徐芳芳，杜 慧，張 欣，李執(zhí)棟，徐 冰，朱文燈，吳 云，肖 偉*

1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

2.中成藥智能制造國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 連云港 222001

3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

熱毒寧注射液（Reduning Injection，RI）處方由青蒿、金銀花和梔子組成，臨床用于外感風(fēng)熱所致感冒、咳嗽，癥見高熱、微惡風(fēng)寒、頭痛身痛、咳嗽、痰黃；上呼吸道感染、急性支氣管炎見上述證候者[1-2]。金銀花和青蒿（金青）醇沉是熱毒寧注射液生產(chǎn)過程的關(guān)鍵工序之一，是金銀花和青蒿的水提濃縮液合并后加入乙醇從而除去蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、多糖等雜質(zhì)[3]而達(dá)到純化目的的過程。中藥醇沉機(jī)制復(fù)雜，過程質(zhì)量控制難度高，能否實(shí)現(xiàn)醇沉過程物料的快速分析對控制醇沉品質(zhì)至關(guān)重要[4]。

光學(xué)分析技術(shù)屬于無損、綠色檢測技術(shù)，操作簡單、快速，廣泛應(yīng)用于中藥樣品中成分含量的快速測定[5-10]。杜文俊等[3]曾嘗試采用近紅外光譜法測定金青醇沉過程中綠原酸和固形物的含量，但由于醇沉?xí)r易出現(xiàn)粒徑不均的顆粒狀或絮狀樣品，在透射測定模式下直接影響近紅外定量預(yù)測的效果，該研究對象僅為醇沉上清液，近紅外技術(shù)的應(yīng)用是離線應(yīng)用，未能實(shí)現(xiàn)醇沉過程的在線控制[11]。

本研究采用在線中紅外光譜（mid-infrared spectrum，MIR）分析技術(shù)，采用衰減全反射設(shè)計(jì)，利用樣品表面的反射信號獲取樣品有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)信息[12]，且其產(chǎn)生的基頻吸收強(qiáng)度大，靈敏度更高，更適用于混懸體系的樣品檢測。這不僅可以簡化樣品的制備過程，還擴(kuò)大了紅外光譜技術(shù)的應(yīng)用范圍，測定多種狀態(tài)的樣品，例如生物組織、漿液等。目前紅外光譜技術(shù)在中藥檢測得到較為廣泛的應(yīng)用，如藥材鑒別[13-15]、品種分類[16-17]、偽劣鑒別[18]等定性分析方面有較多的研究應(yīng)用，而在中藥含量測定報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)利用衰減全反射-傅里葉變換MIR結(jié)合組合間隔偏最小二乘法（synergy interval partial least squares，SiPLS）[19-22]進(jìn)行變量篩選，分別建立熱毒寧注射液金銀花與青蒿（金青）醇沉過程7種指標(biāo)成分的偏最小二乘定量分析模型，實(shí)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷的快速測定。

1 材料與儀器

1.1 材料

9批次的金青醇沉過程樣本，批號及數(shù)量見表1，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥現(xiàn)代化數(shù)字化提取工廠提供。對照品綠原酸（批號110753-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、梔子苷（批號110749-201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.5%），供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院。

表1 金青醇沉樣本信息Table 1 Information of Jinqing alcohol precipitation samples

1.2 儀器

Nicolet iS10紅外光譜分析儀、賽默飛U5高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；BSA224SCW型萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；0.1 mL移液槍，德國Eppendorf公司；H1650型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

Unscrambler 11，挪威Camo Analytics公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 金青醇沉樣本取樣方法

為實(shí)現(xiàn)MIR在線獲取及樣本自動采集，對醇沉設(shè)備取樣口位置進(jìn)行了適當(dāng)改造。打開醇沉罐上部取樣口，插入一根套管，并固定其位置，光纖及探頭放于套管內(nèi)，探頭接觸醇沉罐中藥液；在套管內(nèi)再放入一根軟管，軟管與蠕動泵相連，便于實(shí)時取樣。光纖及探頭信息：廠家Infrared Fiber Sensor，型號DiProbe，探頭長度 28 cm，探頭直徑6 mm，光譜級鹵化銀光纖，光線長度2.5 m。醇沉過程中紅外在線應(yīng)用見圖1。啟動金青醇沉程序30 min后，每隔10 min取樣1次，至醇沉結(jié)束。金青醇沉樣品信息如表1所示，共計(jì)103個樣品。

圖1 醇沉過程在線中紅外應(yīng)用示意圖Fig.1 Schematic diagram of online MIR applying for alcohol precipitation process

2.2 MIR的采集

以空氣為掃描背景；光譜掃描范圍3400～700 cm?1；掃描次數(shù)16次；掃描間隔4 cm?1；根據(jù)樣本取樣時間推算樣本光譜采集時間，1 min內(nèi)連續(xù)的3張光譜的平均值，作為金青醇沉樣本光譜數(shù)據(jù)。MIR掃描結(jié)果見圖2。圖2-A為103個樣品的光譜，圖2-B為Z181123批次中代表性樣品的光譜圖，取樣時間為45、65、85、105、125 min。

圖2 樣品 (A) 和Z181123批次中代表性樣品 (B) 的MIR光譜圖Fig.2 Mid-infrared spectra of samples (A) and typical samples spectra of batch Z181123 (B)

光譜隨著醇沉工藝的進(jìn)行有變化，但是差異不明顯。因中紅外檢測對象是醇沉上清液，上清液中溶劑是水和乙醇的混合液，溶劑濃度的變化及有效成分的含量變化未導(dǎo)致近紅外峰形有很大差異。

2.3 金青醇沉過程中7種指標(biāo)含量的測定

依據(jù)企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用一測多評法[23]，以綠原酸為參照，測定金青醇沉樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的含量；以梔子苷為參照，測定金青醇沉樣品中斷氧化馬錢子苷的含量。

色譜條件：色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%～18%乙腈；5～15 min，18%乙腈；15～38 min，18%～31%乙腈；38～38.5 min，31%～90%乙腈；38.5～40 min，90%乙腈；40～41 min，90%～15%乙腈；41～45 min，15%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫20 ℃；檢測波長為327、238 nm；進(jìn)樣體積10 μL。所有樣本中7種指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果見表2。

表2 所有樣品指標(biāo)成分的含量Table 2 Statistics of content determination values of index components of all samples

2.4 校正集與驗(yàn)證集的劃分

本研究共收集9批數(shù)據(jù)，共計(jì)103個樣品。其中93個樣本用于MIR定量模型的建立，該部分樣本以3∶1比例進(jìn)行校正集與預(yù)測集的劃分，校正集樣本70個，預(yù)測集樣本23個，剩余10個樣作為外部驗(yàn)證集。

2.5 光譜預(yù)處理

MIR不僅能反應(yīng)樣本的化學(xué)組成與濃度，同時也受樣本的黏度、粒度、表面紋理、密度等物理性質(zhì)[11]及雜散光、探頭的材質(zhì)、光的散射的影響。因此，為了建立價(jià)位準(zhǔn)確的定量模型，應(yīng)該用適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理方法來消除背景噪音及特定的物理因素的干擾，提高譜圖與化學(xué)成分之間的相關(guān)性。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate transformation，SNV）、Savitzky-Golay平滑（Savitzky-Golay smoothing，S-G平滑）、歸一化、基線校正、光譜轉(zhuǎn)換（spectroscopic transformation）、分位數(shù)歸一化（quantile normalization）等。

為了降低噪聲、提高信噪比，改善光譜數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)選擇上述光譜預(yù)處理方法對7種指標(biāo)成分的光譜進(jìn)行預(yù)處理，然后結(jié)合偏最小二乘法建立這7種指標(biāo)成分的定量模型。根據(jù)模型評價(jià)指標(biāo)優(yōu)選光譜預(yù)處理方法，以預(yù)測相對偏差（relative standard error of prediction，RSEP）為主要評價(jià)指標(biāo)，RSEP值越小越好，決定系數(shù)R2c與R2p越大越好，校正集誤差均方根（root mean square error of calibration，RMSEC）與交叉驗(yàn)證集誤差均方根（root mean square error of cross validation，RMSECV）越小越好。光譜預(yù)處理結(jié)果見表3。

表3 不同預(yù)處理方法的模型性能參數(shù)Table 3 Model performance parameters of different spectral pretreatment methods

續(xù)表3

從分析結(jié)果看，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷分別以基線校正、無預(yù)處理、分位數(shù)歸一化、無預(yù)處理、無預(yù)處理、無預(yù)處理、光譜轉(zhuǎn)換進(jìn)行光譜預(yù)處理時，RSEP值最小，R2c與R2p值較大，RMSEC與RMSECV值較小，因此采用上述方法進(jìn)行光譜預(yù)處理。

2.6 光譜波段的選擇

選擇最佳的光譜波段，是保證模型穩(wěn)健、準(zhǔn)確的關(guān)鍵，它可以剔除光譜數(shù)據(jù)中無用的信息，能夠有效提高模型的準(zhǔn)確性和有效性。SiPLS法主要用于偏最小二乘建模的波段篩選。將相關(guān)性較大的幾個波段進(jìn)行組合，以組合模型的RMSEC值作為判斷模型精度的標(biāo)準(zhǔn)，得到最佳組合波段區(qū)間。其優(yōu)點(diǎn)縮小了波段范圍，減小了波段優(yōu)選的工作量，避免中紅外建模過程中波段篩選的盲目性。本實(shí)驗(yàn)使用SiPLS法選擇波段區(qū)間。將整個光譜等分為20個等寬的子區(qū)間。最大潛變量因子20，組合數(shù)3。以RMSEC值大小作為選擇最佳檢測波段的標(biāo)準(zhǔn)，其中RMSEC值越小，意味所選波段最佳。光譜篩選結(jié)果見圖3。

圖3 光譜波段篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of spectral bands

對于金青醇沉7種指標(biāo)成分特征波段選擇結(jié)果如下：新綠原酸組合區(qū)間為［13，16，19］，即最佳波段區(qū)間為835～725、1224～1099、1598～1377 cm?1；綠原酸組合區(qū)間為［1，8，12］，即最佳波段區(qū)間為3100～2975、2223～2098、1723～1599 cm?1；隱綠原酸組合區(qū)間為［8，15，18］，即最佳波段區(qū)間為2223～2098、1348～1224、974～849 cm?1；異綠原酸A組合區(qū)間為［1，7，12］，即最佳波段區(qū)間為3100～2975、2347～2223、1723～1599 cm?1；異綠原酸B組合區(qū)間為［15，16，19］，即最佳波段區(qū)間為1348～1224、1224～1099、849～725 cm?1；異綠原酸C組合區(qū)間為［15，16，18］，即最佳波段區(qū)間為1348～1224、1224～1099、973～849 cm?1；斷氧化馬錢子苷組合區(qū)間為［8，9，12］，即最佳波段區(qū)間為2223～2098、2098～1973、1723～1599 cm?1。

7種指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示，紅外光譜的9個重要區(qū)段如表4所示，綜合SiPLS篩選結(jié)果分析可知，新綠原酸和隱綠原酸的特征波段共有區(qū)段相似，它們的特征波段中都具有不飽和碳?xì)涿嫱鈴澢駝印-O的伸縮振動及C-H、O-H的各種面內(nèi)彎曲振動的光譜信息；綠原酸和異綠原酸A的特征波段共有區(qū)段相同，它們的光譜有效信息主要來自于不飽和碳?xì)?、C＝O、C＝C的伸縮震動。異綠原酸B和異綠原酸C的特征波段共有區(qū)段相同，它們的光譜有效信息主要來自于不飽和碳?xì)涿嫱鈴澢駝印-O的伸縮振動及C-H、O-H的各種面內(nèi)彎曲振動。斷氧化馬錢子苷的光譜有效信息主要來自于C＝O、C＝C的伸縮震動。上述篩選結(jié)果說明，SiPLS法識別的指標(biāo)成分的光譜信息具有代表性，是MIR定量模型建立過程的一種有效方法，篩選的特征波段與指標(biāo)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)具有高度相關(guān)性。

圖4 7種指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of seven indicator components

表4 紅外光譜的9個重要區(qū)段Table 4 Nine important segments of infrared spectrum

2.7 模型建立

通過SiPLS法找到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷這7種成分的特征波段，依據(jù)這7種成分的特征波段結(jié)合偏最小二乘法建立中紅外的定量模型，7種指標(biāo)成分建模結(jié)果表5所示。

表5 7種指標(biāo)成分的模型性能參數(shù)Table 5 Model performance parameters of seven index components

從模型的預(yù)測結(jié)果可以看出，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷的模型預(yù)測誤差均小于10%。特征波段所建立的定量模型對熱毒寧注射液金青醇沉階段新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷的預(yù)測均有較好的效果。

2.8 模型外部驗(yàn)證

模型預(yù)測的準(zhǔn)確性需用外部驗(yàn)證集樣本來驗(yàn)證。根據(jù)一測多評法所測各指標(biāo)成分的實(shí)測值與樣本預(yù)測值，計(jì)算相對誤差。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷模型預(yù)測值與樣本實(shí)測值的絕對誤差及相對誤差見表6，結(jié)果顯示這7種指標(biāo)成分的平均相對誤差均小于10%。

表6 驗(yàn)證集樣本預(yù)測值與實(shí)測值的對比Table 6 Comparison of prediction values and measured values of model validation samples

3 討論

本研究以熱毒寧注射液醇沉過程中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷共7個成分為考察對象，采用SiPLS法篩選MIR，得到特征波段，并基于此建立了中紅外定量模型。結(jié)果顯示，所建立的中紅外監(jiān)測方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確。

醇沉過程是中藥生產(chǎn)過程的純化除雜方法，目前我們對于醇沉工藝過程的認(rèn)識不太深入，對于過程中各工藝參數(shù)對質(zhì)控指標(biāo)的影響的理解較為薄弱，采用常規(guī)技術(shù)難以理解過程工藝參數(shù)的波動對醇沉上清液質(zhì)量的影響，造成醇沉上清液批次間的質(zhì)量波動，存在質(zhì)量控制風(fēng)險(xiǎn)。MIR技術(shù)可很好適應(yīng)中藥醇沉機(jī)理和混合體系工況復(fù)雜的情況，能實(shí)現(xiàn)醇沉過程物料的快速檢測，為熱毒寧注射液醇沉工序在線監(jiān)控奠定基礎(chǔ)，也為中藥醇沉過程實(shí)現(xiàn)在線檢測提供技術(shù)支持，拓展了中藥生產(chǎn)在線質(zhì)量控制手段。MIR技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)時，生產(chǎn)過程模型的穩(wěn)定性和傳遞性，是應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注與維護(hù)的地方。后期需定期更新用于模型建立的樣本集，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，不斷提高該模型的穩(wěn)健性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突