吳 威，劉世禹，王詩語，秦路平，朱 波

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402

白術(shù)系菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，是著名藥材“浙八味”之一，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效[1]。白術(shù)為常用補(bǔ)益類中藥，俗有“北參南術(shù)”“十方九術(shù)”之說，《黃帝內(nèi)經(jīng)》將其列為上品。白術(shù)在我國安徽、浙江、河南、湖南、四川等大部分地區(qū)都有栽培，其質(zhì)量以浙江於潛白術(shù)為最佳，又稱“於術(shù)”[2]?，F(xiàn)代化學(xué)與藥理學(xué)研究表明，白術(shù)富含多糖、倍半萜、甾醇、有機(jī)酸等活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[3]。

根腐病是白術(shù)常見病害，發(fā)生率在30%左右，嚴(yán)重時(shí)達(dá)60%～70%，甚至絕收，是白術(shù)生產(chǎn)發(fā)展的主要障礙之一[4]。白術(shù)根腐病是由多種病原菌復(fù)合侵染所致，主要致病菌包括尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、茄病鐮刀菌F.solani、半裸鐮刀菌F.incarnatum等[5]。目前，對于白術(shù)根腐病的防治主要集中在栽培管理以及化學(xué)防治，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境及抗藥性等缺點(diǎn)[6]。

內(nèi)生細(xì)菌是指生活在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙并且不會(huì)造成宿主植物明顯病癥的細(xì)菌，由于植物內(nèi)生細(xì)菌與病原菌生態(tài)位相似，而且使用內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害不會(huì)造成環(huán)境污染，因此采用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病害防治具有較好的應(yīng)用前景[7]。如林星辰等[8]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌B69可以高效定殖在人參根部組織，并且對人參根腐病有良好的防治效果，防治效果達(dá)到58.56%。荊卓瓊等[9]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensHZ-6-3可以很好地防控番茄灰霉病。本研究從健康白術(shù)根、莖、葉和根莖中分離篩選得到能拮抗白術(shù)根腐病菌的內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)一步用盆栽試驗(yàn)明確拮抗細(xì)菌的生防效果，并進(jìn)行菌種鑒定，為應(yīng)用內(nèi)生細(xì)菌防治白術(shù)根腐病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

2019年9 月～10月，采集浙江磐安、浙江於潛，河南溫縣，湖南平江新鮮白術(shù)健康植株，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張巧艷教授鑒定為菊科白術(shù)A.macrocephala。白術(shù)病原菌尖孢鐮刀菌F.oxysporum和茄病鐮刀菌F.solani由浙江農(nóng)林大學(xué)陳杰教授惠贈(zèng)，半裸鐮刀菌F.incarnatum（CGMCC：3.14008）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

2 方法

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

取白術(shù)組織（根、莖、葉、根莖），自來水洗凈，無菌濾紙吸干水分后，用3步消毒法進(jìn)行表面滅菌[10]。將白術(shù)組織塊放入無菌研缽中，加入石英砂和20 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），充分研磨，取上清液100 μL涂布于瓊脂培養(yǎng)基（NA）培養(yǎng)基，置于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。取最后一次漂洗液100 μL涂布于NA培養(yǎng)基作為對照組，于相同環(huán)境下暗培養(yǎng)，檢驗(yàn)表面消毒是否徹底，試驗(yàn)平行3次。采用劃線法對白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行純化，直至分離得到單一菌落。

2.2 抗根腐內(nèi)生細(xì)菌篩選

用打孔器在病原菌菌落邊緣打取直徑為0.6 cm的菌餅，接種在馬鈴薯葡萄糖瓊培養(yǎng)基中央，用接種針挑取細(xì)菌在距離中心點(diǎn)2.5 cm處劃線，以只接種病原菌的平板為對照組，置于28 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中暗環(huán)境培養(yǎng)5～7 d，將有抑菌作用的細(xì)菌標(biāo)記為“＋”，無抑菌作用的標(biāo)記為“－”，試驗(yàn)平行3次[11]。挑取對3種病原菌均有抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌到NB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，28 ℃，180 r/min，調(diào)整菌液濃度至1×107cfu/mL。將病原菌菌餅放置于PDA培養(yǎng)基中心，將直徑為0.6 cm的3張圓形無菌濾紙放置于距PDA中心2.5 cm處。滴加菌液濃度為1×107cfu/mL拮抗細(xì)菌5 μL于濾紙中。以只接種病原菌的平板為對照組，置于28 ℃的霉菌培養(yǎng)箱中暗環(huán)境培養(yǎng)5～7 d，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率[12]。

抑菌率＝(對照菌落半徑－處理菌落半徑)/(對照菌落半徑－菌餅半徑)

2.3 內(nèi)生細(xì)菌對盆栽白術(shù)根腐病的防治效果

將活化好的尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌用0.6 mm的打孔器制成菌餅，挑取15個(gè)病原菌菌餅加到含有250 mL的PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min，暗環(huán)境培養(yǎng)3 d，調(diào)整菌液濃度至1×107cfu/mL，取等量3種病原菌液混合過濾得到病原菌混合液。挑取適量拮抗細(xì)菌，接種到NB液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min，暗環(huán)境培養(yǎng)過夜，調(diào)整菌液濃度至1×107cfu/mL，即得拮抗菌液。

挑選8～10 cm的白術(shù)幼苗，采用灌根法對白術(shù)幼苗進(jìn)行處理，設(shè)置3組，分別為對照組（無菌水10 mL）、白術(shù)根腐病模型組（病原菌混合液5 mL＋無菌水5 mL）和拮抗細(xì)菌處理組（病原菌混合液5 mL＋拮抗菌液5 mL）。設(shè)置每區(qū)組15株，每個(gè)處理3個(gè)區(qū)組。在接種第21天觀察白術(shù)幼苗的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[13]。白術(shù)根腐病病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無??；1級，僅有少許根系受傷，枯死面積小于10%；3級，根系受傷明顯，枯死面積為10%～30%；5級，根系受傷明顯，枯死面積為30%～50%；7級，地上部開始萎蔫，根系嚴(yán)重受傷，枯死面積為50%～70%；9級，地上部嚴(yán)重萎蔫，根系嚴(yán)重受傷，枯死面積70%以上或整株死亡。

病情指數(shù)＝∑(各級病株數(shù)×相對病級數(shù)值)/調(diào)查總株數(shù)×9×100

防治效果＝(對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)

2.4 內(nèi)生細(xì)菌AM14的鑒定

2.4.1 形態(tài)特征與理化特征 觀察內(nèi)生細(xì)菌菌落顏色，透明度，邊緣整齊度，光澤度和流動(dòng)性，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色、VP試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、淀粉水解活性、尿素酶活性、葡萄糖試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn)、木糖試驗(yàn)、阿拉伯糖試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、丙二酸鹽利用、枸櫞酸鹽利用、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和尿素利用試驗(yàn)。

2.4.2 分子鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN DP-30）提取拮抗細(xì)菌DNA。用細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因片段，反應(yīng)體系如下：DNA樣本2 μL，DNA引物各1 μL，2×Taq Mix 21 μL，dd H2O補(bǔ)足體系到50 μL。用對其進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸5 min，終止反應(yīng)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA擴(kuò)增產(chǎn)物特異性條帶，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

測序所得結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具進(jìn)行同源性對比，MEGA軟件選取同源性＞97.0%的標(biāo)準(zhǔn)菌株和拮抗細(xì)菌進(jìn)行多重比對，并選取相似性較低的Dokdonella fugitiva（NR 042397）作為外群分析。選擇鄰位連接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用重抽樣法（bootstrap test）對系統(tǒng)進(jìn)化樹分支點(diǎn)的置信度進(jìn)行評估，重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)置為1000[15]。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化和拮抗細(xì)菌的篩選

共分離得到白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌246株，其中抗根腐內(nèi)生細(xì)菌18株，AM14、AM65與AM201對3種根腐病菌均有拮抗作用（表1）。拮抗細(xì)菌在不同產(chǎn)地和組織部位中的分布存在差異，根中分離得到內(nèi)生細(xì)菌58株，其中拮抗細(xì)菌10株，占總菌株數(shù)的4.07%。莖中分離得到內(nèi)生細(xì)菌53株，拮抗細(xì)菌16株，占6.50%。葉中共分離內(nèi)生細(xì)菌47株，拮抗細(xì)菌12株，占4.88%。根莖共有內(nèi)生細(xì)菌88株，拮抗細(xì)菌28株，占11.38%。根莖中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌與拮抗細(xì)菌最多。產(chǎn)地方面，浙江於潛中分離內(nèi)生細(xì)菌最多，為67株，其中拮抗細(xì)菌14株，湖南平江內(nèi)生細(xì)菌56株，其中拮抗細(xì)菌數(shù)最多為19株（表2）。

表1 白術(shù)根腐病內(nèi)生拮抗細(xì)菌的初步篩選Table 1 Preliminary screening of endophytic antagonistic bacteria against root-rot pathogen of A.macrocephala

表2 不同產(chǎn)地白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌與拮抗細(xì)菌的分布情況Table 2 Distribution of endophytic and antagonistic bacteria in A.macrocephala samples from four localities

3.2 抑菌率與抑菌帶測定

內(nèi)生細(xì)菌AM14、AM65與AM201對尖孢鐮刀菌，茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌均具有顯著的抑菌效果，其中AM14對3種病原菌的抑菌效果最好，抑菌率分別為77.44%、84.93%和79.67%，抑菌帶分別為0.26、0.49、0.48 cm；AM65效果次之，抑菌率分別為74.87%、83.33%和75.52%，抑菌帶分別為0.19、0.41、0.35 cm（圖1和表3）。

圖1 白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌AM14、AM65與AM201對3種鐮刀菌屬病原菌的拮抗效應(yīng)Fig.1 Antagonistic effects of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on hyphal growth of three root-rot pathogen Fusarium spp.

表3 白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌AM14、AM65與AM201對3種鐮刀菌屬病原菌的抑菌帶與抑菌率 (±s ,n=9)Table 3 Determination of inhibitory zone and inhibitory rate of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on hyphal growth of three root-rot pathogen Fusarium spp.(±s ,n=9)

表3 白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌AM14、AM65與AM201對3種鐮刀菌屬病原菌的抑菌帶與抑菌率 (±s ,n=9)Table 3 Determination of inhibitory zone and inhibitory rate of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on hyphal growth of three root-rot pathogen Fusarium spp.(±s ,n=9)

同列不同字母表示在P＜0.05水平存在顯著差異，表4同The different letters in one column indicated significant difference at P＜0.05 level,same as table4

菌株編號 抑菌帶/cm 抑菌率/%尖孢鐮刀菌 茄病鐮刀菌 半裸鐮刀菌 尖孢鐮刀菌 茄病鐮刀菌 半裸鐮刀菌AM14 0.26±0.02a 0.49±0.03a 0.48±0.01a 77.44±0.01a 84.93±0.01a 79.67±0.01a AM65 0.19±0.02a 0.41±0.05a 0.35±0.03b 74.87±0.01a 83.33±0.01a 75.52±0.01a AM201 0b 0b 0c 70.94±0.02b 74.47±0.03b 58.30±0.02b

3.3 內(nèi)生細(xì)菌對盆栽白術(shù)根腐病的防治效果

接種AM14、AM65和AM201可顯著降低盆栽白術(shù)根腐病的病情指數(shù)。接種病原菌21 d后，模型組白術(shù)病情指數(shù)達(dá)90.37，但同時(shí)接種內(nèi)生細(xì)菌后，白術(shù)病情指數(shù)得到不同程度緩解，其中接種AM14處理防治效果較好，為70.49%，與陽性對照甲基托布津防治效果相當(dāng)，AM65與AM201的防治效果次之，分別為46.17%和30.60%（表4）。

表4 白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌AM14、AM65與AM201對宿主根腐病的防效研究 (n＝3)Table 4 Biological control of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on host plant root-rot disease (n＝3)

3.4 內(nèi)生細(xì)菌AM14的鑒定

3.4.1 形態(tài)與理化特征 內(nèi)生細(xì)菌AM14在NA平板上呈乳白色，有光澤，不產(chǎn)生色素，表面光滑、濕潤、不透明、邊緣不平整有褶皺狀凸起，顯微鏡下菌體呈桿狀。AM14可以利用硝酸鹽、淀粉和明膠，具有運(yùn)動(dòng)能力，V-P試驗(yàn)、尿素酶活性、氧化酶活性和革蘭氏染色結(jié)果呈陽性，不能利用尿素、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇、木糖、枸櫞酸鹽和丙二酸鹽，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫（表5）。

表5 內(nèi)生細(xì)菌AM14的理化特征Table 5 Physiological and morphological characteristics of endophytic bacteria AM14

3.4.2 分子鑒定 16S rRNA測序得到內(nèi)生細(xì)菌AM14的擴(kuò)增序列長度為1394 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)AM14與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（MK660024）、死谷芽孢桿菌Bacillus vallismortis（MK149347）和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（MK103120）的同源性均達(dá)到100%。用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和分析顯示（圖2），AM14與5株芽孢桿菌屬參考菌株聚為1支且與MN149347和MK103120親緣關(guān)系最近。綜合以上信息將菌株AM14鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillussp.。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌AM14的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of AM14 strain of endophytic bacteria isolated from A.macrocephala

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首先對不同產(chǎn)地白術(shù)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，得到內(nèi)生細(xì)菌246株，其中抗根腐內(nèi)生細(xì)菌18株，進(jìn)一步通過抑菌率定量測定與盆栽防效試驗(yàn)，篩選得到1株對白術(shù)根腐病具有較好防治效果的內(nèi)生細(xì)菌AM14，并將其鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌。AM14對白術(shù)根腐病菌尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌的平板對峙抑菌帶分別為0.26、0.49、0.54 cm，抑菌率分別為77.44%、84.93%、79.67%。盆栽防治試驗(yàn)顯示AM14可以顯著降低白術(shù)幼苗根腐病病情指數(shù)，對白術(shù)根腐病防治效果達(dá)到70.49%。

不同產(chǎn)地白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌與拮抗細(xì)菌的分布存在差異性，拮抗細(xì)菌的菌株數(shù)量可能與不同產(chǎn)地白術(shù)的抗病性相關(guān)，也可能是產(chǎn)地氣候類型、經(jīng)緯度、海拔、土壤等差異所致[16]。不同組織部位對白術(shù)拮抗細(xì)菌的分布也有影響，白術(shù)地下組織拮抗細(xì)菌較地上組織更為豐富，這可能是白術(shù)根及根莖中部分內(nèi)生細(xì)菌來源于根際或土壤，同時(shí)白術(shù)地下部位需要招募更多的拮抗細(xì)菌來抵御根腐病病菌的侵染。

許多學(xué)者從藥用植物中分離得到了能提高宿主抗病性的內(nèi)生細(xì)菌，其中以芽孢桿菌最為常見[17]。芽孢桿菌是一種好氧型，能夠產(chǎn)芽孢的革蘭陽性菌，呈桿狀，其在自然界中分布廣泛，易分離培養(yǎng)[18]。芽孢桿菌可以通過誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance）、與病原菌進(jìn)行生態(tài)位競爭或分泌抗菌的代謝產(chǎn)物直接抑制病原菌生長等方法提高植物抗病性[19]。蘇博[20]發(fā)現(xiàn)杜仲內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌DZSY21能上調(diào)誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性的水楊酸信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因類枯草菌素蛋白酶，茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因茶樹脂肪氧合酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)玉米對小斑病的抗性。

本實(shí)驗(yàn)分離得到的內(nèi)生細(xì)菌AM14為芽孢桿菌屬細(xì)菌，對白術(shù)根腐病表現(xiàn)出較好的防治效果，為白術(shù)根腐病的生物防治提供了候選菌種。本實(shí)驗(yàn)只完成了AM14屬水平的鑒定，下一步將對AM14進(jìn)行多位點(diǎn)測序，將其鑒定到種水平，并將AM14制備成生物菌肥進(jìn)行大田試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化其對白術(shù)根腐病的生物防治效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突