郭丹丹，郭鋮潔，桑婷婷，王玉潔，吳凱凱，郭翠玲，方 柳，王興亞

浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053

結(jié)腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的5年生存率不超過10%[1-4]。目前，手術(shù)、化療、放療及靶向手段是治療結(jié)腸癌的主要策略。然而，這些傳統(tǒng)的治療方式具有術(shù)后并發(fā)癥、耐藥性及不良反應(yīng)等局限性。近年來，中醫(yī)藥因其療效顯著、不良反應(yīng)少而被廣泛用于防治癌癥。天然化合物或補(bǔ)充劑具有潛在的抗癌作用[5-6]。紫杉醇可以逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的耐藥性[7]，對(duì)乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、結(jié)腸癌和肺癌均有明顯的治療作用[8-9]。參麥注射液主要由紅參和麥冬組成，可通過改善化療藥物阿霉素和紫杉醇在小鼠體內(nèi)的亞細(xì)胞分布，增強(qiáng)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性[10]?？等R特?注射液（薏苡仁提取物）與吉西他濱聯(lián)用可顯著提高局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的無進(jìn)展生存期[11]。金龍膠囊可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡[12]。

芪珍膠囊是一種有效的抗癌中藥制劑，臨床用于肺癌、乳腺癌和胃癌的輔助治療，主要由珍珠、黃芪、三七、大青葉和重樓組成，具有益氣化瘀、清熱解毒的功效。芪珍膠囊主要活性成分為黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1。芪珍膠囊與多西他賽或順鉑等化療藥物聯(lián)用，能夠協(xié)同抑制乳腺癌、晚期非小細(xì)胞肺癌、胃癌患者的腫瘤生長，提高患者免疫功能和生活質(zhì)量[13-16]。芪珍膠囊可以增加乳腺癌患者CD4/CD8細(xì)胞，改善免疫功能，緩解放化療引起的骨髓抑制等不良反應(yīng)[17]。目前，芪珍膠囊對(duì)結(jié)腸癌的作用及其抗腫瘤的作用機(jī)制尚不清楚。人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116是從結(jié)腸癌的男性患者中分離的惡性細(xì)胞株，由于其在無胸腺的裸鼠中具有較好致瘤性，可形成上皮樣腫瘤，被廣泛用于結(jié)腸癌研究[18]。本研究從體內(nèi)外探究芪珍膠囊抗結(jié)腸癌的作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HCT116細(xì)胞購自美國ATCC。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠60只，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK2018-0012。動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，溫度（24±2）℃、濕度（50±10）%，保持良好通風(fēng)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZSLL-2018-015）。

1.3 藥品與試劑

芪珍膠囊（批號(hào)160908，0.3 g/粒）購自寧波大昌藥業(yè)有限公司，經(jīng)高效液相色譜法測定每粒芪珍膠囊含4.85 mg三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1，符合《中國藥典》2015年版規(guī)定；氟尿嘧啶注射液（批號(hào)02170302，0.25 g/支）購自山西普德藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、0.25%胰酶購自美國Gibco公司；MTT購自美國AMRESCO公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；β-actin抗體（批號(hào)4967S）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗體（批號(hào)9542S）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)2876S）、程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）抗體（批號(hào)13684T）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（批號(hào)9665）、Caspase-9抗體（批號(hào)9508）、剪切型Caspase-9（cleaved Caspase-9）抗體（批號(hào)7237P）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號(hào)2983S）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（批號(hào)5536S）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抗體（批號(hào)2603S）、p-AMPK抗體（批號(hào)2535S）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extraeellular signal regulated kinase，ERK）抗體（批號(hào)9102S）、p-ERK抗體（批號(hào)4377）、p38抗體（批號(hào)9218S）、p-p38抗體（批號(hào)9211S）、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自美國CST公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)23209）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；ECL顯影液（批號(hào)170-5061）、EASYspin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒（批號(hào)RN07）購自北京艾德萊生物科技有限公司；iTaqTM Universal SYBR Green Supermix（批號(hào)172-5124）購自美國BIO-RAD公司；PCR試劑盒（批號(hào)R2233-01）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；人重組γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ，批號(hào)071527-3）購自美國PEPROTECH公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)MM-0049H2）、IL-1β ELⅠSA試劑盒（批號(hào)MM-0181H2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)MM-0122H2）購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；β-actin、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、TNF-α、IL-6、CD68、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、PD-L1引物購自上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 儀器

CKX31SF倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；HYC-360型4 ℃醫(yī)用冷藏箱、DW-25L262型?20 ℃醫(yī)用低溫冷藏箱（青海海爾特種電器有限公司）；902型 ?80 ℃超低溫冰箱、3111型CO2培養(yǎng)箱、1300SERIES A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ELX808型酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司）；GeneAmp 9700型基因擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司）；CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）；MiniChemiTM610型化學(xué)成像分析儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；5424R型高速離心機(jī)、5404型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以1×104/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%。芪珍膠囊溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，配制成質(zhì)量濃度為2.1 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，使用時(shí)以DMEM培養(yǎng)基稀釋。設(shè)置對(duì)照組和芪珍膠囊（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）組，各給藥組加入200 μL相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h；每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩10 min，采用多功能酶標(biāo)儀于490 nm測定吸光度（A）值，以空白對(duì)照孔的A值作為參照，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對(duì)照－A空白)

2.3 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%。設(shè)置對(duì)照組和芪珍膠囊（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，以含Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）的結(jié)合緩沖液重懸，避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，以早期凋亡細(xì)胞（Annexin V＋/PI－）和晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V＋/PI＋）計(jì)算凋亡率。

2.4 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表達(dá)的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，分別加入Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG抗體（1∶2000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌4次，加入ECL顯影液，采用化學(xué)成像分析儀曝光并拍照。

2.5 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞PD-L1 mRNA表達(dá)的影響

按“2.3”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：β-actin上游引物5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’、下游引物5’-AAGGAACTTCCTTGAACAATGCA-3’；PD-L1上游引物5’-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3’、下游引物5’-AGCCCTCAGCCTGACATGTC-3’。

2.6 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型的影響

BALB/c裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及芪珍膠囊低、高劑量（1.5、4.5 g/kg，分別相當(dāng)于臨床2、6倍劑量）組、氟尿嘧啶（20 mg/kg）組、芪珍膠囊（1.5 g/kg）聯(lián)合氟尿嘧啶（20 mg/kg）組，每組12只。取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×107/mL，于裸鼠背部sc 0.2 mL細(xì)胞懸液，7～10 d后，裸鼠皮下出現(xiàn)結(jié)節(jié)，表明移植瘤模型建立成功。芪珍膠囊溶于生理鹽水，分別配制成質(zhì)量濃度為150、450 mg/mL的溶液；氟尿嘧啶以生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。自造模第2天開始，芪珍膠囊組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組ig 0.2 mL生理鹽水，1次/d；氟尿嘧啶組ip藥物，每2天1次，連續(xù)5周。每周稱定各組裸鼠體質(zhì)量，測量腫瘤長徑（a）及與長徑垂直的瘤體最寬徑（b），計(jì)算腫瘤體積。

腫瘤體積＝ab2/2

2.7 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

末次給藥24 h后，裸鼠用CO2窒息處死，心臟取血，血液室溫靜置至析出，4 ℃、3000 r/min離心15 min，吸取上清，按試劑盒說明書檢測各組裸鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.8 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表達(dá)的影響

裸鼠處死后，取腫瘤組織，稱定質(zhì)量，按照試劑盒說明書提取各組裸鼠腫瘤組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：NF-κB上游引物5’-ATGGCTTCTATGAGGCTGAG-3’、下游引物5’-GTTGTTGTTGGTCTGGATGC-3’；TNF-α上游引物5’-AGAGGGAGAGAAGCAACTACA-3’、下游引物5’-GGGTCAGTATGTGAGAGGAAGA-3’；IL-6上游引物5’-CGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTG-3’、下游引物5’-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTCT-3’；CD68上游引物5’-TTGGGTGAGGCGGTTCAGCCA-3’、下游引物5’-GTGCTCTCTGTAACCGTGGGTGT-3’；MCP-1上游引物5’-TGGCTGTGTTTGCTTCTGTC-3’、下游引物5’-TCTCACTGCCCTATGCCTCT-3’；iNOS上游引物5’-GGAAGCGGTAACAAAGGA-3’、下游引物5’-GCCAGCATAGCGGATG-3’；其余引物序列見“2.5”項(xiàng)。

2.9 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1蛋白表達(dá)的影響

取各組裸鼠腫瘤組織，加入500 μL RIPA裂解液，使用勻漿機(jī)充分破碎腫瘤組織，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。按“2.4”項(xiàng)下方法檢測各組裸鼠腫瘤組織PD-L1蛋白表達(dá)情況。

2.10 芪珍膠囊對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞存活率的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以1×104/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%。設(shè)置對(duì)照組、模型組、芪珍膠囊（0.4、0.7 mg/mL）組、芪珍膠囊（0.4、0.7 mg/mL）聯(lián)合IFN-γ（10 ng/mL）組，模型組和聯(lián)合給藥組加入IFN-γ（10 ng/mL），各給藥組加入200 μL芪珍膠囊溶液，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。按“2.2”項(xiàng)下方法測定各組細(xì)胞存活率。

2.11 芪珍膠囊對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為50%。設(shè)置對(duì)照組、模型組和芪珍膠囊（0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）組，模型組和各給藥組加入IFN-γ（10 ng/mL），各給藥組再加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。按“2.4”項(xiàng)下方法檢測各組細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)情況。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以±s表示，采用SPSS 19.0軟件及GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或t檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，芪珍膠囊組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01、0.001），呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。

圖1 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞存活率的影響(±s ,n=3)Fig.1 Effect of Qizhen Capsule on survival rate in HCT116 cells (±s ,n=3)

3.2 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細(xì)胞晚期凋亡率顯著升高（P＜0.01、0.001），芪珍膠囊（0.7 mg/mL）組細(xì)胞早期凋亡率顯著升高（P＜0.01）。

圖2 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響 (±s ,n=3)Fig.2 Effect of Qizhen Capsule on apoptosis in HCT116 cells (±s ,n=3)

3.3 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表達(dá)的影響

如圖3、4所示，與對(duì)照組比較，芪珍膠囊（0.6、0.7 mg/mL）組細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細(xì)胞cleaved Caspase-9、cleaved PARP和p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），各劑量芪珍膠囊組細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-ERK/ERK和p-p38/p38蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖3 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)的影響 (±s ,n=3)Fig.3 Effect of Qizhen Capsule onexpressions of Caspase-9,cleaved Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2,and PARP in HCT116 cells(±s ,n=3)

3.4 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞PD-L1 mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，與模型組比較，芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細(xì)胞中PD-L1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

3.5 芪珍膠囊對(duì)結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的影響

圖4 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表達(dá)的影響(±s ,n=3)Fig.4 Effect of QizhenCapsule on expressions of mTOR,p-mTOR,AMPK,p-AMPK,ERK,p-ERK,p38,and p-p38 in HCT116 cells (±s ,n=3)

圖5 芪珍膠囊對(duì)HCT116細(xì)胞PD-L1 mRNA表達(dá)的影響(±s ,n=3)Fig.5 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 mRNA level in HCT116 cells (±s ,n=3)

如圖6-A所示，對(duì)照組和氟尿嘧啶組裸鼠體質(zhì)量均低于芪珍膠囊組，聯(lián)合用藥組裸鼠體質(zhì)量高于模型組和氟尿嘧啶組，提示芪珍膠囊可減輕氟尿嘧啶的不良反應(yīng)。如圖6-B、C所示，與對(duì)照組比較，芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤體積顯著減小（P＜0.05、0.01）。如圖6-D所示，與對(duì)照組比較，芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯(lián)合用藥組裸鼠瘤質(zhì)量顯著降低（P＜0.05、0.01），表明芪珍膠囊能有效抑制裸鼠腫瘤生長，減輕氟尿嘧啶誘導(dǎo)的體質(zhì)量減輕。

圖6 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型體質(zhì)量 (A)、腫瘤體積 (B)、腫瘤終體積 (C) 和腫瘤質(zhì)量 (D) 的影響 (±s ,n=12)Fig.6 Effect of Qizhen Capsule on bodyweight (A),tumor volume (B),average final tumor volume (C),and tumor weight (D)of nude mouse xenografts (±s ,n=12)

3.6 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，各給藥組裸鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯(lián)合用藥組裸鼠血清中IL-1β水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖7 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響 (±s ,n=3)Fig.7 Effect of Qizhen Capsule on levels of TNF-α,IL-6,and IL-1β in serum of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.7 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，各給藥組裸鼠腫瘤組織中CD68mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤組織中NF-κB、TNF-α、IL-6和MCP-1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），芪珍膠囊低劑量組、氟尿嘧啶組和聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤組織中iNOSmRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），芪珍膠囊高劑量組和聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤組織中PD-L1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖8 芪珍膠囊對(duì)對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表達(dá)的影響(±s ,n=3)Fig.8 Effect of Qizhen Capsule on mRNA levels of NF-κB,TNF-α,IL-6,CD68,MCP-1,iNOS,and PD-L1 in tumor of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.8 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1蛋白表達(dá)的影響

如圖9所示，與對(duì)照組比較，芪珍膠囊高劑量組和聯(lián)合用藥組裸鼠腫瘤組織中PD-L1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

圖9 芪珍膠囊對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1蛋白表達(dá)水平的影響 (±s ,n=3)Fig.9 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 expression in tumor of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.9 芪珍膠囊對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞存活率的影響

如圖10所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率無明顯變化；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.001）。

圖10 芪珍膠囊對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞存活率的影響 ()Fig.10 Effect of Qizhen Capsule on survival rate in HCT116 cells induced by IFN-γ (±s ,n=3)

3.10 芪珍膠囊對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)的影響

IFN-γ是促進(jìn)PD-L1表達(dá)最強(qiáng)的刺激因子[19]。如圖11所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）。以上結(jié)果表明芪珍膠囊可以抑制PD-L1在異種移植瘤中的表達(dá)，也可以抑制IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞中PD-L1表達(dá)，提示芪珍膠囊可能在結(jié)腸癌中起到免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICPI）的作用。

圖11 芪珍膠囊對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)的影響 ()Fig.11 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 expression in HCT116 cells induced by IFN-γ (±s ,n=3)

4 討論

免疫治療，尤其是ICPI治療，對(duì)結(jié)腸癌有良好的療效[20-21]?？筆D-1藥物如pembrolizumab、nivolumab已被FDA批準(zhǔn)并用于治療不匹配修復(fù)缺陷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性高型結(jié)腸癌患者[21]。由于患者復(fù)雜的分子遺傳特征，不同的結(jié)腸癌亞群對(duì)免疫治療有不同的反應(yīng)[22]。然而，ICPI對(duì)呼吸系統(tǒng)、皮膚和胃腸道等器官均具有毒性作用[23]。因此，開發(fā)有效且安全的ICPI藥物對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療至關(guān)重要。中藥具有良好的抗癌作用，可降低ICPI誘導(dǎo)的免疫相關(guān)不良反應(yīng)，是一種有前景的免疫治療藥物的輔助/替代品[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，芪珍膠囊通過抑制HCT116細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)并抑制IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1蛋白表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長。芪珍膠囊能夠抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤生長，抑制炎性反應(yīng)，緩解氟尿嘧啶引起的體質(zhì)量下降，抑制免疫缺陷小鼠PD-L1表達(dá)，提示芪珍膠囊是一種有潛力的抗結(jié)腸癌ICPI藥物。

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，免疫系統(tǒng)作為機(jī)體的防御系統(tǒng)，可以通過適應(yīng)性或獲得性免疫反應(yīng)有效地識(shí)別外來物質(zhì)并將其清除[25]。研究表明，免疫檢查點(diǎn)分子包括PD-1和PD-L1，均為結(jié)腸癌免疫治療的可能靶點(diǎn)[26]。PD-L1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)[26]。靶向阻斷腫瘤PD-1/PD-L1結(jié)合可增強(qiáng)抗腫瘤藥物的免疫應(yīng)答，為腫瘤免疫治療提供機(jī)會(huì)。腫瘤PD-L1可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫非依賴性和內(nèi)在功能，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，芪珍膠囊顯著降低裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1表達(dá)，降低腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量。在免疫缺陷小鼠和免疫功能小鼠中，卵巢癌、黑色素瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)下調(diào)，癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成被抑制[27-28]，與本研究結(jié)果一致，表明一種新的腫瘤細(xì)胞固有的PD-L1效應(yīng)可能是非免疫介導(dǎo)的，也表明PD-L1作為一種潛在的抗癌生物標(biāo)志物具有更廣泛的作用。本研究結(jié)果顯示，IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)水平升高[29]，芪珍膠囊顯著抑制IFN-γ誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)水平；而與模型組比較，氟尿嘧啶對(duì)裸鼠移植瘤模型腫瘤組織中PD-L1表達(dá)卻無明顯影響。有研究發(fā)現(xiàn)，氟尿嘧啶能夠誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞PD-L1表達(dá)上調(diào)，可能是氟尿嘧啶誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥或氟尿嘧啶誘導(dǎo)免疫耐藥所致[30]。綜上，芪珍膠囊可通過靶向PD-L1表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，可能是其發(fā)揮有效的免疫或非免疫介導(dǎo)的抗癌作用機(jī)制。

炎性反應(yīng)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，在癌變過程中發(fā)揮重要作用[31]。20%～40%結(jié)腸癌患者存在系統(tǒng)性炎性反應(yīng)[32]。結(jié)腸癌患者血清中IL-6和TNF-α水平升高，且IL-6和TNF-α的共同表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)[33]。IL-1β和IL-6的表達(dá)均位于結(jié)腸癌上皮和基質(zhì)中[34]。本研究結(jié)果顯示，芪珍膠囊可以顯著降低裸鼠移植瘤模型血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平。白藜蘆醇和三七能夠降低IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)[35-36]。三七能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠DC2.4細(xì)胞中IL-6和TNF-α的分泌[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，芪珍膠囊顯著抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1和iNOSmRNA表達(dá)水平，提示芪珍膠囊可能通過抑制炎性反應(yīng)，抑制結(jié)腸癌發(fā)展。

持續(xù)存在的細(xì)胞增殖信號(hào)、規(guī)避生長抑制因子、促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞永生化、誘導(dǎo)血管生成、抵御細(xì)胞凋亡是癌癥的特征，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，芪珍膠囊顯著抑制HCT116細(xì)胞增殖，呈劑量相關(guān)性，可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡是由多種基因調(diào)控的過程，PARP是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，抗凋亡分子Bcl-2在結(jié)腸癌中高表達(dá)[39]。本研究結(jié)果顯示，芪珍膠囊下調(diào)HCT116細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平，上調(diào)cleaved Caspases-9和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷能夠上調(diào)HT-29細(xì)胞中cleaved PARP表達(dá)，下調(diào)Bcl-2和Caspase-3表達(dá)[40]。mTOR[41]、AMPK[42]和MAPK[43]等多種信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。MAPK/ERK的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[44-45]。本研究發(fā)現(xiàn)，芪珍膠囊能夠激活HCT116細(xì)胞中mTOR、AMPK、ERK和p38信號(hào)通路，提示這些通路可能是芪珍膠囊在HCT116細(xì)胞中發(fā)揮抗癌作用的潛在下游信號(hào)級(jí)聯(lián)通路。

綜上所述，芪珍膠囊能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制炎癥及PD-L1表達(dá)等途徑抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，可能是一種潛在的ICPI。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突