鐘 薇,蘇 穎,李志明,王愛萍, 2,孟慶國,梁榮財, 2

(1.煙臺大學藥學院,煙臺大學新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),山東 煙臺 264005;2.山東綠葉制藥有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室,山東 煙臺 264003)

全世界曾經(jīng)感染過乙肝病毒的人高達13億人,其中約2.57億人發(fā)展為慢性乙型肝炎[1-2]。恩替卡韋作為治療慢性乙肝的一線用藥,具有很好的抗病毒治療效果以及較低的耐藥率,但其不能直接消滅乙肝病毒,只能抑制乙肝病毒DNA復制[3],因此,患者需長期用藥來控制疾病發(fā)展。另外,恩替卡韋需要每日空腹服藥,這會引起胃腸道副反應,導致患者依從性差,常有患者自行停藥的情況發(fā)生,這可能會導致乙肝病毒反跳,進一步加重肝臟損害[4],造成病情惡化。因此,將恩替卡韋開發(fā)成長效緩釋制劑很有意義。

微球是目前研究較多的藥物控釋系統(tǒng),與口服劑型相比,其優(yōu)勢明顯,如減少給藥次數(shù)、提高患者依從性、延長藥物作用時間、提高藥效等[5-7]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是微球給藥系統(tǒng)中最常用的生物可降解材料,由于其具有良好的生物相容性、可調(diào)節(jié)的機械性能以及良好的成膜性[8],使這種聚合物適用于藥物控釋系統(tǒng)。

在本研究中,以PLGA為微球載體材料,采用S/O/W乳化-溶劑揮發(fā)法制備恩替卡韋PLGA微球,采用Box-Behnken響應面法對工藝參數(shù)進行優(yōu)化,篩選出最優(yōu)處方;對微球的載藥量、包封率、粒徑以及其表面形貌進行評價,并考察其體外釋放行為。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

恩替卡韋一水合物(濟南宏方德醫(yī)藥科技有限公司);PLGA(8515 DLG 5A,Lakeshore公司);二氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司,分析純);甲醇(德國Merck公司,色譜純); PVA(德國EMD公司);吐溫80(南京威爾化工有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS, 福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 恩替卡韋微球的制備

將PLGA溶于10 mL二氯甲烷中,攪拌使其溶解,形成油相(O),加入恩替卡韋原料藥,形成S/O懸浮液, 6000 r/min均質(zhì)20 s使其充分混勻后,緩慢加入到PVA水溶液中, 1000 r/min高速剪切3 min形成軟球,轉(zhuǎn)移至機械攪拌器內(nèi)繼續(xù)以300r/min的速度攪拌5 h以固化微球,將所得溶液以100目+1200目過濾收集微球,并用去離子水沖洗3遍,放入冷凍干燥機中凍干即得恩替卡韋微球。

1.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化微球制備

在本課題組之前實驗的基礎(chǔ)上,采用三因素三水平優(yōu)化處方。將PLGA質(zhì)量濃度、PVA體積分數(shù)、水油比作為自變量,將載藥量、包封率、粒徑作為響應。每個自變量選取三個水平,編碼為-1(低)、0(中)、+1(高),如表1所示。

表1 響應面法的自變量選取及其水平

1.4 高效液相色譜法條件

使用Agilent C18分析柱(4.6 mm×25 cm,5 μm),流動相A(甲醇)∶流動相B(水)=20∶80,流速為1 mL·min-1,進樣體積為20 μL,柱溫為40 ℃,紫外檢測波長為254 nm。恩替卡韋的保留時間為5 min,記錄其峰面積。

1.5 微球載藥量及包封率的測定

精密稱取恩替卡韋微球10 mg,置于50 mL離心管中,加入2 mL二氯甲烷,超聲使其溶解,加入30 mL流動相,以3600 r/min的速度離心10 min,吸取上清液,按“1.4”項下高效液相色譜法進行微球載藥量的測定。微球的載藥量和包封率分別以下式計算:

載藥量=微球中恩替卡韋的質(zhì)量/微球總質(zhì)量×100%,

包封率=實際載藥量/理論載藥量×100%.

Model Builder在建設(shè)用地報批線狀地物面積自動扣除中的應用 張海龍，趙耀龍，葉 璐(3-8)

1.6 微球表面形態(tài)及粒徑的測定

使用掃描電子顯微鏡觀察微球的表面形貌。將微球固定于導電膠上,噴金后放入掃描電子顯微鏡中觀察。

使用馬爾文3000粒度分析儀測定粒徑。以0.1%吐溫20溶液為分散介質(zhì),加入微球后使其分散混勻。平行測定3次,取其平均值作為測量結(jié)果。

1.7 微球體外釋放的測定

將10 mg恩替卡韋微球置于15 mL離心管中,加入10 mL PBS緩沖液(pH值7.4，10 mmol/L)。將離心管放入37 ℃恒溫水浴振蕩器中,以50 r/min的速度震蕩。分別在30 min、1 h、3 h、6 h、10 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、10 d、13 d、15 d、17 d、20 d、23 d、27 d、31 d、34 d、38 d、41 d、45 d、50 d、55 d、59 d取出離心管,以3600 r/min的速度離心10 min,取出9 mL上清液,同時補入等量的新鮮釋放介質(zhì)。按“1.4”項下高效液相色譜法測定上清液中的藥物含量,計算其釋放度。以累計釋放百分比對其時間作圖,得到藥物的累計釋放曲線。

1.8 微球的釋放動力學研究

分別使用零級、一級、Higuchi方程和Korsmeyer-Peppas方程對釋藥曲線進行擬合,以確定恩替卡韋微球的釋藥機理。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 微球處方優(yōu)化及結(jié)果

采用三因素三水平Box-Behnken設(shè)計對處方參數(shù)進行優(yōu)化,17次實驗結(jié)果如表2所示。使用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行擬合,其多項式模型如下所示:

表2 Box-Behnken設(shè)計及其結(jié)果

(1)載藥量模型Y1:

Y1=19.74+0.38A+0.40B-0.28C-1.02AB-0.25AC-0.45BC-1.11A2-1.12B2-2.62C2。

(2)包封率模型Y2:

Y2=78.99+1.52A+1.60B-1.12C-4.07AB-1.00AC-1.79BC-4.45A2-4.52B2-10.51C2。

(3)粒徑模型Y3:

Y3=96.26+24.64A-0.79B+14.63C-0.93AB+8.75AC+1.1BC+1.73A2+2.08B2-5.64C2。

采用方差分析檢驗模型是否具有統(tǒng)計學意義,在0.05顯著性水平下進行檢驗,其結(jié)果如表3所示。F值越大,P值越小,說明該模型越具有統(tǒng)計學意義。從表3可知,Y1、Y2、Y3的F值均較大,P值均小于0.000 1,說明該模型極具有統(tǒng)計學意義。模型失擬項的P值均大于0.05(分別為0.054 6、0.074 6、0.065 6),表明失擬項不顯著,由此證明該模型可信度較高。Y1、Y2、Y3的R2值均大于0.8(分別為0.988 3、0.987 9、0.998 0),說明實驗結(jié)果與預測結(jié)果之間有良好的相關(guān)性。綜上所述,該模型精密度和可靠性較高。

表3 Box-Behnken設(shè)計的方差分析

圖1為載藥量模型的三維響應曲面圖。由圖1可知,載藥量隨著ρ(PLGA)和φ(PVA)的升高而增加。這可能是因為當ρ(PLGA)增加時,有機相的粘度也增加,較高的有機相粘度會使PLGA液滴快速凝固,從而減少藥物向水相中滲漏[9-10]。PVA作為O/W的乳化劑,濃度的增加確保了更穩(wěn)定的乳化體系生成,減少藥物的損失。

圖1 載藥量模型的三維響應面圖

圖2為包封率模型的三維響應曲面圖。由圖2可知,其變化趨勢與載藥量模型基本一致。因為包封率的測定是以實際載藥量與理論載藥量的比值確定的,而在17次實驗中理論載藥量均不變。

圖2 包封率模型的三維響應面圖

圖3為粒徑模型的三維響應曲面圖,由圖3可知,微球的粒徑隨著ρ(PLGA)和水油比的增加而增大。當ρ(PLGA)較高時,形成初乳所需的能量大。這意味著當均質(zhì)速度相同時,ρ(PLGA)高的處方將產(chǎn)生更大的粒徑[11]。此外,由于ρ(PLGA)的增加,在乳化和微粒形成的過程中可能會發(fā)生碰撞,導致液滴聚集,粒徑增大[12]。由于油相體積不變,當水油比增加時,溶液的整體體積增加,在均質(zhì)速率不變的情況下,剪切效率下降,從而產(chǎn)生較大粒徑的微球。

圖3 粒徑模型的三維響應面圖

載藥量、包封率、粒徑是微球評價的重要指標,從響應面分析結(jié)果來看,伴隨著微球載藥量的提高,粒徑也相應的增大,以至于不能滿足注射要求。因此,選擇最大載藥量和包封率、最小的粒徑作為優(yōu)化指標,得到的最優(yōu)制備處方為:PLGA質(zhì)量濃度(A)為0.13 g·mL-1,PVA體積分數(shù)(B)為1.2%,水油比(C)為91∶1,載藥量為19.56%,包封率為78.28%,粒徑為85.3 μm。

制備了3批以最優(yōu)條件為處方的平行樣品,其結(jié)果如表4所示。由表4可以看出,驗證實驗結(jié)果與其預測值非常接近,誤差較小,由此證明了該模型的準確性,說明可以利用此模型進行恩替卡韋微球的優(yōu)化。

表4 模型的實驗值與預測值的比較

2.2 微球的表面形態(tài)

使用掃描電子顯微鏡對優(yōu)化后的恩替卡韋微球的表面形態(tài)進行了觀察,其表面形態(tài)如圖4所示。恩替卡韋微球呈球形,結(jié)構(gòu)致密無孔,表面附著的微晶粒子可能是在制備過程中沒有被包載的原料藥,球體表面呈光滑態(tài)。

圖4 恩替卡韋微球的表面形態(tài)

2.3 微球的體外釋放

恩替卡韋微球在PBS緩沖液中的釋放情況如圖5所示。恩替卡韋微球的釋放呈雙相,先是一段快速釋放時期,在13 d后進入緩慢釋放階段,一直持續(xù)到第59天,釋放結(jié)束。第一階段的快速釋放可能是因為制備過程中溶劑對流導致微球表面附近藥物濃度增加[13]。第二階段的釋放較第一階段相對緩慢,因為這一階段的釋放主要是由PLGA降解所控制的。隨著時間的延長,PLGA逐漸水解為低聚物或單體產(chǎn)物,微球表面和內(nèi)部形成孔道,這為微球內(nèi)部的藥物通過擴散和侵蝕釋放提供了條件[8]。

圖5 恩替卡韋微球在37 ℃ PBS緩沖液中的釋放情況

2.4 微球的釋放動力學研究

為了研究恩替卡韋微球的釋藥機理,分別采用零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi模型以及Korsmeyer-Peppas模型對釋藥曲線進行擬合,其結(jié)果如表5所示。R2越接近于1,說明該模型能更好地擬合微球的釋放行為。一級動力學方程、Higuchi模型以及Korsmeyer-Peppas模型均能較好地擬合釋放曲線,但相比而言,一級動力學方程更適合解釋恩替卡韋微球的釋藥機理(R2=0.990 1)。說明恩替卡韋在微球中的轉(zhuǎn)運速率是有限的且呈濃度依賴性[14-15]。

表5 恩替卡韋微球的釋放動力學參數(shù)

3 結(jié) 論

本研究成功制備了恩替卡韋微球,并對其制備工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。最終得到的最優(yōu)處方為:PLGA質(zhì)量濃度為0.13 g·mL-1,PVA體積分數(shù)為1.2%,水油比為91∶1。對該實驗條件進行驗證,制備的3批微球載藥量為(19.23±0.32)%,包封率為(76.91±1.28)%,平均粒徑為84.5 μm。在最佳條件下制備的微球的實驗值與預測值基本接近,說明響應面法可用于優(yōu)化恩替卡韋微球的制備條件。掃描電子顯微鏡顯示微球呈球形,結(jié)構(gòu)致密,表面光滑。恩替卡韋微球釋放一直持續(xù)到第59天,表明該微球具有很好的緩釋效果。