威則日沙，劉 哲，蘭建龍，趙雪蓮，海來約布，張紹山，楊正明*，劉 圓

1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041

2.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041

3.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術(shù)工程實驗室，四川 成都 610225

4.青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225

5.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041

七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.為百合科重樓屬植物，是歷版《中國藥典》收載的2種基原藥材“重樓”的來源之一，以重樓皂苷I、重樓皂苷II和重樓皂苷VII總含量為其質(zhì)量評價指標[1]。重樓甾體皂苷是重樓中含有的主要活性成分，具有抗腫瘤、消炎、止血、抗菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管生成、保護肝臟與腎臟作用[2-3]。重樓是珍稀瀕危名貴傳統(tǒng)藥材，過度采挖已使其野生資源瀕臨滅絕，人工栽培是解決滇重樓資源危機的必然途徑。

近十多年來，重樓種植已成規(guī)模，種植面積不斷擴大，肥料施用不均衡會導致重樓根莖品質(zhì)下降[4]，探討氮、磷、鉀肥配施對七葉一枝花的質(zhì)量的影響，可以為七葉一枝花的生態(tài)種植提供科學依據(jù)。目前，關(guān)于氮、磷、鉀配施對重樓活性成分影響的研究主要以滇重樓為主，相關(guān)研究[5-9]結(jié)果表明，合理施用氮、磷、鉀肥可提高滇重樓的產(chǎn)量和品質(zhì)，土壤肥力是影響滇重樓質(zhì)量的重要因素。不同植物對氮、鉀、磷的需求比例不同，單一微肥量過高或過低對藥材植物生長發(fā)育、藥效成分的積累及藥材質(zhì)控標準均有影響，并且元素量單一化容易使土壤惡化[4-6,10]，因此適宜的氮、磷、鉀肥配施是藥用植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要基礎(chǔ)。本實驗采用3因素5水平二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法，采用UPLC-ELSD法測定20個小區(qū)的七葉一枝花中重樓皂苷I等7種甾體皂苷含量，探討氮、磷、鉀配施對七葉一枝花中皂苷類成分含量的影響，以期為規(guī)范化七葉一枝花的生態(tài)栽培提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC?超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；METTLER AE240電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-5200E型超聲波清洗器（40 kHz、250 W，昆山超聲儀器有限公司）；ProElut C18反相硅膠鍵合固相萃取柱（200 μg，北京迪科馬科技有限公司）。

重樓皂苷I（批號MUST-19053105）、重樓皂苷II（批號MUST-18103104）、重樓皂苷V（批號MUST-19052102）、重樓皂苷VI（批號MUST-180717002）、重樓皂苷VII（批號MUST-18062201）、重樓皂苷H（批號MUST-19040101）、纖細薯蕷皂苷（批號MUST-15081110）均購自成都曼斯特生物有限公司，質(zhì)量分數(shù)大于98%。乙腈為色譜純（美國Sigma公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑為分析純。

1.2 材料

以四川省汶川縣水磨鎮(zhèn)白石村西南民族大學重樓仿野生繁育試驗基地人工栽種七葉一枝花為試驗材料，經(jīng)西南民族大學劉圓教授鑒定為百合科（Liliaceae）重樓屬ParisL.植物七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.，洗凈，50 ℃烘干，粉碎，過篩（3號篩），備用。

供施肥料為尿素（總氮≥46.4%，四川宏泰生化有限公司公司）、過磷酸鈣（P2O5≥12%，四川省成都市青白江區(qū)磷肥廠）、硫酸鉀（K2O≥60%，國投新疆羅布泊鉀鹽有限責任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 田間試驗設(shè)計

田間試驗設(shè)計見課題組前期報道[11]，試驗地位于四川省汶川縣水磨鎮(zhèn)白石村西南民族大學重樓仿野生繁育試驗基地。試驗地土壤肥力狀況：pH值為7.50；有機質(zhì)為32.36 mg/kg；堿解氮為158.67 mg/kg；速效磷為51.67 mg/kg；速效鉀為236.71 mg/kg。試驗因素為氮肥（X1）、磷肥（X2）、鉀肥（X3），采用3因素5水平二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法，共20個處理，20個小區(qū)隨機安排于試驗地中（試驗小區(qū)面積為16 m2）。試驗因素和水平編碼見表1。二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計與試驗方案見表2。

表1 因素水平編碼Table 1 Code of factor levels

表2 試驗設(shè)計與實施方案Table 2 Experimental design and implementation of programs

2.2 七葉一枝花中7種皂苷含量測定

2.2.1 色譜條件 參照張紹山等[12]、劉哲等[13]重樓皂苷含量測定方法，已優(yōu)化分離條件。ACQUITY UPLC?HSS C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；分析時間23 min；進樣量2 μL；ELSD檢測器：增益500，冷卻模式，漂移管溫度55 ℃，氮氣壓力276 kPa；柱溫40 ℃；體積流量0.2 mL/min；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序：0～23 min，10%～80%A?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻啡芤荷V圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和供試品溶液 (B) 溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed reference (A) and sample (B)

2.2.2 對照品溶液制備 取重樓皂苷VII、重樓皂苷H、重樓皂苷VI、重樓皂苷II、重樓皂苷V、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷I，精密稱定，色譜甲醇定容到10 mL量瓶中，分別得0.522 0、0.320 0、0.526 0、0.442 0、0.460 0、0.163 0、0.476 0 mg/mL對照品溶液，用時以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.2.3 供試品溶液制備 參考張紹山等[12]、劉哲等[13]的研究，取0.5 g七葉一枝花樣品粉末，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL甲醇，搖勻，靜置4 h，再超聲30 min，濾過，重復上述操作1次。合并2次濾液，45 ℃減壓旋蒸回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL，以0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量，稀釋到5 mL，配制成不同稀釋倍數(shù)的混合對照品溶液，進樣2 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制外標法標準曲線，結(jié)果見表3。

表3 對照品的線性回歸方程Table 3 Linear regression equation of reference

2.2.5 樣品測定 取七葉一枝花樣品粉末，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，以“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，外標法計算含量。20個小區(qū)七葉一枝花樣品的7個甾體皂苷含量見表4。

2.3 氮、磷、鉀配施對七葉一枝花的皂苷類成分的影響

2.3.1 數(shù)學模型建立 根據(jù)表4試驗結(jié)果，利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行回歸模型分析，結(jié)合矩陣模型，建立氮肥（X1）、磷肥（X2）、鉀肥（X3）與重樓皂苷VII含量的回歸數(shù)學模型Y1、重樓皂苷VI含量的回歸數(shù)學模型Y2、重樓皂苷H含量的回歸數(shù)學模型Y3、重樓皂苷II含量的回歸數(shù)學模型Y4、纖細薯蕷皂苷含量的回歸數(shù)學模型Y5、重樓皂苷I含量的回歸數(shù)學模型Y6、重樓皂苷V含量的回歸數(shù)學模型Y7。用F檢驗法分別檢驗方程各項回歸系數(shù)、方程總回歸系數(shù)和失擬度，得到方差分析結(jié)果見表5。

表4 樣品中7種皂苷含量Table 4 Contents of seven saponins

表5 氮、磷、鉀肥與皂苷的方差分析Table 5 Analysis of variance of NPK fertilizer and saponins

通過方差分析所得方程經(jīng)F檢驗，F(xiàn)1R＝35.991 93，F(xiàn)1Lf＝0.510 26，即FR顯著，F(xiàn)Lf不顯著，說明二次回歸方程擬合得較好，其可靠程度較高。其中一次項X1、X2、X3均達到顯著，二次項X12、X22、X32達到顯著水平，交互項均未達到顯著；F2R＝17.574 89，F(xiàn)2Lf＝1.970 45，即FR顯著，F(xiàn)Lf不顯著，說明二次回歸方程擬合得較好，其可靠程度較高。其中一次項X1、X2、X3均達到顯著，二次項X22、X32達到顯著水平，交互項中X1X2達到顯著；其余所得方程經(jīng)F檢驗，F(xiàn)R不顯著，F(xiàn)Lf顯著，說明二次回歸方程擬合不好，不能說明氮肥、磷肥、鉀肥對其他皂苷有影響。經(jīng)上述檢驗，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項后，得到簡化后的回歸方程：

2.3.2 因子主效應分析 根據(jù)表5中各項回歸系數(shù)的F值計算各因素對因變量的貢獻率[14]，可得各因素對試驗結(jié)果的影響效果，得到各因素對7種重樓皂苷的貢獻率見表6。氮、磷、鉀對7種重樓皂苷的貢獻率影響不同（表6）。按貢獻率從大到小排列得到各因素對重樓皂苷VII的影響為鉀＞氮＞磷，對重樓皂苷VI的影響為鉀＞磷＞氮，對重樓皂苷H的影響為磷＞氮，對重樓皂苷II的影響氮＞磷、鉀，對纖細薯蕷皂苷的影響為磷>氮、鉀，對重樓皂苷I的影響為鉀＞氮＞磷，對重樓皂苷V的影響為氮＞磷＞鉀。以上可以看出，氮、磷、鉀對不同重樓皂苷含量的影響效果不同，說明氮、磷、鉀配施可能對重樓皂苷的合成有影響。

表6 單因素貢獻率Table 6 Single factor contribution rate

2.3.3 單因素效應分析 通過降維處理，將磷、鉀肥2個因素固定在0水平，可得出單因素氮肥與（1）方程中重樓皂苷VII的影響方程：

同理可得磷肥、鉀肥與重樓皂苷VII之間的影響方程：

同上方法，將（2）方程進行降維處理可得出單因素對重樓皂苷VI的影響方程：

根據(jù)方程10～12得出Y1（重樓皂苷VII）單因素回歸方程效應影響圖，見圖2。

圖2 重樓皂苷VII單因素效應分析Fig.2 Polyphyllin VII single factor analysis

圖2可以看出，氮肥、磷肥、鉀肥對重樓皂苷VII影響整體呈上升的趨勢。在?1.681 8～0水平，各因素對重樓皂苷VII的影響順序為磷肥＞氮肥＞鉀肥；0～1.681 8水平，各因素對重樓皂苷VII的影響順序為鉀肥＞氮肥＞磷肥。在?1.681 8～1.681 8水平，氮肥、磷肥、鉀肥呈上升狀態(tài)，表明隨著肥力水平的增加重樓皂苷VII隨之增加。在設(shè)計的5個水平中過低、過高都會影響重樓皂苷VII的增加，氮肥、磷肥、鉀肥在1.681 8水平的氮、磷、鉀配施能顯著提高重樓皂苷VII。

根據(jù)公式方程13～15得出Y2（重樓皂苷VI）回歸方程效應影響圖，見圖3。

圖3 重樓皂苷VI單因素效應分析Fig.3 Polyphyllin VI single factor analysis

由圖3可見，氮肥、磷肥、鉀肥對重樓皂苷VI影響整體呈上升的趨勢，各因素對重樓皂苷VI的影響順序為鉀肥＞磷肥＞氮肥。在?1.681 8～?1水平之間，磷肥、鉀肥呈下降狀態(tài)，表明隨著肥力水平的增加重樓皂苷VI隨之減小。在?1～1.681 8水平之間，氮肥、磷肥、鉀肥呈上升狀態(tài)，表明隨著肥力水平的增加重樓皂苷VI隨之增加。在設(shè)計的5個水平中過低、過高都會影響重樓皂苷VI的增加，氮肥、磷肥、鉀肥在1.681 8水平的氮、磷、鉀配施能顯著提高重樓皂苷VI。

2.3.4 互作效應分析 試驗各因素之間不僅單獨對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響，還存在互作效應。X1X2對重樓皂苷VI影響顯著，X1X3對重樓皂苷VI影響極顯著。因此，有必要進一步探討氮-磷互作對重樓皂苷VI的影響。氮-磷互作效應和氮-鉀互作效應重樓皂苷VI的方程分別見（16）、（17）。

由圖4和圖5可以看出不同濃度的氮肥、磷肥和鉀肥都影響著重樓皂苷VI的提高，氮肥和磷肥的互作效應、氮肥和鉀肥的互作效應利于重樓皂苷VI的提高。氮肥和磷肥的互作效應在1水平到1.681 8水平施肥有利于重樓皂苷VI的提高，是理想的互作區(qū)間；氮肥和鉀肥的互作效應在1水平到1.681 8水平施肥有利于重樓皂苷VI的提高。

圖4 X1X2互作效應含量變化Fig.4 X1X2 interaction effect on content changes

圖5 X1X3互作效應含量變化Fig.5 X1X3 interaction effect on content changes

2.3.5 施肥方案的優(yōu)選 通過建立的產(chǎn)量回歸模型就能算出各重樓皂苷最高含量下氮、磷、鉀各最佳施用配方的理論值，因為考慮到實際生產(chǎn)過程溫度、濕度和光照等環(huán)境因素的影響，通過因子頻率計算得到一個合適的范圍，見表7。

各重樓皂苷最佳施肥范圍不同，但基本集中于0水平左右，取各重樓皂苷成分最佳施肥量范圍交集的結(jié)果，確定最優(yōu)施肥范圍為氮肥516.39～557.19 kg/hm2、磷肥2 771.70～2 848.20 kg/hm2、鉀肥461.61～502.65 kg/hm2。

3 討論

施肥是達到藥用植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要措施，合理的肥料配施不但能促進植物生長發(fā)育，提高藥材產(chǎn)量，還可以改善藥材品質(zhì)，對中藥材品質(zhì)保障及土壤環(huán)境保護有重要意義[15-16]。

科學合理的氮、磷、鉀肥配施對重樓藥材浸出物、總皂苷等含量積累均具有一定影響[11,17-18]。在本課題組實際研究中發(fā)現(xiàn)七葉一枝花中含有重樓皂苷VII、重樓皂苷H、重樓皂苷VI、重樓皂苷II、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷I、重樓皂苷V，與前人[19-22]研究相符；本實驗結(jié)果表明，氮、磷、鉀肥料配施對七葉一枝花的重樓皂苷VII、重樓皂苷VI含量有顯著影響；不同施肥處理下，除6、8、10、12和13號小區(qū)未能達到藥典規(guī)定重樓皂苷I、重樓皂苷II和重樓皂苷VII總量不得少于0.6%的要求，其余小區(qū)樣品均能滿足藥典規(guī)定。在試驗因素范圍內(nèi)氮、磷和鉀有利于七葉一枝花重樓皂苷VII含量的提高。重樓皂苷VII、重樓皂苷VI產(chǎn)量與氮、磷、鉀肥的配施的相關(guān)性均達顯著水平，當施用氮肥555.15～713.10 kg/hm2、磷肥2 542.20～3 376.20 kg/hm2、鉀肥523.05～660.90 kg/hm2時，重樓皂苷VII含量大于0.20 %；當施用氮肥516.45～673.50 kg/hm2、磷肥2771.85～3649.20 kg/hm2、鉀肥461.55～624.45 kg/hm2時，重樓皂苷VI含量大于0.09%。結(jié)合重樓皂苷V、Ⅳ、Ⅲ、II和I最高含量與氮、磷、鉀肥配施相關(guān)性的理論值，取交集得最佳氮、磷、鉀施肥范圍為氮肥516.39～557.19 kg/hm2、磷肥2 771.70～2 848.20 kg/hm2和鉀肥461.61～502.65 kg/hm2。

表7 各皂苷成分含量最優(yōu)施肥量Table 7 Optimum NPK application for high contents of saponins

本研究結(jié)果得出方案可為七葉一枝花的提高質(zhì)量的栽培提供理論依據(jù)，也為實際生產(chǎn)中提高七葉一枝花的品質(zhì)，對指導七葉一枝花野生資源人工移植馴化提供一定的參考，為七葉一枝花專用配方肥的進一步研制提供理論依據(jù)。并且說明在一定條件下，土壤因子的養(yǎng)分含量適當，重樓皂苷的含量越高，七葉一枝花的質(zhì)量越好。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突