穆亞敏 宋志勇 劉啟明 黃 希（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湘潭 410004）

急性肺損傷是臨床上常見的危重疾病，其分子發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍然缺乏有效的防治手段［1］。研究表明，急性肺損傷的發(fā)生與炎癥反應(yīng)有關(guān)［2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的主要成分，其可以引起支氣管上皮細(xì)胞釋放炎癥因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)肺組織損傷發(fā)生，因此，研究LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞炎癥發(fā)生的分子機(jī)制是目前醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點［3］。腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8樣分子-2（tu?mor necrosis factor-αinduced protein 8 like 2，TIPE2）具有免疫負(fù)調(diào)控作用，在淋巴結(jié)等免疫器官以及炎癥組織中廣泛表達(dá)，能夠維持免疫穩(wěn)定［4］。TIPE2具有抗炎作用，其可以有效抑制動脈粥樣硬化炎癥產(chǎn)生，后續(xù)在腦缺血再灌注、心衰等疾病中同樣證實TIPE2具有抑制炎癥浸潤的功效［5-6］。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的研究顯示，TIPE2低表達(dá)可以激活NF-κB信號從而促進(jìn)疾病進(jìn)展［7］。文獻(xiàn)報道表明，TIPE2在哮喘支氣管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放中發(fā)揮抑制作用［8］。本次實驗探討TIPE2在LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制，以期為闡明急性肺損傷炎癥損傷機(jī)制和基因治療急性肺損傷提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細(xì)胞系（16HBE）購自上海美軒生物科技有限公司；LPS購自美國Sigma公司；IL-8含量檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?；TIPE2過表達(dá)載體由云舟生物科技（廣州）有限公司構(gòu)建；PCR試劑購自大連TaKaRa公司；IL-1β含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公 司；Lipo?fectamine 2000購自美國Invitrogen公司；IL-6含量檢測試劑盒購自深圳市金準(zhǔn)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；NF-κBp65抗體、p-ⅠκBαSer32抗體、TIPE2抗體購自美國Abcam公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS對支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2表達(dá)影響檢測 支氣管上皮細(xì)胞分別用0和25μg/ml的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)，分別記為Normal和LPS組，細(xì)胞培養(yǎng)刺激12 h后，收集細(xì)胞用下述RT-PCR和Western blot方法檢測TIPE2表達(dá)變化。RT-PCR：收集細(xì)胞，以Trizol試劑常規(guī)方法提取總RNA，用紫外分光光度計測定RNA樣品在260 nm和280 nm吸光度的比值，比值在1.8～2.0之間可用于后續(xù)實驗。取1μl的RNA，添加1μl 10 mmol/L的dNTP和1μl oligo（dT）primer，以無菌水補(bǔ)足12μl，在65℃下反應(yīng)5 min，然后冰浴10 min；再添加4μl 5×Reaction Buffer、2μl DTT、1μl RNA酶抑制劑，在37℃反應(yīng)2 min，添加1μl的M-MLV RTase，37℃孵育50 min，70℃保溫15 min，將制備的cDNA保存在-20℃。RT-PCR方法定量檢測TIPE2 mRNA表達(dá)。以β-ac?tin作為內(nèi)參，引物序列為：TIPE2上游5′-TCAGAAACATCCAAGGCCAGAC-3′，下游5′-CG?GACCGACCAGCCATTTTAC-3′；β-actin上 游5′-TGCGTGACATCAAAGAGAAG-3′，下游5′-TCCATACCCAAGAAGGAAGG-3′。RT-PCR體系為：上下游引物各0.5μl、12.5μl的SYBR Premix Ex TaqTM、1μl的cDNA，添加ddH2O至25μl，在PCR儀上反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃孵育30 s，95℃孵育5 s，60℃孵育20 s，循環(huán)40次。結(jié)果用2-ΔΔCtCt法計算。

Western blot：收集細(xì)胞，用冰冷的PBS反復(fù)漂洗細(xì)胞3次，然后在細(xì)胞中添加蛋白抽提試劑，置于冰上裂解30 min，4℃12 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清溶液。采用BCA方法測定蛋白濃度，步驟同試劑盒說明書。配制8%的SDS-PAGE凝膠。取蛋白樣品，添加5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，加樣，每孔添加50μg蛋白樣品。采用8 V/cm電壓觀察染料到達(dá)分離膠邊緣后，調(diào)整電壓為15 V/cm繼續(xù)電泳，染料進(jìn)入到凝膠底部1 cm時，將電壓關(guān)閉。在4℃條件下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為110 mA恒流。取出NC膜，在4℃條件下封閉過夜，封閉液用5%的BSA。用TBST洗滌3次，將NC膜放在TIPE2一抗（1：600）中，在37℃反應(yīng)2 h。繼續(xù)以TBST洗滌3次，把NC膜放在以1：3 000稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG中，室溫孵育2 h。采用ECL方法顯色，步驟同ECL顯色試劑盒說明書。Image J分析條帶的吸光度值，內(nèi)參用β-actin，分析TIPE2蛋白表達(dá)變化。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及過表達(dá)效果檢測 收集人支氣管上皮細(xì)胞，用Lipofectamine2000分別把TIPE2過表達(dá)載體（pcDNA3.1-TIPE2）和對照載體（pcDNA3.1）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，步驟完全按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，并且把轉(zhuǎn)染后的支氣管上皮細(xì)胞用25μg/ml的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別命名為LPS+TIPE2和LPS+vector組。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，用RT-PCR和Western blot方法檢測TIPE2表達(dá)變化，步驟同1.2.1。

1.2.3 細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β水平檢測 收集培養(yǎng)12 h后的Normal、LPS、LPS+vector、LPS+TIPE2組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測IL-6、IL-8、IL-1β含量，步驟均參照試劑盒說明書。

1.2.4 細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達(dá)檢測 收集培養(yǎng)12 h后的Normal、LPS、LPS+vector、LPS+TIPE2組細(xì)胞，用Western blot方法檢測細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達(dá)情況，步驟同1.2.1。同時提取培養(yǎng)12 h后的Normal、LPS、LPS+vector、LPS+TIPE2組細(xì)胞核蛋白，蛋白提取步驟參照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒，用Western blot方法檢測NF-κBp65蛋白表達(dá)。

1.2.5 NF-κB信號激活劑對過表達(dá)TIPE2影響支氣管上皮細(xì)胞分泌炎癥因子的作用 取1.2.2轉(zhuǎn)染TIPE2過表達(dá)載體后的支氣管上皮細(xì)胞，用含有1μmol/L的NF-κB激活劑PMA和25μg/ml的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為LPS+TIPE2+PMA組，設(shè)置LPS+TIPE2組作為參照，培養(yǎng)12 h后，用ELISA方法測定上清中IL-6、IL-8、IL-1β含量，Western blot方法測定細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達(dá)情況，步驟均同1.2.1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件分析所得實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均用±s表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較均采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對支氣管上皮細(xì)胞TIPE2、IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κBp65、p-ⅠκBα影響LPS處理后的支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2 mRNA以及蛋白水平均下降，IL-6、IL-8、IL-1β分泌水平升高，細(xì)胞核NF-κBp65蛋白表達(dá)增加（圖1，表1）。

圖1 Western blot方法測定LPS處理后支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2、NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot analysis of expression of TIPE2，NFκBp65，p-ⅠκBαSer 32protein in LPS treated bronchi-al epithelial cells

表1 LPS處理對支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達(dá)、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)影響（±s，pg/ml）Tab.1 Effects of LPS treatment on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

表1 LPS處理對支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達(dá)、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)影響（±s，pg/ml）Tab.1 Effects of LPS treatment on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05.

cell nucleus NF-κBp65 0.13±0.01 0.32±0.031）Groups TIPE2 mRNA TIPE2 protein IL-6 IL-8 IL-1β NF-κBp65 p-ⅠκBαSer 32 Normal LPS 1.00±0.11 0.36±0.021）0.62±0.03 0.21±0.041）145.24±12.02 384.61±32.841）12.35±1.21 72.91±6.171）76.58±6.32 357.16±33.271）0.24±0.03 0.55±0.061）0.20±0.02 0.57±0.041）

2.2 TIPE2過表達(dá)載體對LPS處理的支氣管上皮細(xì)胞TIPE2、IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κBp65、p-ⅠκBα影響 在支氣管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TIPE2過表達(dá)載體，細(xì)胞中TIPE2 mRNA以及蛋白水平均升高，IL-6、IL-8、IL-1β水平降低，細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達(dá)表達(dá)減少，細(xì)胞核NF-κBp65蛋白表達(dá)增加（圖2，表2）。TIPE2過表達(dá)載體可明顯提高LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2表達(dá)水平。

圖2 Western blot方法測定TIPE2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2、NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot analysis of the expression of TIPE2，NF-κBp65，p-ⅠκBαSer 32 protein in bronchial epi-thelial cells under LPS condition after transfection with TIPE2 overexpression vector

表2 TIPE2過表達(dá)載體對LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達(dá)、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細(xì)胞中NFκBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)影響（±s，pg/ml）Tab.2 Effect of TIPE2 over expression vector on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65 and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells under LPS condition（±s，pg/ml）

表2 TIPE2過表達(dá)載體對LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達(dá)、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細(xì)胞中NFκBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)影響（±s，pg/ml）Tab.2 Effect of TIPE2 over expression vector on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65 and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells under LPS condition（±s，pg/ml）

Note：Compared with LPS+vector group，1）P＜0.05.

cell nucleus?NF-κBp65 0.49±0.06 0.63±0.041）Groups TIPE2 mRNA TIPE2 protein IL-6 IL-8 IL-1β NF-κBp65 p-ⅠκBαSer 32 LPS+vector LPS+TIPE2 1.00±0.11 2.35±0.211）0.24±0.05 0.45±0.041）376.54±39.15 264.22±20.831）72.06±5.83 40.59±3.021）354.87±34.96 227.14±20.481）0.57±0.04 0.39±0.041）0.58±0.05 0.33±0.031）

2.3 NF-κB激活劑對過表達(dá)TIPE2的支氣管上細(xì)胞中IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κBp65、p-ⅠκBα的影響NF-κB激活劑PMA處理過表達(dá)TIPE2的支氣管上細(xì)胞，經(jīng)LPS處理，細(xì)胞中的NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白水平升高，細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多（表3，圖3）。NF-κB激活劑逆轉(zhuǎn)過表達(dá)TIPE2對LPS條件下支氣管上細(xì)胞分泌炎癥因子的影響。

表3 NF-κB激活劑對TIPE2過表達(dá)載體影響LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)和分泌IL-6、IL-8、IL-1β作用（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of NF-κB activator on NF-κBp65，p-ⅠκBαSer 32expression and secretion of IL-6，IL-8 and IL-1βin LPS treated bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

表3 NF-κB激活劑對TIPE2過表達(dá)載體影響LPS條件下支氣管上皮細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)和分泌IL-6、IL-8、IL-1β作用（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of NF-κB activator on NF-κBp65，p-ⅠκBαSer 32expression and secretion of IL-6，IL-8 and IL-1βin LPS treated bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

Note：Compared with LPS+TIPE2 group，1）P＜0.05.

Groups LPS+TIPE2 LPS+TIPE2+PMA NF-κBp65 0.40±0.05 0.84±0.091）p-ⅠκBαSer 32 0.37±0.05 0.77±0.061）IL-1β 220.53±25.87 372.96±31.521）IL-6 269.12±22.84 374.25±38.021）IL-8 43.55±4.18 76.83±5.561）

圖3 Western blot測定LPS條件下NF-κB激活劑處理后過表達(dá)TIPE2的支氣管上皮細(xì)胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot analysis of expression of NF-κBp65 and p-ⅠκBαSer 32in bronchial epithelial cells under LPS condition of overexpression of TIPE2 after treatment with NF-κB activator

3 討論

呼吸道以及肺組織中失控炎癥是急性肺損傷發(fā)生的主要原因之一，其炎癥初期往往由革蘭氏陰性菌感染導(dǎo)致［9］。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是常見的誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生的誘導(dǎo)因子［10］。LPS可以促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，從而加快急性肺損傷進(jìn)程。IL-6、IL-8、IL-1β是常見的炎癥因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促進(jìn)作用［11-12］。本次實驗結(jié)果證實LPS處理后的支氣管上皮細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β含量升高，說明LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這與之前的研究報道結(jié)果一致，提示成功構(gòu)建了支氣管上皮細(xì)胞損傷模型。

TIPE2是目前為止研究最多的TNFAIP8家族成員，其是在探討自身免疫腦脊髓炎過程中發(fā)現(xiàn)的，優(yōu)先表達(dá)于炎癥組織和免疫器官［13-14］。TIPE2表達(dá)下調(diào)常常與多種炎癥相關(guān)疾病如糖尿病腎炎、哮喘、肝纖維化等有關(guān)［15-17］。TIPE2可以通過影響下游基因和信號通路的表達(dá)發(fā)揮抗炎功效［18］。研究表明，過表達(dá)TIPE2可以顯著降低哮喘過程支氣管上皮細(xì)胞相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放，TIPE2對于肺組織炎癥可能具有抑制作用［8］。本實驗結(jié)果表明，LPS處理后的支氣管上皮細(xì)胞中TIPE2表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)TIPE2可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞釋放炎癥因子，提示TIPE2在支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

目前對于TIPE2在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制還不明確，已知其可以通過多種方式調(diào)控多種信號通路的激活水平，從而發(fā)揮多重生物學(xué)功效，進(jìn)而參與疾病進(jìn)展［19］。在缺血再灌注損傷研究過程中發(fā)現(xiàn)TIPE2可以抑制心肌炎癥細(xì)胞浸潤，抑制NF-κB信號通路的激活［20］。NF-κB是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其可以被多種因子刺激而激活，NF-κB是一個由Rel家族成員構(gòu)建的二聚體蛋白，其中NF-κBp65和p-ⅠκBαSer32是NF-κB信號激活水平的標(biāo)志蛋白［21］。NFκB信號與炎癥反應(yīng)有關(guān)，其激活后可促進(jìn)炎癥反應(yīng)［22-23］。研究顯示，LPS可以誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞中NF-κB信號激活，NF-κB信號在急性肺損傷中發(fā)揮促進(jìn)作用［24］。本實驗表明，過表達(dá)TIPE2可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞中NF-κB信號激活，并且NF-κB信號激活劑能夠逆轉(zhuǎn)TIPE2的抗炎因子釋放作用，這說明TIPE2在支氣管上皮細(xì)胞釋放炎癥因子與NF-κB信號有關(guān)。

總而言之，TIPE2在急性肺損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用，TIPE2在LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥因子釋放中發(fā)揮抑制作用，其作用機(jī)制與下調(diào)NFκB信號激活程度有關(guān)。本次實驗結(jié)果為研究急性肺損傷發(fā)生機(jī)制及TIPE2作用機(jī)制提供參考及依據(jù)。在后期的實驗中會繼續(xù)研究TIPE2在急性肺損傷中的作用以及其對下游信號通路的影響。