劉向榮　聶含竹　黃皓麟　孔祥建　蔡川　劉威　劉開英　李輝　王萌　廖玲菲

〔摘要〕 目的 觀察口瘍防愈凝膠（Kouyang Fangyu gel， KFG）對放射性口腔炎的保護作用，并探討其機制。方法 將50只SD大鼠隨機分為空白對照組、輕度模型組、重度模型組、輕度模型+KFG治療組、重度模型+KFG治療組，每組10只。采用單次照射15 Gy和25 Gy X射線的方法分別建立輕度和重度口腔炎模型，并分別給予KFG藥物治療，連續(xù)7 d。于給藥前及給藥第3、5、7天時分別進行口腔黏膜炎癥評分，采用HE染色法觀察口腔黏膜病理變化，ELISA法檢測血清促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎性因子IL-10的水平，免疫組化法檢測黏膜TLR4、NF-κB表達。結(jié)果 輕度模型組口腔炎癥自愈性明顯，KFG不能明顯縮短其愈合時間;重度模型組口腔潰瘍面積及程度雖隨著時間推移有減輕趨勢，但在經(jīng)KFG治療后其評分快速下降，愈合明顯加快;KFG能夠改善重度口腔炎模型大鼠口腔黏膜病理形態(tài)，降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量（P<0.05或P<0.01），升高IL-10水平（P<0.05），并抑制黏膜TLR4和NF-κB蛋白的表達（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 KFG對于重度放射性口腔炎有明顯的治療作用，其機制可能與抑制口腔黏膜TLR4/NF-κB信號通路，進而調(diào)節(jié)炎癥因子水平有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 放射性口腔炎;口瘍防愈凝膠;口腔黏膜;炎癥因子;TLR4/NF-κB信號通路

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.011

〔Abstract〕 Objective To observe the protective effect of Kouyang Fangyu gel （KFG） on radiation stomatitis and explore its mechanism. Methods 50 SD rats were randomly divided into the blank control group， the mild model group， the severe model group， the mild model + KFG treatment group， the severe model + KFG treatment group， with 10 rats in each group. A single exposure to 15 Gy and 25 Gy X-rays were used to establish mild and severe stomatitis models， respectively， and KFG drug treatment was given for 7 consecutive days. Oral mucosal inflammation scores were taken before and at 3rd， 5th， and 7th days after administration. HE staining was used to observe the pathological changes of oral mucosa. ELISA kit was used to detect the levels of serum pro-inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-6 and anti-inflammatory factor IL-10， and immunohistochemical method was used to detect mucosal TLR4， NF-κB expression. Results In the mild model group， oral inflammation was obvious self-healing， and KFG could not shorten the healing time. The area and extent of oral ulcers in the severe model group tended to decrease over time， their scores decreased rapidly after healing with KFG， and healing was significantly accelerated. Meanwhile， KFG could improve the pathological morphology of oral mucosa in rats with severe stomatitis， reduce serum TNF-α， IL-1β， IL-6 levels （P<0.05 or P<0.01）， increase IL-10 level （P<0.05）， and inhibit the expression of TLR4 and NF-κB proteins in the mucosa （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion KFG has a significant therapeutic effect on severe radiation stomatitis， and its mechanism may be related to the inhibition of the TLR4/NF-κB signaling pathway in the oral mucosa and thus to regulate of inflammatory factor levels.

〔Keywords〕 radiation stomatitis; Kouyang Fangyu gel; oral mucosa; inflammatory factors; TLR4/NF-κB signaling pathway

頭頸部腫瘤是臨床常見腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的8%，手術(shù)及放化療是其主要治療手段[1]。流行病學數(shù)據(jù)顯示，約70%頭頸部惡性腫瘤患者接受過放療，其中鼻咽癌對射線敏感度高，放療一直是其首選治療方法[2]。然而，連續(xù)性地放療對機體產(chǎn)生的不良反應不容忽視，在頭頸部腫瘤患者放療的系列不良反應中，口腔黏膜炎發(fā)生率占比高達85%，其中嚴重病例占比31%，嚴重影響患者的治療舒適度及生活質(zhì)量，甚至成為少部分患者中斷治療的重要因素[3]。

放射性口腔炎屬于中醫(yī)學“口瘡”“嗌腫”“喉痹”等范疇，因放療致火熱內(nèi)蘊，傷陰灼津，口腔黏膜易受熱毒攻擊，誘發(fā)口腔炎癥，治療當以清熱解毒、養(yǎng)陰生津[4]?？诏兎烙z（KFG）為常德市第一中醫(yī)醫(yī)院（湖南中醫(yī)藥大學附屬常德醫(yī)院）的院內(nèi)制劑，臨床應用多年，主要用于防治各種急慢性放射性口腔炎，總有效率在80%以上[5]。然而，其基礎研究開展緩慢，本研究旨在觀察KFG對不同程度放射性口腔炎模型動物的作用效果，并探討其潛在作用機制，以期為其臨床應用提供充分的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，50只，體質(zhì)量為200～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房，使用許可證號為SYXK（湘）2019-0009。

1.2? 藥物

口瘍防愈凝膠是在常德市第一中醫(yī)醫(yī)院（湖南中醫(yī)藥大學附屬常德醫(yī)院）名老中醫(yī)個人經(jīng)驗方口瘍防愈方（基本處方組成：生石膏30 g，蘆根30 g，大青葉20 g，生地黃10 g，玄參10 g，牡丹皮10 g，赤芍10 g，蜂膠10 g，甘草5 g）的基礎上，從湯劑逐步改良研制的現(xiàn)代中藥復方凝膠劑型（20 g/支），由本院藥劑科統(tǒng)一生產(chǎn)，質(zhì)量安全，行裝穩(wěn)定，臨床應用多年，療效顯著[5]。

1.3? 主要試劑與儀器

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）（貨號H052-2）、白介素1β（interleukin 1β， IL-1β）（貨號H002-2）、白介素6（interleukin 6， IL-6）（貨號H007-1）、白介素10（interleukin 10， IL-10）（貨號H009-1）試劑盒購自南京建成生物公司;兔抗大鼠Toll樣受體-4（toll like receptor-4， TLR4）（貨號ab22048）、核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）（貨號ab32360）多克隆抗體均購自英國Abcam公司;蘇木素、伊紅、DAB顯色試劑盒、山羊抗兔二抗均購自武漢博士德公司。X射線輻照儀購自美國Precision X-ray公司;組織切片機購自美國Thermo公司;倒置熒光顯微鏡購自德國Zeiss公司。

1.4? 動物分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為5組，分別為空白對照組、輕度模型組、重度模型組、輕度模型+KFG治療組、重度模型+KFG治療組，每組10只。采用10%的水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，取仰臥位，將四肢固定，平放于X射線輻照儀上，所能接受照射范圍為大鼠雙耳前連線前方的頭部，撐開大鼠口腔并用鉛皮保護頰部以外的頭部區(qū)域，輻射劑量率為5 Gy/min。根據(jù)前期預實驗結(jié)果，采用單次照射3 min（共15 Gy）的方法建立輕度口腔炎模型，單次照射5 min（共25 Gy）建立重度口腔炎模型，空白對照組只麻醉不輻射。造模完成后24 h，對大鼠進行口腔炎癥評分，治療組在評分完成后給藥，將口瘍防愈凝膠均勻涂抹在大鼠頰部受輻射黏膜處，模型組和空白對照組在同部位涂抹空白凝膠，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.5? 口腔炎癥評分

參照Parkins等[6]建立的口腔炎癥評分標準進行評分，主要依據(jù)頰部口腔黏膜的變化及是否出現(xiàn)紅斑（充血）、糜爛、潰瘍等主要體征，評分值為黏膜發(fā)紅及潰瘍情況得分總和。在給藥前及給藥第3、5、7天后分別進行評分，評分由兩名不了解實驗方案的口腔專業(yè)研究生完成。評分標準見表1。

1.6? HE染色法觀察口腔黏膜病理變化

在末次評分完成后，取出大鼠左右頰黏膜組織固定于4%多聚甲醛溶液中，固定充分后，梯度乙醇-二甲苯脫水透明，充分浸蠟包埋，連續(xù)切片，烘干后脫蠟，置于蘇木素-伊紅溶液中染色，染色完成后水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。待樹膠干后置于顯微鏡下觀察組織病理改變情況。

1.7? ELISA法檢測血清炎癥因子含量

將大鼠血液收集于促凝管中，靜置2 h后離心，分離上清液保存。按照ELISA試劑盒說明書進行實驗，根據(jù)標準曲線求出各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量。

1.8? 免疫組化法檢測黏膜TLR4、NF-κB表達

將口腔黏膜石蠟切片脫蠟、水化，用0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原熱修復，PBS水洗，滴加山羊血清封閉液，室溫孵育30 min，加相應一抗（1∶100）孵育過夜;PBS洗3次，反應增強液孵10 min，二抗（1∶200）孵10 min;沖洗，DAB染色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，封片。將切片置于顯微鏡下進行拍攝，并采用Image-Pro Plus軟件分析積分光密度值（IOD）。

1.9? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布、方差齊性，采用單因素方差分析，同時用LSD檢驗進行組間比較。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，則用Kruskal-Wallis H檢驗。計量數(shù)據(jù)用“x±s”表示，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1? KFG對口腔黏膜炎癥評分的影響

輕度口腔炎模型大鼠口腔黏膜有一定程度發(fā)紅，潰瘍集中于一側(cè)，面積較小呈點狀分布，隨著時間推移，潰瘍數(shù)量及面積減少，黏膜無明顯腫脹，有較明顯的愈合趨勢;KFG治療組口腔評分先上升后下降，較模型組無顯著差異。重度口腔炎模型組大鼠頰黏膜呈深紅色，形成大面積潰瘍，核心區(qū)域糜爛，7 d后潰瘍面積稍微減少，仍可見明顯的黏膜潰爛;KFG治療后，隨治療時間延長口腔炎癥評分顯著下降，5 d時較治療前及模型組均有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01），治療7 d后未見黏膜潰爛，僅有少數(shù)小面積潰瘍，顏色淺紅或正常，部分大鼠黏膜炎癥完全消失。結(jié)果見表2。

2.2? KFG對口腔黏膜組織形態(tài)的影響

空白對照組大鼠口腔黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊，無毛細血管擴張;輕度模型組上皮層有部分細胞壞死、脫落，明顯變薄，但連續(xù)性仍較完整，黏膜下層可見輕微的毛細血管擴張及炎性細胞浸潤現(xiàn)象，經(jīng)KFG治療后上皮層逐漸恢復正常，無明顯毛細血管擴張充血現(xiàn)象;重度模型組黏膜上皮層處于崩解狀態(tài)，大量細胞脫落消失，連續(xù)性差，下層可見大量炎性細胞浸潤，經(jīng)KFG治療后黏膜上皮連續(xù)性變好，結(jié)構(gòu)基本完整，下層有輕微毛細血管擴張及少數(shù)炎性浸潤。結(jié)果見圖1。

2.3? KFG對血清炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較，輕度模型組血清TNF-α及IL-1β含量顯著升高（P<0.05），IL-6含量升高、IL-10含量下降，但兩者均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），重度模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），IL-10含量顯著下降（P<0.05）。KFG治療后，能顯著降低重度口腔炎大鼠促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量（P<0.05），但對抗炎因子IL-10含量無明顯影響（P>0.05），對輕度口腔炎大鼠血清各炎癥因子表達水平均無統(tǒng)計學影響（P>0.05）。結(jié)果見表3。

2.4? KFG對口腔黏膜TLR4、NF-κB表達的影響

與空白對照組比較，輕、重度口腔炎模型大鼠口腔黏膜TLR4、NF-κB陽性表達均增加（P<0.05或P<0.01），其中重度模型組增加更為顯著。分別經(jīng)KFG干預后，重度模型組TLR4、NF-κB表達均降低（P<0.05或P<0.01），但對輕度模型組作用不明顯（P>0.05）。結(jié)果見表4、圖2。

3 討論

放射性口腔炎是頭頸部腫瘤患者放療過程中最常見的不良反應，受機體狀態(tài)及治療周期的影響，患者會出現(xiàn)輕、重不同程度的口腔炎癥，其中重度占比超過30%，主要表現(xiàn)為黏膜上皮層完整性破壞，毛細血管擴張、充血而形成紅斑，黏膜潰爛，嚴重者黏膜會永久性壞死而需手術(shù)修復[7]。放射性口腔炎的發(fā)病機制目前主要包括口腔黏膜上皮細胞損傷、血管內(nèi)皮損傷、T淋巴細胞亞群改變等方面[8]。本研究根據(jù)前期預實驗結(jié)果，采用不同輻射劑量的X射線輻射分別建立輕、重度口腔炎癥大鼠模型，經(jīng)觀察黏膜狀態(tài)及炎癥評分證實模型建立成功;進一步觀察黏膜組織病理形態(tài)發(fā)現(xiàn)，輕度模型組黏膜上皮層部分細胞壞死脫落，但連續(xù)性較完整，下層可見輕微的毛細血管擴張及炎性細胞浸潤現(xiàn)象，重度模型組上皮層崩解，大量細胞脫落消失，連續(xù)性差，下層可見大量炎性細胞浸潤，與臨床疾病特征類似。

放射性口腔炎的疾病進程與炎癥因子的水平密切相關(guān)，重度潰瘍患者血清炎癥因子含量較輕度患者明顯升高[9]。Moslemi D等[10]研究表明，炎癥因子的含量與口腔黏膜潰瘍面積和潰瘍數(shù)目呈正相關(guān)。TNF-α是一種常見的促炎癥因子，主要由活化的T細胞產(chǎn)生，為黏膜受損時機體最早作出應答的介質(zhì)之一，其能通過與另一種促炎因子IL-1β協(xié)同觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應，誘導IL-6等多種炎癥因子的產(chǎn)生[11-12]。IL-6被認為是與口腔黏膜炎癥嚴重程度最為相關(guān)的炎癥因子，其含量與炎癥評分值呈顯著正相關(guān)[13]。IL-10作為重要的抗炎性細胞因子，調(diào)控機體對外源致病物質(zhì)的免疫和炎癥應答。IL-10能抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的生成，減輕炎癥反應，保護黏膜組織[14]?？谇粷兓颊哐逯蠭L-10水平較正常人低[15]。

TLR4/NF-κB信號通路是體內(nèi)重要的炎癥調(diào)節(jié)通路。TLR4是與機體固有免疫相關(guān)的一組受體，在巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞等多種細胞中有表達，能夠識別脂多糖、細菌細胞壁等多種配體[16]。在TLR4與相應配體結(jié)合后，可以激活下游NF-κB信號通路，誘發(fā)炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）的分泌，導致機體炎癥產(chǎn)生[17]。研究表明，TLR4/NF-κB介導口腔鱗癌細胞分泌炎癥因子并促進其增殖，抑制該信號能夠促進癌細胞凋亡[18]，但TLR4/NF-κB信號通路是否參與放射性口腔黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，尚未見報道。

中醫(yī)認為，放射線屬火毒，最易傷及津液，陰津虧虛則虛火內(nèi)生，內(nèi)外熱邪交熾，積于血分的邪熱搏血為瘀，血脈壅阻、血行不暢，瘀血產(chǎn)生致使陰液損耗更多，火毒熾盛，灼傷于黏膜致疾病發(fā)生。因此，放射性口腔炎關(guān)鍵病機可以用“熱、毒、瘀”概括，治當以解毒化瘀、養(yǎng)陰生津。KFG是在口瘍防愈方基礎上，由傳統(tǒng)湯劑改良的現(xiàn)代凝膠制劑。方中生石膏、蘆根清氣分實熱，為君藥，大青葉清熱解毒利咽，生地黃、玄參不僅助君藥清實熱，兼能養(yǎng)陰生津清虛熱，牡丹皮、赤芍活血祛瘀，五者共為臣藥，蜂膠、甘草調(diào)和諸藥，為佐使藥，全方共奏清熱解毒、養(yǎng)陰生津、祛瘀化濁之功。在改進劑型后，增加了藥物在口腔黏膜的接觸時間，有效成分持續(xù)釋放，有助于促進創(chuàng)面修復，同時也更加便于用藥。本研究通過干預輕、重度放射性口腔炎大鼠發(fā)現(xiàn)，KFG對于重度口腔炎癥有很好的治療作用，能夠明顯縮減黏膜潰爛面積，改善黏膜上皮細胞脫落、連續(xù)性差、炎性浸潤等病理狀態(tài)。同時，KFG能夠顯著抑制促炎癥因子水平，降低黏膜TLR4、NF-κB蛋白的陽性表達，提示KFG的作用機制可能與抑制口腔黏膜TLR4/NF-κB通路，進而調(diào)節(jié)炎癥因子水平有關(guān)。本研究從動物層面明確了KFG的治療特點及潛在作用機制，今后將結(jié)合臨床實驗數(shù)據(jù)，為本藥物的開發(fā)及推廣提供助力。

參考文獻

[1] 中國臨床腫瘤學會指南工作委員會.中國臨床腫瘤學會（CSCO）鼻咽癌診療指南[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2020：22.

[2] FERLAY J， SOERJOMATARAM I， DIKSHIT R， et al. Cancer incidence and mortality worldwide： Sources， methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. International Journal of Cancer， 2015， 136（5）： E359-E386.

[3] VERA-LLONCH M， OSTER G， HAGIWARA M， et al. Oral mucositis in patients undergoing radiation treatment for head and neck carcinoma[J]. Cancer， 2006， 106（2）： 329-336.

[4] 謝? 靖，盛? 沛，李? 博，等.放射性口腔黏膜炎的發(fā)病機制及中西醫(yī)防治研究進展[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2019，35（3）：338-343.

[5] 聶含竹.口瘍防愈凝膠治療頭頸部腫瘤急性放射性口腔炎的臨床效果觀察[J].當代護士（下旬刊），2016（10）：99-100.

[6] PARKINS C S， FOWLER J F， YU S. A murine model of lip epidermal/mucosal reactions to X-irradiation[J]. Radiotherapy and Oncology， 1983， 1（2）： 159-165.

[7] MIYAMOTO H， KANAYAMA T， HORII K， et al. The relationship between the severity of radiation-induced oral mucositis and the myeloperoxidase levels in rats[J]. Oral Surgery， Oral Medicine， Oral Pathology and Oral Radiology， 2015， 120（3）： 329-336.

[8] 陸? 葉，沈紅梅.放射性口腔炎的治療進展[J].臨床與病理雜志， 2017，37（6）：1269-1275.

[9] GRUBER S， BOZSAKY E， ROITINGER E， et al. Early inflammatory changes in radiation-induced oral mucositis[J]. Strahlentherapie Und Onkologie， 2017， 193（6）： 499-507.

[10] MOSLEMI D， NOKHANDANI A M， OTAGHSARAEI M T， et al. Management of chemo/radiation-induced oral mucositis in patients with head and neck cancer： A review of the current literature[J]. Radiotherapy and Oncology： Journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology， 2016， 120（1）： 13-20.

[11] 項冰倩，何金波，高? 慧，等.右美托咪啶對肺缺血/再灌注損傷大鼠促炎介質(zhì)IL-1β、TNF-α水平的影響及其機制[J].中國應用生理學雜志，2017，33（5）：415-419.

[12] SAND F L， THOMSEN S F. Efficacy and safety of TNF-α inhibitors in refractory primary complex aphthosis： A patient series and overview of the literature[J]. The Journal of Dermatological Treatment， 2013， 24（6）： 444-446.

[13] LEGERT K G， TSILINGARIDIS G， REMBERGER M， et al. The relationship between oral mucositis and levels of pro-inflammatory cytokines in serum and in gingival crevicular fluid in allogeneic stem cell recipients[J]. Supportive Care in Cancer： Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care in Cancer， 2015， 23（6）： 1749-1757.

[14] MAEHARA T， FUJIMORI K. Contribution of FP receptors in M1 macrophage polarization via IL-10-regulated nuclear translocation of NF-κB p65[J]. Biochimica et Biophysica Acta Molecular and Cell Biology of Lipids， 2020， 1865（5）： 158654.

[15] 馬金昀，徐玲霞，楊? 月，等.復發(fā)性口腔潰瘍癥狀積分與炎性細胞因子的相關(guān)性及加味黃連甘草湯的治療作用[J].上海中醫(yī)藥大學學報，2017，31（1）：18-23.

[16] FONCECA A M， ZOSKY G R， BOZANICH E M， et al. Accumulation mode particles and LPS exposure induce TLR-4 dependent and independent inflammatory responses in the lung[J]. Respiratory Research， 2018， 19（1）： 15.

[17] JING N S， LI X N. Dihydromyricetin attenuates inflammation through TLR4/NF-kappaB pathway[J]. Open Medicine （Warsaw， Poland）， 2019， 14： 719-725.

[18] HAN S W， XU W G， WANG Z Y， et al. Crosstalk between the HIF-1 and Toll-like receptor/nuclear factor-κB pathways in the oral squamous cell carcinoma microenvironment[J]. Oncotarget， 2016， 7（25）： 37773-37789.