胡志良，池 豪，丁水印

1.駐馬店市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 駐馬店 463000

2.鄭州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450000

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子、維持血管結(jié)構(gòu)等多種功能，在腫瘤、嚴(yán)重感染、心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)有血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1]。病理?xiàng)l件下，細(xì)胞分泌大量的炎性因子，合成活性氧自由基，細(xì)胞過(guò)度凋亡[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性因子分泌[3]。龍膽苦苷提取自龍膽科植物，具有抗氧化、抗炎、殺菌等作用，臨床上主要用于抗炎、健胃、保肝以及抗病原微生物的治療[4]。研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷能夠改善氧化應(yīng)激下血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，龍膽苦苷可能具有血管內(nèi)皮損傷保護(hù)作用[5]。龍膽苦苷能夠通過(guò)抑制核因子-κΒ（nuclear factor-κΒ，NF-κΒ）信號(hào)通路，從而抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[6]。人體內(nèi)腦、肝、心、肺等多種組織均表達(dá)NF-κΒ，NF-κΒ負(fù)責(zé)調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[7]。LPS可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κΒ信號(hào)通路，抑制NF-κΒ信號(hào)通路能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8]。本研究考察龍膽苦苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制，為其治療感染等因素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞RAEC購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

龍膽苦苷（批號(hào)L-005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；丙二醛檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BC0025）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BC0175）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）/碘化丙錠（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CA1020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗磷酸化p65（p-p65）抗體、兔抗剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)R8758）、胎牛血清（批號(hào)F2442）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PMA（批號(hào)GT6290）購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；引物由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。

1.3 儀器

Multiscan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；FC500流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）；5424離心機(jī)、5810R離心機(jī)（德國(guó)Eppendrof公司）；LightCycler480熒光定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）；PowerPac蛋白電泳儀、Gel Doc XR＋凝膠顯示系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAEC細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞活力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAEC細(xì)胞，以3×103/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組和龍膽苦苷（5、10、20、40、80 μmol/L）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8工作液，孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度（A）值。

2.3 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞增殖的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAEC細(xì)胞，以3×103/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和龍膽苦苷（5、10、20 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入LPS（100 μg/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。按“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

2.4 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAEC細(xì)胞，以1×103/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組和龍膽苦苷（5、10、20 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入LPS（100 μg/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，以PBS溶液重懸，制成5×105/mL細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況。

2.5 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞丙二醛水平和SOD活性的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞丙二醛水平和SOD活性。

2.6 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：TNF-α上游引物5’-TGACAAGCCTGTAGCCCATGTT-3’，下游引物5’-AGGGCAATGATCCCAAAGTAGA-3’；IL-6上游引物5’-CCAGTACCCCCAGGAGAAGAT-3’，下游引物5’-TTGCCTTTTTCTGCAGGAAC-3’；IL-1β上游引物5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，下游引物5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；GAPDH上游引物5’-CCAGCAAAGAGACCAAGAGGAA-3’，下游引物5’-ATGGTACATAGACAAGGTGCGG-3’。

2.7 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉1 h，分別加入p-p65和cleaved Caspase-3抗體（1∶600），4 ℃孵育過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶4000），室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液顯影。

2.8 NF-κB信號(hào)激活劑（PMA）對(duì)龍膽苦苷促進(jìn)RAEC細(xì)胞增殖的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAEC細(xì)胞，以3×103/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、龍膽苦苷（10 μmol/L）組和龍膽苦苷（10 μmol/L）聯(lián)合PMA（1 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入LPS（100 μg/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。按“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

2.9 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAEC細(xì)胞，以1×103/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)12 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、龍膽苦苷（10 μmol/L）組和龍膽苦苷（10 μmol/L）聯(lián)合PMA（1 μmol/L）組，模型組和各給藥組加入LPS（100 μg/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。按“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

2.10 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞丙二醛水平、升高SOD活性的影響

按“2.8”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞丙二醛水平和SOD活性。

2.11 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響

按“2.8”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)情況。

2.12 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

按“2.8”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按“2.7”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況。

2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差比較。

3 結(jié)果

3.1 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞活力的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，龍膽苦苷（5、10、20 μmol/L）組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，龍膽苦苷（40、80 μmol/L）組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）。因此，選擇5、10、20 μmol/L龍膽苦苷進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞活力的影響 (±s ,n=3)Table 1 Effect of gentiopicroside onviability of RAEC cells (±s ,n=3)

表1 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞活力的影響 (±s ,n=3)Table 1 Effect of gentiopicroside onviability of RAEC cells (±s ,n=3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group

組別 劑量/(μmol·L?1) A490對(duì)照 — 0.65±0.05龍膽苦苷 5 0.63±0.07 10 0.60±0.08 20 0.61±0.05 40 0.50±0.04*80 0.32±0.03*

3.2 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響

如圖1和表2所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），呈劑量相關(guān)性，表明龍膽苦苷可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的RAEC細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。

圖1 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞凋亡的影響Table 1 Effect of gentiopicroside on apoptosis of RAEC cells

表2 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響(±s ,n=3)Table 2 Effectof gentiopicroside on proliferation and apoptosis of RAEC cells (±s ,n=3)

表2 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響(±s ,n=3)Table 2 Effectof gentiopicroside on proliferation and apoptosis of RAEC cells (±s ,n=3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05，下表同*P ＜ 0.05 vs control group; #P ＜ 0.05 vs model group,same as below tables

組別 劑量/(μmol·L?1) A490 凋亡率/%對(duì)照 — 0.67±0.07 06.35±0.42模型 — 0.36±0.03* 27.61±2.26*龍膽苦苷 5 0.44±0.04# 22.41±1.24#10 0.56±0.06# 14.30±1.17#20 0.65±0.05# 08.62±0.53#

3.3 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞丙二醛水平和SOD活性的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞丙二醛水平顯著升高（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷組細(xì)胞丙二醛水平顯著降低（P＜0.05），SOD活性顯著升高（P＜0.05），呈劑量相關(guān)性，表明龍膽苦苷可抑制LPS誘導(dǎo)的RAEC細(xì)胞氧化應(yīng)激。

表3 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞丙二醛水平和SOD活性的影響 (±s ,n=3)Table 3 Effect of gentiopicroside on malondialdehyde level and SOD activity in RAEC cells (±s ,n=3)

表3 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞丙二醛水平和SOD活性的影響 (±s ,n=3)Table 3 Effect of gentiopicroside on malondialdehyde level and SOD activity in RAEC cells (±s ,n=3)

組別 劑量/(μmol·L?1)丙二醛/(U·mg?1)SOD/(nmol·mg?1)對(duì)照 — 1.03±0.10 17.45±1.32模型 — 3.78±0.25* 08.36±0.74*龍膽苦苷 5 3.05±0.15# 10.25±1.04#10 2.14±0.22# 13.46±1.17#20 1.23±0.10# 15.04±1.08#

3.4 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量相關(guān)性，表明龍膽苦苷可抑制LPS誘導(dǎo)的RAEC細(xì)胞炎性因子的表達(dá)。

表4 龍膽苦苷對(duì)RAEC 細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Table 4 Effect of gentiopicroside on mRNA expressions of TNF-α,IL-6 and IL-1β in RAEC cells (±s ,n=3)

表4 龍膽苦苷對(duì)RAEC 細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Table 4 Effect of gentiopicroside on mRNA expressions of TNF-α,IL-6 and IL-1β in RAEC cells (±s ,n=3)

組別 劑量/(μmol·L?1) mRNA相對(duì)表達(dá)量TNF-α IL-6 IL-1β對(duì)照 — 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.11模型 — 5.17±0.42* 9.65±0.93* 4.16±0.32*龍膽苦苷 5 4.12±0.36# 7.51±0.62# 2.95±0.23#10 3.01±0.21# 5.04±0.52# 2.20±0.14#20 1.78±0.12# 3.71±0.28# 1.64±0.17#

3.5 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖2和表5所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷組細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量相關(guān)性，表明龍膽苦苷可抑制LPS誘導(dǎo)的RAEC細(xì)胞NF-κΒ信號(hào)通路的激活，并抑制細(xì)胞凋亡。

圖2 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of gentiopicroside on expressions of p-p65 and cleaved Caspase-3 in RAEC cells

表5 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Table 5 Effect of gentiopicroside on expressions of p-p65 and cleaved Caspase-3 in RAEC cells (±s ,n=3)

表5 龍膽苦苷對(duì)RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Table 5 Effect of gentiopicroside on expressions of p-p65 and cleaved Caspase-3 in RAEC cells (±s ,n=3)

組別 劑量/(μmol·L?1)蛋白相對(duì)表達(dá)量cleaved Caspase-3 p-p65對(duì)照 — 0.26±0.03 0.30±0.04模型 — 0.87±0.08* 0.99±0.09*龍膽苦苷 5 0.63±0.05# 0.68±0.07#10 0.49±0.03# 0.59±0.05#20 0.24±0.03# 0.33±0.04#

3.6 PMA對(duì)龍膽苦苷促進(jìn)RAEC細(xì)胞增殖以及抑制RAEC細(xì)胞凋亡的影響

如圖3和表6所示，與龍膽苦苷組比較，龍膽苦苷聯(lián)合PMA組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

圖3 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of PMA on inhibiting RAEC cells apoptosis by gentiopicroside

表6 PMA對(duì)龍膽苦苷促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及抑制細(xì)胞凋亡的影響 (±s ,n=3)Table 6 Effect of PMA on promoting RAEC cells proliferation and inhibiting cells apoptosis by gentiopicroside (±s ,n=3)

表6 PMA對(duì)龍膽苦苷促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及抑制細(xì)胞凋亡的影響 (±s ,n=3)Table 6 Effect of PMA on promoting RAEC cells proliferation and inhibiting cells apoptosis by gentiopicroside (±s ,n=3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與龍膽苦苷組比較：△P＜0.05，下表同*P ＜ 0.05 vs control group; △P ＜ 0.05 vs gentiopicroside group,same as below tables

組別 劑量/(μmol·L?1) A490 凋亡率/%對(duì)照 — 0.65±0.06 06.32±0.51模型 — 0.35±0.04* 27.45±2.36*龍膽苦苷 10 0.57±0.06 13.45±1.23龍膽苦苷＋PMA 10＋1 0.40±0.05△ 23.69±2.15△

3.7 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞丙二醛水平、升高SOD活性的影響

如表7所示，與龍膽苦苷組比較，龍膽苦苷聯(lián)合PMA組細(xì)胞丙二醛水平顯著升高（P＜0.05），SOD活性顯著降低（P＜0.05）。

表7 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞丙二醛水平、升高SOD活性的影響 (±s ,n=3)Table 7 Effect of PMA on inhibiting malondialdehyde level and increasing SOD activity of RAEC cells by gentiopicroside (±s ,n=3)

表7 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞丙二醛水平、升高SOD活性的影響 (±s ,n=3)Table 7 Effect of PMA on inhibiting malondialdehyde level and increasing SOD activity of RAEC cells by gentiopicroside (±s ,n=3)

組別 劑量/(μmol·L?1)丙二醛/(U·mg?1)SOD/(nmol·mg?1)對(duì)照 — 1.05±0.11 17.86±1.95模型 — 3.75±0.31* 08.44±0.82*龍膽苦苷 10 2.11±0.19 12.95±1.27龍膽苦苷＋PMA 10＋1 3.04±0.17△ 09.68±0.96△

3.8 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響

如表8所示，與龍膽苦苷組比較，龍膽苦苷聯(lián)合PMA組細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

表8 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響 (±s ,n=3)Table 8 Effect of PMA on inhibiting mRNA expressions of TNF-α,IL-6 and IL-1β in RAEC cells by gentiopicroside(±s ,n=3)

表8 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)水平的影響 (±s ,n=3)Table 8 Effect of PMA on inhibiting mRNA expressions of TNF-α,IL-6 and IL-1β in RAEC cells by gentiopicroside(±s ,n=3)

組別 劑量/(μmol·L?1) mRNA相對(duì)表達(dá)量TNF-α IL-6 IL-1β對(duì)照 — 1.00±0.12 1.00±0.10 1.00±0.09模型 — 4.78±0.41* 9.32±0.74* 4.11±0.36*龍膽苦苷 10 2.95±0.25 4.84±0.41 2.26±0.21龍膽苦苷＋PMA 10＋1 3.20±0.21△ 6.98±0.15△ 3.25±0.10△

3.9 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

如圖4和表9所示，與龍膽苦苷組比較，龍膽苦苷聯(lián)合PMA組細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，PMA能夠抑制龍膽苦苷改善RAEC細(xì)胞損傷的作用。

圖4 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PMA on inhibiting expressions of p-p65 and cleaved Caspase-3 in RAEC cells by gentiopicroside

表9 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Table 9 Effect of PMA on inhibiting expressions of p-p65 and cleaved Caspase-3 in RAEC cells by gentiopicroside(±s ,n=3)

表9 PMA對(duì)龍膽苦苷抑制RAEC細(xì)胞p-p65和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Table 9 Effect of PMA on inhibiting expressions of p-p65 and cleaved Caspase-3 in RAEC cells by gentiopicroside(±s ,n=3)

組別 劑量/(μmol·L?1)蛋白相對(duì)表達(dá)量cleaved Caspase-3 p-p65對(duì)照 — 0.24±0.02 0.28±0.03模型 — 0.86±0.09* 0.92±0.10*龍膽苦苷 10 0.50±0.07 0.53±0.07龍膽苦苷＋PMA 10＋1 0.79±0.08△ 1.23±0.12△

4 討論

龍膽苦苷為裂環(huán)環(huán)烯醚萜化合物，能夠抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[4]。龍膽苦苷能夠抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡[5]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，龍膽苦苷組細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率降低，提示龍膽苦苷可能具有改善LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。

LPS刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)有關(guān)[9]。LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中抗氧化酶的活性下降，抗氧化酶活性降低能夠直接誘導(dǎo)氧自由基的大量聚集，過(guò)量的氧自由基能夠刺激細(xì)胞，誘導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，導(dǎo)致氧化損傷；還能夠激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10-11]。丙二醛水平可直接反應(yīng)細(xì)胞氧化損傷程度[12]。SOD是氧自由基清除劑，也是主要的抗氧化酶之一[13]。Caspase蛋白家族被激活后形成凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Caspase-3是Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游執(zhí)行因子，其被活化后是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[14-15]。LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)的產(chǎn)生并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子，誘導(dǎo)炎性損傷[17-19]。氧自由基過(guò)度積累可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，并且炎性因子也可促進(jìn)氧化應(yīng)激[20-21]。本研究結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞丙二醛水平升高，SOD活性降低，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)水平升高；龍膽苦苷能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)和氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡。

龍膽苦苷能夠通過(guò)抑制NF-κΒ信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗損傷作用[6]。本研究結(jié)果顯示，龍膽苦苷組細(xì)胞p-p65蛋白表達(dá)水平降低。p65是NF-κΒ信號(hào)通路的關(guān)鍵亞單位，其表達(dá)量與NF-κΒ信號(hào)通路的激活水平有關(guān)[22]。NF-κΒ在炎性反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和氧化應(yīng)激等過(guò)程中均有調(diào)控作用[23]。血管內(nèi)皮損傷中NF-κΒ信號(hào)異常激活，抑制NF-κΒ信號(hào)通路能夠緩解LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。本研究結(jié)果顯示，PMA能夠抑制龍膽苦苷改善RAEC細(xì)胞損傷的作用，表明龍膽苦苷能夠通過(guò)NF-κΒ信號(hào)通路發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用。

綜上，龍膽苦苷能夠改善LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制與抑制NF-κΒ信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突