許曉蒙,孫發(fā)鑫,馮瑩瑩,郭文娜,袁 夢,許 卉

(煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005)

淫羊藿是典型的補(bǔ)陽中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)、箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim.)或朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥葉[1]。淫羊藿味辛、甘,性溫,歸肝、腎經(jīng),有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗抑郁、降血糖、提高免疫力等藥理活性,廣泛用于陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等癥[2-5]。現(xiàn)代化學(xué)與生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),天然異戊二烯基黃酮醇類成分是淫羊藿的主要功效成分,其中以淫羊藿苷(icariin, ICA)天然含量最高,各版《中國藥典》都規(guī)定其為淫羊藿及相關(guān)制品的質(zhì)量控制指標(biāo)成分[6-8]。

圖1 淫羊藿苷相關(guān)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

ICA是一種天然黃酮苷，極易水解生成淫羊藿次苷I(icariside I, ICA I)、淫羊藿次苷II(icariside II, ICA II)和淫羊藿素(icaritin, ICT)等脫糖產(chǎn)物,是ICA發(fā)揮生理活性的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)[9-11]。研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物能夠抑制人肺癌細(xì)胞的體外增殖,其機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞S期阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。在相關(guān)品種的質(zhì)量控制中,淫羊藿苷脫糖產(chǎn)物相應(yīng)受到重視。現(xiàn)行《中國藥典》對于羊脂油炒制的炙淫羊藿飲片,即在“含量測定”項下即明確規(guī)定:本品按干燥品計算,含淫羊藿苷和寶藿苷I(baohuoside I,即ICA II)的總量不得少于0.60%[1]。目前尚缺少針對ICA及其脫糖產(chǎn)物生物活性差異特性比較的系統(tǒng)研究。

本研究以天然含量豐富的ICA為原料,制備系列脫糖產(chǎn)物ICA I、ICA II和ICT,基于穩(wěn)定、可控的腫瘤細(xì)胞體外增殖模型,評價ICA及其脫糖產(chǎn)物對幾種常見、高發(fā)人源腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制活性,定量比較這類成分的抗腫瘤活性差異,并篩選敏感作用瘤株,為中藥淫羊藿及其制品的質(zhì)量控制和開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司),CO2培養(yǎng)箱(Thermo),離心機(jī)(Eppendorf),CKX31型倒置顯微鏡(菲律賓奧林巴士公司),酶標(biāo)儀(DNM-9602 MICROPLATE READER),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司),恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),Aglient 1100 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

淫羊藿苷(上海茁采生物科技有限公司,批號:20190506),淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷II、淫羊藿素對照品(中國食品藥品檢定研究院),阿霉素(DOX,北京偶合科技有限公司),人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞A-549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29(ATCC,中科院上海細(xì)胞庫),DMEM培養(yǎng)基(HyClone Laboratories),胎牛血清(NQBB International Biological Corporation),青霉素-鏈霉素溶液、胰酶消化液(Beyotime Biotechnology Co.Ltd),MTT、DMSO(Sigma-Aldrich),甲醇、乙腈(Fisher),超純水(實驗室自制),ODS(青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司),蝸牛酶(上海萌椏生物科技有限公司),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 脫糖產(chǎn)物制備與測定

1.2.1 ICA I制備 稱取ICA 100 mg,置100 mL圓底燒瓶中,加適量無水乙醇溶解;加5%硫酸25 mL,置50 ℃水浴中攪拌反應(yīng),TLC監(jiān)測。至反應(yīng)結(jié)束后,加適量去離子水稀釋反應(yīng)液,離心(9000 r·min-1, 10 min),去上清,下層沉淀加水洗至中性,行ODS柱色譜分離純化,以CH3OH-H2O混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫,HPLC監(jiān)測,收集目標(biāo)餾分,濃縮干燥,得黃色固體(58.9 mg)。

1.2.2 ICA II制備 稱取ICA 100 mg,置100 mL圓底燒瓶中,加適量DMSO溶解,加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.1 molL-1,pH 6.0)、100 mg蝸牛酶,置37 ℃水浴中攪拌反應(yīng),TLC監(jiān)測。至反應(yīng)結(jié)束后,離心(9000 r·min-1,10 min),去上清,取下層沉淀加甲醇溶解后過濾,濾液濃縮干燥后進(jìn)行重結(jié)晶純化(CH3OH-H2O),得黃色針狀晶體(51.2 mg)。

1.2.3 ICT制備 稱取ICA 100 mg,置100 mL圓底燒瓶中,加入2.5 mL硫酸溶液(5 mol·L-1,加9 mL 80%冰醋酸溶液,至于70 ℃水浴中攪拌反應(yīng),TLC監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后離心(9000 r·min-1,10 min),去上清,沉淀以10倍超純水洗至中性,過濾后ODS柱色譜分離純化,以CH3OH-H2O混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫,HPLC監(jiān)測,收集目標(biāo)餾分,濃縮干燥,得黃色固體(24.1 mg)。

1.2.4 HPLC測定 色譜分離采用Agilent-TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-水混合溶劑梯度洗脫(0～5 min,35∶65;5～10 min,35∶65→70∶30;10～45 min,70∶30),柱溫30 ℃,流速1 mL·min-1,檢測波長270 nm;待測試樣加流動相制成20～100 μg·mL-1的溶液進(jìn)樣測定,進(jìn)樣量20 μL。

1.3 體外細(xì)胞增殖活性測定

1.3.1 樣品制備 將ICA、ICA I、ICAII和ICT溶于DMSO(細(xì)胞培養(yǎng)級)中,分別配制成作用濃度為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0和30.0 μmol·L-1的DMSO溶液,-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人源腫瘤細(xì)胞(SMMC-7721、MCF-7、HT-29、A-549)細(xì)胞于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)介質(zhì)為含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。1～2 d傳代一次,取對數(shù)生長期細(xì)胞,備用。

1.3.3 MTT法測定 取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,按2×104個/mL的密度接種至96孔板,每孔200 μL,于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后,加不同濃度試驗藥物(0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L-1)培養(yǎng)24 h,于每孔中加入10 μL MTT(終濃度500 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h(5% CO2、37 ℃),棄去上清,加入DMSO 150 μL,振搖至藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解,以630 nm為參比波長,用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度A570。試驗藥物各濃度均設(shè)置3平行復(fù)孔,同時進(jìn)行空白組測定,并以阿霉素(DOX)作為陽性對照藥,濃度為(0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L-1)。根據(jù)吸光度測定結(jié)果,按(1-實驗組平均A570值/空白對照組平均A570值)×100%計算細(xì)胞生長抑制率(%),并經(jīng)SPSS 25.0回歸分析,計算得抑制作用的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié) 果

2.1 脫糖產(chǎn)物制備結(jié)果

以ICA為原料,通過不同反應(yīng)和純化工藝條件,制備獲得三種脫糖產(chǎn)物。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品在相同色譜條件下的HPLC圖譜對比分析(圖2),確證所制得的化合物分別為ICA脫除C-3-鼠李糖或C-7-葡萄糖所得的單脫糖產(chǎn)物ICA I、ICA II,以及同時脫除C-3-鼠李糖和C-7-葡萄糖所得的雙脫糖產(chǎn)物,即淫羊藿苷的苷元ICT。

圖2 三種脫糖產(chǎn)物純度檢查的HPLC圖譜

根據(jù)HPLC分析結(jié)果,在目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證基礎(chǔ)上,進(jìn)一步測定各脫糖產(chǎn)物的純度和收率,見表1。結(jié)果表明,利用本研究建立的脫糖反應(yīng)及純化工藝條件,能夠制備滿足生物活性評價需要的淫羊藿苷脫糖產(chǎn)物。

表1 ICA脫糖產(chǎn)物制備收率及純度檢查結(jié)果

2.2 淫羊藿黃酮對腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用

選擇四種常見、高發(fā)的人源腫瘤細(xì)胞開展體外實驗,包括人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、肺癌細(xì)胞A-549、結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞株,同時評價了ICA及其單脫糖ICA I、ICA II和雙脫糖產(chǎn)物ICT四種黃酮類成分的體外抑制作用強(qiáng)度及量效關(guān)系。

2.2.1 ICA及其脫糖產(chǎn)物對四種腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用 終濃度為0.1～30 μmol·L-1的ICA、ICA I、ICA II、ICT作用24 h后,對四種腫瘤細(xì)胞的平均增殖抑制率見圖3所示。除 ICA以外,ICA I、ICA II和ICT對四種腫瘤增殖的抑制率均具有濃度依賴性(P<0.05)。

圖3 ICA及ICA脫糖產(chǎn)物對四種腫瘤細(xì)胞體外增殖的影響

2.2.2 三種脫糖產(chǎn)物對四種腫瘤細(xì)胞IC50值 計算ICA I、ICA II和ICT對四種腫瘤細(xì)胞的IC50值，結(jié)果見表2。

表2 ICA I、ICA II、ICT對人源腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用的

由表2可見,三種脫糖產(chǎn)物中,ICA II對四種腫瘤細(xì)胞的IC50值均為最低,表明其增殖抑制效果最顯著。此外,從ICA II對四種腫瘤細(xì)胞的IC50值對比可見,ICA II對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的IC50值最低,為1.26 μmol·L-1,表明SMMC-7721對ICA II的抑制作用最為敏感。由于ICA在0.1～30 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對四種腫瘤細(xì)胞最大抑制率均小于50 %,故無法計算IC50值。

3 討 論

具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性的天然產(chǎn)物始終是現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源,多達(dá)半數(shù)以上的臨床藥物與天然產(chǎn)物有關(guān),如青蒿素、紫杉醇、喜樹堿等。尤其在惡性腫瘤治療領(lǐng)域,傳統(tǒng)中藥的功效成分因具有高效、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等臨床優(yōu)勢,日益引起研究關(guān)注[13-14]。利用天然活性成分為先導(dǎo)化合物衍生出低毒、高效的生物活性物質(zhì),在新藥研發(fā)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大作用。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷及其脫糖衍生物具有潛在抗腫瘤潛力[15],值得開展進(jìn)一步的深入評價。本研究基于穩(wěn)定、可控的腫瘤細(xì)胞體外增殖抑制模型,對包括脫糖代謝產(chǎn)物在內(nèi)的淫羊藿黃酮類化合物進(jìn)行抗腫瘤活性比較,并篩選發(fā)現(xiàn)敏感瘤株,以期為這類天然產(chǎn)物的合理開發(fā)應(yīng)用以及淫羊藿相關(guān)產(chǎn)品的科學(xué)質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)中藥學(xué)認(rèn)為淫羊藿味辛、甘,性溫,歸肝、腎經(jīng)。據(jù)文獻(xiàn)報道,味辛、甘,性溫,歸肝經(jīng)類中藥普遍具有抗腫瘤的功效[16]。劉鐵漢等[17]對大鼠口服ICA后的排泄物進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)ICA在大鼠腸道環(huán)境中轉(zhuǎn)化為ICA II后吸收入血,ICA II對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2的抗腫瘤活性優(yōu)于其他黃酮類成分。本研究結(jié)果表明ICA II對人肺癌細(xì)胞(A-549)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)和肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)的抗腫瘤活性明顯優(yōu)于其他三種黃酮類物質(zhì),并通過比較ICA II對人肺癌細(xì)胞(A-549)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)和肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)的抗腫瘤活性,發(fā)現(xiàn)ICA II對人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)具有更顯著的抗腫瘤作用。淫羊藿兼具保肝、護(hù)肝等功效,因此從傳統(tǒng)中藥中開發(fā)肝癌治療新藥角度來看,ICA II具有潛在的抗腫瘤藥用價值。

4 結(jié) 論

本研究以淫羊藿苷為原料合成了淫羊藿次苷I和淫羊藿次苷II,比較了淫羊藿苷及其三種脫糖代謝物之間的抗腫瘤活性差異,并篩選敏感腫瘤細(xì)胞株,最終確定淫羊藿次苷II相較于淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿素對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng),且篩選出SMMC-7721為最敏感細(xì)胞株,為淫羊藿黃酮類化合物的抗腫瘤開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。