黃輝，于大海，黃炫賡，羅智杰

廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，南寧530001

糖尿病是臨床常見的慢性代謝紊亂性疾病，其高血糖環(huán)境能誘發(fā)多種并發(fā)癥，疾病負擔較重［1］。糖尿病牙周炎是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，最終因牙周支持組織破壞導致牙齒松動、脫落［2-3］。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）是蛋白質(zhì)、核酸等大分子自發(fā)與葡萄糖等還原單糖在無酶參與條件下生成的穩(wěn)定共價加成物，與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生相關［4］。牙周膜成纖維細胞（PDLCs）是牙周膜中最主要的細胞，其在刺激下產(chǎn)生的炎癥反應在牙周炎進展中發(fā)揮重要作用［5］。p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子κB（NF-κB）通路是炎癥相關通路，可被AGEs引起的氧化應激反應誘導激活，誘發(fā)一系列炎癥反應［6-7］。二甲雙胍是糖尿病治療的一線用藥，研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以調(diào)控凋亡相關蛋白Caspase-3表達，抑制AGEs誘導人皮膚成纖維細胞凋亡反應［8］，但對AGEs誘導PDLCs凋亡的影響尚缺乏研究。2019年8月—2020年6月，我們采用AGEs誘導PDLCs凋亡，觀察二甲雙胍對AGEs誘導的PDLCs凋亡及p38 MAPK/NF-κB通路的影響，旨在為糖尿病牙周炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與藥物 人PDLCs細胞株購自美國Sciencell公司，AGEs購自英國Biorbyt公司，二甲雙胍（國藥準字H20023371）購自中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清購自澳大利亞Aus?GeneX公司，DMEM培養(yǎng)基購自德國Merck公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所。AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自哈爾濱新?；驒z測有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。p-p38 MAPK抗體、p38 MAPK抗體、NF-κB p65抗體、GAPDH抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔購自美國Santa公司。恒溫培養(yǎng)箱購自美國Shellab公司；全自動酶標儀（MODEL550）購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀（BD FACSCantoⅡ）購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取PDLCs細胞，加入含10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液1次，待細胞生長至85%左右融合時傳代，傳代3次后，選擇生長良好的對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 AGEs最佳作用濃度與作用時間的篩選 取對數(shù)生長期細胞，加入培養(yǎng)液稀釋為1×105/mL，以100μL/孔接種于96孔板。將細胞分為4組，分別加入0、100、200、300μg/mL的AGEs，放入培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。于培養(yǎng)24、48、72 h時采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，48 h和72 h時，300μg/mL AGEs處理的細胞OD值較0μg/mL AGEs處理的細胞降低50%以上，故以300μg/mL和48 h作為AGEs最佳作用濃度和作用時間。

1.4 細胞分組與處理 取對數(shù)生長期細胞，加入培養(yǎng)液稀釋為1×105/mL，以100μL/孔接種于96孔板。將細胞分為對照組、AGEs組及2、4、8 mmol/L二甲雙胍組，對照組僅加入培養(yǎng)基，AGEs組加入終濃度為300μg/mL的AGEs，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組加入終濃度為300μg/mL的AGEs及終濃度分別為2、4、8 mmol/L的二甲雙胍，培養(yǎng)48 h。

1.5 細胞增殖觀察 采用CCK-8法。收集各組細胞，加入20μL CCK-8試劑，避光條件下孵育2 h；加入200μL DMSO，避光條件下震蕩10 min。使用全自動酶標儀檢測波長450 nm處的光密度（OD）值。

1.6 細胞凋亡觀察 采用流式細胞術。收集各組細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞密度為1×106/mL的細胞懸液。取200μL細胞懸浮液，按照AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，依次加入5μL AnnexinⅤ-FITC溶液、10μL PI染液混勻，避光條件下孵育1 h，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，以早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞占總細胞量的比例表示凋亡率。

1.7 細胞中SOD、MDA水平檢測 采用ELISA法。收集各組細胞，加入細胞裂解液充分裂解，分別按照SOD、MDA試劑盒說明書步驟，使用全自動酶標儀測定450 nm、532 nm波長處的OD值，計算SOD活性和MDA含量。

1.8 細胞上清液中IL-6、TNF-α水平檢測 采用ELISA法。收集各組細胞，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟，使用全自動酶標儀測定450 nm波長處的OD值，根據(jù)標準液OD值結(jié)果計算IL-6、TNF-α水平。

1.9 細胞p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。取總蛋白50μg與蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5 min，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h。洗膜，分別加入p-p38 MAPK抗體、p38 MAPK抗體、NF-κB p65抗體和GAPDH抗體（稀釋比例1∶500）4℃孵育過夜；洗膜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔第二抗體（稀釋比例1∶2 000），室溫孵育1 h。免疫反應化學發(fā)光法顯色、曝光、顯影、定影、晾干，對條帶進行灰度掃描。以NF-κB p65與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示NF-κB蛋白的相對表達量，以p-p38 MAPK與p38 MAPK灰度值的比值表示p38 MAPK的活化程度。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較進行SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖情況比較 對照組、AGEs組以及2、4、8 mmol/L二甲雙胍組的OD值分別為0.59±0.06、0.24±0.03、0.33±0.03、0.40±0.03、0.49±0.05。與對照組相比，AGEs組OD值降低（P<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組OD值升高（P均<0.05），其中8 mmol/L組高于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組高于2 mmol/L組（P均<0.05）。

2.2 各組細胞凋亡情況比較 對照組、AGEs組以及2、4、8 mmol/L二甲雙胍組的細胞凋亡率分別為8.02%±1.11%、47.46%±3.86%、35.88%±3.97%、28.93%±3.72%、15.24%±1.69%。與對照組相比，AGEs組細胞凋亡率升高（P<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細胞凋亡率降低（P均<0.05），其中8 mmol/L組低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組低于2 mmol/L組（P均<0.05）。

2.3 各組細胞中SOD、MDA水平比較 與對照組相比，AGEs組細胞中SOD活性降低，MDA水平升高（P均<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細胞中SOD水平升高，MDA水平降低（P均<0.05），其中8 mmol/L組SOD高于、MDA低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組SOD高于、MDA低于2 mmol/L組（P均<0.05）。見表1。

2.4 各組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平比較 與對照組相比，AGEs組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平升高（P均<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平降低（P均<0.05），其中8 mmol/L組低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組低于2 mmol/L組（P均<0.05）。見表2。

表1 各組細胞中SOD、MDA表達水平比較（xˉ±s）

表2 各組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，xˉ±s）

2.5 各組細胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達比較 與對照組相比，AGEs組細胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達均升高（P均<0.05）；與AGEs組相比，2、4、8 mmol/L二甲雙胍組細胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達均降低（P均<0.05）；其中8 mmol/L組低于2、4 mmol/L組，4 mmol/L組低于2 mmol/L組（P均<0.05）。見表3。

表3 各組細胞中p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白相對表達量比較（xˉ±s）

3 討論

AGEs是葡萄糖等還原糖的醛基與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)的氨基基團經(jīng)過一系列復雜反應，在非酶促條件下形成的穩(wěn)定共價加成物，能與其相應受體RAGEs相互作用或直接修飾蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等誘發(fā)氧化應激反應，進而引起機體各類細胞的炎癥等反應［9-10］。PDLCs是牙周結(jié)締組織的主要細胞成分，能夠合成并分泌多種細胞因子，在牙周組織的形成和再生、牙周組織的改建、牙周膜組織的完整性維持中發(fā)揮關鍵作用［11］。本研究結(jié)果顯示，在不同濃度AGEs的作用下，PDLCs細胞增殖能力均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，表明AGEs可影響PDLCs細胞的增殖和凋亡過程。

二甲雙胍是一線口服降糖藥，能有效降低血糖，且不良反應小。近年研究表明，二甲雙胍還具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等生物學特性［12］。ZHOU等［13］報道，二甲雙胍可以有效治療糖尿病牙周炎小鼠的牙周感染和組織破壞，并降低血糖及血清IL-1β水平。本研究結(jié)果顯示，與AGEs組相比，不同濃度二甲雙胍組細胞增殖能力均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；且二甲雙胍越高，其促進細胞增殖，降低細胞凋亡的效果越明顯。這表明二甲雙胍對AGEs誘導的PDLCs細胞凋亡具有抑制作用，同時促進其增殖再生。

SOD、MDA分別為氧化應激反應中的抗氧化應激標志物及氧化應激標志物。改善機體氧化應激水平是治療糖尿病牙周炎的的重要作用機制［14］。ARAúJO等［15］報道，50 mg/kg二甲雙胍可以減輕結(jié)扎誘導的牙周炎大鼠的炎癥反應、氧化應激和骨質(zhì)流失。金領微等［16］報道，二甲雙胍能通過調(diào)節(jié)氧化應激、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應減輕腎缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示，加入二甲雙胍干預后，PDLCs細胞中SOD水平升高、MDA水平降低，提示二甲雙胍可通過上調(diào)SOD水平、下調(diào)MDA水平，抑制AGEs在PDLCs細胞中引起的氧化應激反應。

IL-6、TNF-α均為重要的炎癥因子，在慢性炎癥狀態(tài)下大量產(chǎn)生，促使炎癥狀態(tài)不斷延長，加重對牙周組織的破壞［17］。研究顯示，炎癥反應與氧化應激同為糖尿病牙周炎的重要發(fā)病機制［14］。QU等［18］報道，二甲雙胍可抑制脂多糖誘導的血管平滑肌細胞的炎癥反應。本研究結(jié)果顯示，PDLCs細胞加入AGEs后，細胞上清液中IL-6、TNF-α水平顯著升高，提示AGEs可誘導炎癥因子IL-6、TNF-α大量釋放。給予二甲雙胍干預后，PDLCs細胞上清液中IL-6、TNF-α水平均降低，提示二甲雙胍可抑制AGEs引起的炎癥反應。

NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在不同類型細胞中存在，能控制多種基因的表達。正常情況下，NF-κB處于非活化狀態(tài)，以功能性亞基p65和抑制性亞基IκBα結(jié)合的復合物形式存在于細胞質(zhì)中，應激反應條件下，IκBα被降解，p65被釋放并轉(zhuǎn)移至細胞核中，直接與DNA結(jié)合引起基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控［6，19］。p38 MAPK是NF-κB的上游激酶，屬于應激性蛋白激酶，在炎癥因子、氧化應激等作用下激活，由細胞質(zhì)進入細胞核中進一步誘導NF-κB活化，最終導致細胞產(chǎn)生大量炎癥因子［20-21］。本研究結(jié)果顯示，加入AGEs后，PDLCs細胞p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達明顯升高，提示AGEs可激活p38 MAPK/NF-κB通路可能進一步導致炎癥因子IL-6、TNF-α大量釋放［22］。給予二甲雙胍干預后，PDLCs細胞中p-p38 MAPK/p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表達降低，提示二甲雙胍可降低p38 MAPK磷酸化及NF-κB活化水平，可能通過降低AGEs引起的氧化應激反應，抑制p38 MAPK/NF-κB通路激活，減輕炎癥反應程度［23］。

綜上所述，二甲雙胍可降低AGEs誘導的PDLCs細胞中的氧化應激反應，并通過抑制p38 MAPK/NF-κB通路活性降低炎癥反應程度，從而抑制細胞凋亡并促進細胞增殖，可能為二甲雙胍治療糖尿病牙周炎提供實驗依據(jù)。