）已被證實(shí)與人體組織的代謝、炎癥反應(yīng)以及膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有著不可分割的聯(lián)系［4］。微小RNA-10a（microRNA-10a，miR-10a）作為miRNA中的重要類型，參與炎癥、免疫應(yīng)答反應(yīng)等多種生物學(xué)過程［5］。微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）據(jù)報(bào)道是一種抗凋亡因子，與膿毒癥的急性腎損傷有關(guān)，影響患者生存期［6］。但miR-10a、miR-21在28 d病死與生存的老年重癥膿毒癥患者中的表達(dá)差異和其預(yù)測(cè)價(jià)值尚不清楚，因此本研究通過對(duì)比研究老年重癥膿毒癥患者外周血miR-10a、miR-21水平與老年重癥膿毒癥患者28 d病死率之間的關(guān)系，探究二者聯(lián)合對(duì)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的預(yù)測(cè)效能。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 回顧分析2017年6月至2019年10月于本院接受治療的102例老年重癥膿毒癥患者的臨床資料，其中男性55例，女性47例，年齡60～78歲，平均年齡（63.12±11.04）歲，身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）15.26～27.65 kg/m2，平 均BMI（21.66±3.85）kg/m2。治療措施：血管活性物質(zhì)干預(yù)24例，體外肺膜支持20例，連續(xù)性血液凈化35例，機(jī)械通氣輔助通氣27例，使用糖皮質(zhì)激素19例。原發(fā)感染部位：肺或呼吸道感染20例，泌尿系統(tǒng)感染26例，腹腔感染10例，中樞系統(tǒng)感染9例，血液感染25例，外科傷口感染5例，膽道感染7例。合并癥：合并糖尿病15例，高血壓24例，心肌損傷10例，燒傷4例，肝損傷10例，其中合并2項(xiàng)及以上7例。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①具有明確的感染，臨床癥狀和化驗(yàn)結(jié)果均符合膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②合并出現(xiàn)器官功能障礙如：嚴(yán)重急性呼吸綜合征（acute re‐spiratory distress syndrome，ARDS）、心功能不全、應(yīng)激性潰瘍、急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）、肝功能不全等；③年齡≥60歲；④臨床資料完整并同意調(diào)閱研究。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①處于瀕死狀態(tài)；②非細(xì)菌感染；③器官移植、非獲得性免疫缺陷癥、惡性腫瘤；④肝臟、腎臟、心臟疾病處于終末期；⑤妊娠或哺乳。

1.2 方法

1.2.1 分組 患者確診后28 d內(nèi)是否死亡為標(biāo)準(zhǔn)，將102例納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象分為2組，其中確診后28 d內(nèi)死亡患者為死亡組，確診后28 d未發(fā)生死亡的患者為生存組。

1.2.2 檢測(cè)外周血miR-10a、miR-21 所有患者于入院當(dāng)天采取清晨空腹外周靜脈血6 ml置于含有肝素?zé)o菌抗凝管（20 U/ml），密度梯度離心法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，利用UV-5800H型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA。采用CFX96型熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系共10μl：miS‐cript SYBR?Green Mix 5μl，cDNA（50 ng/μl）1μl，上下游引物（10μmo/lL）各0.5μl，ddH2O 3.0μl。反應(yīng)條件：95℃90 s，95℃30 s，63℃30 s，72℃15 s，45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)。采用2-??Ct法對(duì)血清miR-10a、miR-21表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。miR-10a、miR-21及內(nèi)參U6的引物序列見表1。

1.2.3 影響老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的危險(xiǎn)因素分析 將所有可能影響老人重癥膿毒癥患者確診后28 d內(nèi)死亡的影響因素歸納整理：性別、BMI、C反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）、血清乳酸、急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ評(píng)分［8］（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）、維生素D（vitamin，VitD）、治療措施、原發(fā)病、合并癥、miR-10a、miR-21，將其作為自變量（X）并賦值，賦值結(jié)果見表2，確診后28 d內(nèi)發(fā)生死亡記為1，未發(fā)生死亡記為0，分析影響老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的危險(xiǎn)因素。

1.2.4 觀察指標(biāo) ①分析影響老年重癥膿毒癥患者28 d內(nèi)死亡的影響因素及比值比（OR）；②評(píng)估m(xù)iR-10a、miR-21對(duì)老年重癥膿毒癥患者28 d內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用“例/率”表示，行χ2檢驗(yàn)，若理論頻數(shù)在1～5之間，采用校正χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用±s表示，行t檢驗(yàn)；Logistic回歸分析影響老年重癥膿毒癥患者28 d病死的危險(xiǎn)因素；Pearson法分析患者APACHEⅡ評(píng)分與外周血miR-10a和miR-21的相關(guān)性；受試者工作特征ROC曲線評(píng)估外周血miR-10a和miR-21表達(dá)水平預(yù)測(cè)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平比較 所有研究對(duì)象確診后28 d內(nèi)死亡患者29例（死亡組），存活患者73例（存活組），28 d病死率為28.43%。入院時(shí)死亡組外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平顯著高于存活組（P＜0.05），見表3。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

表2 老年重癥膿毒癥患者28 d病死率自變量賦值表Tab.2 Independent variable assignment of mortality rate in 28 d in elderly patients with severe sepsis

表3 2組外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平比較（xˉ±s）Tab.3 Comparison of expression levels of miR-10a and miR-21 in peripheral blood between two groups（xˉ ±s）

2.2 2 組不同臨床特征患者28 d死亡率對(duì)比 死亡組APACHEⅡ評(píng)分≥20分患者構(gòu)成比顯著高于存活組（P＜0.05），2組患者在CRP、血清乳酸、VitD水平和外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平分布上有差異（P＜0.05），其中死亡組CRP≥40 mg/L、血清乳酸≥3 mmo/lL、VitD＜20 ng/ml、miR-10a表達(dá)水平≥1.31、miR-21表達(dá)水平≥2.39者構(gòu)成比顯著高于存活組（P＜0.05），見表4。

2.3 Logistic回歸分析 經(jīng)過Logistic回歸分析可知，APACHEⅡ評(píng)分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3 mmo/lL、外周血miR-10a表達(dá)水平≥1.31、外周血miR-21表達(dá)水平≥2.39是老年重癥膿毒癥患者28 d病 死 的 獨(dú) 立 危 險(xiǎn) 因 素（OR=5.842、4.328、3.554、1.645、4.031），VitD＞26 ng/ml是老年重癥膿毒癥28 d病死的保護(hù)因素（OR=0.321），見表5。

2.4 APACHEⅡ評(píng)分與外周血miR-10a、miR-21的相關(guān)性分析 Pearson分析發(fā)現(xiàn)，APACHEⅡ評(píng)分與外周血miR-10a、miR-21無相關(guān)性（r=0.317、0.309，P=0.085、0.142）。

2.5 miR-10a、miR-21及聯(lián)合對(duì)老年重癥膿毒癥患者28 d死亡率的預(yù)測(cè)價(jià)值 根據(jù)外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的ROC曲線（圖1）可知，外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平的最佳截?cái)帱c(diǎn)為1.68、1.81，靈敏度分別為93.10%、82.75%、96.55%，特異度分別為73.97%、84.93%、90.41%，AUC分別為0.863、0.893、0.920，見表6。

表4 2組不同臨床特征患者28 d死亡率對(duì)比[n,(%）]Tab.4 Comparison of 28 d mortality of patients with different clinical characteristicsin group 2[n,(%）]

表5 Logistic回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis

表6 miR-10a、miR-21及聯(lián)合對(duì)老年重癥膿毒癥患者28 d死亡率的預(yù)測(cè)價(jià)值Tab.6 Predictive value of miR-10a，miR-21 and their combination on 28 d mortality in elderly patients with severe sepsis

圖1 miR-10a、miR-21及聯(lián)合預(yù)測(cè)ROC曲線Fig.1 Curve of miR-10a，miR-21 and combination pre?diction ROC

3 討論

miRNA在人體中的表達(dá)異?？梢鹉承┘膊〉陌l(fā)生和發(fā)展［11-12］。miRNA不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡有關(guān)，還參與異常的機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程［13］。膿毒癥是由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)患者器官發(fā)生衰竭，病情兇險(xiǎn)，死亡率高，因此迫切需要生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率，協(xié)助判斷預(yù)后。既往研究證明，miR-21與膿毒癥的發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)，但是有關(guān)miR-10a在膿毒癥患者中的表達(dá)研究鮮有，同時(shí)二者與老年重癥膿毒癥患者28 d死亡率之間的關(guān)系尚未闡明，是否可以作為預(yù)測(cè)其預(yù)后的標(biāo)志物，是一項(xiàng)值得探討的課題［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，患者28 d病死率為28.43%，入院時(shí)死亡組外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平顯著高于存活組，說明外周血miR-10a、miR-21的高表達(dá)與老年重癥膿毒癥28 d病死率有關(guān)，外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平影響患者病情發(fā)展?；翡J等［9］研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥所致腎損傷患者28 d病死率為35.53%，本研究與之有一定差距，可能由于本研究所選研究對(duì)象高齡、發(fā)展到嚴(yán)重時(shí)期時(shí)已確診為膿毒癥的原因使其成為重點(diǎn)防護(hù)對(duì)象，治療更確切，從而病并且還發(fā)現(xiàn)死亡患者血清中miR-10a-5p表達(dá)水平升高，本研究與之一致，說明外周血中miR-10a水平對(duì)膿毒癥患者28 d病死率影響較大。WANG等［15］發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者體內(nèi)miR-21表達(dá)升高，且經(jīng)過體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)miR-21升高直接加重腎小球的濾過屏障功能的損傷，說明miR-21的高表達(dá)可能與膿毒癥患者的病情有關(guān)。

本研究中經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，外周血miR-10a表達(dá)水平≥1.31、外周血miR-21表達(dá)水平≥2.39、APACHEⅡ 評(píng)分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3 mmo/lL是老年重癥膿毒癥患者28 d病死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，VitD＞26 ng/ml是老年重癥膿毒癥28 d病死的保護(hù)因素。研究報(bào)道［16］，APACHEⅡ評(píng)分是膿毒癥患者28 d死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，APACHEⅡ評(píng)分≥19.5分的膿毒癥患者，28 d病死率顯著上升，說明病情越嚴(yán)重患者死亡風(fēng)險(xiǎn)越高，需在患者入院治療時(shí)及時(shí)進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分，根據(jù)其是否存在高病死風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)采取有效干預(yù)措施。同時(shí)，臨床上高齡（一般認(rèn)為≥70歲）患者通常合并基礎(chǔ)病較多，多器官功能障礙，免疫力低下，患病期間的病死率也相應(yīng)上升，因此年齡≥70歲的患者應(yīng)注意全面治療，避免手術(shù)干預(yù)［17］。CRP可以避免淋巴細(xì)胞過度活化，代償性降低炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，CRP含量升高，表明機(jī)體炎癥反應(yīng)較高［18］。覃小蘭等［19］研究報(bào)道，CRP是老年肺部感染致膿毒癥患者28 d死亡的危險(xiǎn)因素，提示應(yīng)及時(shí)觀測(cè)CRP水平，做好防治工作。據(jù)報(bào)道［20］，感染風(fēng)險(xiǎn)增加與VitD缺乏有關(guān)，VitD可作用于T細(xì)胞抑制由Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提高重癥膿毒癥患者25（OH）D3的利用度，減輕炎癥反應(yīng)，降低死亡風(fēng)險(xiǎn)。陳隆旺等［21］研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥致病過程中miR-10a表達(dá)上調(diào)，抑制miR-10a的表達(dá)可以顯著提高調(diào)節(jié)T細(xì)胞的比例，促進(jìn)免疫功能，說明異常升高的miR-10a可能通過抑制機(jī)體免疫功能加快膿毒癥病情的發(fā)展，導(dǎo)致患者病死率上升。miR-21對(duì)人體有免疫調(diào)控功能，miR-21過表達(dá)會(huì)抑制TLR4信號(hào)通路，抑制機(jī)體免疫功能甚至免疫麻痹，最終導(dǎo)致患者死亡，提示外周血miR-21的過表達(dá)可能是導(dǎo)致老年重癥膿毒癥患者28 d病死率升高的原因［22］。

另外，本研究中APACHEⅡ評(píng)分與外周血miR-10a、miR-21無相關(guān)性，證實(shí)相互獨(dú)立。外周血miR-10a、miR-21聯(lián)合預(yù)測(cè)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的特異度、AUC均高于單獨(dú)預(yù)測(cè)，且靈敏度與單獨(dú)預(yù)測(cè)相近，提示二者聯(lián)合預(yù)測(cè)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的價(jià)值更高。綜上所述，確診后28 d病死的老年重癥膿毒癥患者外周血miR-10a、miR-21表達(dá)水平異常升高，與老年重癥膿毒癥患者28 d病死率有關(guān)，APACHEⅡ評(píng)分≥20分、CRP≥40 mg/ml、血清乳酸≥3mmo/lL、外周血miR-10a表達(dá)水平≥1.68、外周血miR-21表達(dá)水平≥1.81的老年重癥膿毒癥患者28 d病死風(fēng)險(xiǎn)增加，VitD≥26 ng/ml老年重癥膿毒癥患者28 d病死風(fēng)險(xiǎn)降低，miR-10a聯(lián)合miR-21用于預(yù)測(cè)老年重癥膿毒癥患者28 d病死率的效果較好，可作為預(yù)測(cè)其28 d病死率的有效標(biāo)志物。