張曉燕 薛晨晨 黃璐 袁星星 陳新

摘要：為明確不同種皮顏色小豆及其芽苗菜功能性成分的差異，分別對6種不同種皮顏色小豆及其芽苗菜的酚類化合物、黃酮類化合物、異黃酮、皂苷和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，γ-GABA）等功能性成分含量進行比較，并分析體外抗氧化能力。結果表明，小豆種子富含酚類化合物、黃酮類化合物、異黃酮、皂苷和γ-GABA等功能性成分，且具有較高的抗氧化能力。黑色種皮的蘇黑珠1號小豆種子總酚類化合物、總黃酮類化合物、皂苷和γ-GABA含量最高，抗氧化能力最強，且蘇黑珠1號小豆芽苗菜產(chǎn)量最高。與種子相比，蘇品紅1號和蘇黃1號小豆芽苗菜總酚類和總黃酮類化合物含量顯著提高，蘇灰1號和蘇黑珠1號小豆芽苗菜異黃酮含量顯著提高?？傮w而言，供試小豆品種中蘇黑珠1號小豆不僅富含功能性成分，而且抗氧化能力也較強，具有良好的開發(fā)前景。

關鍵詞：小豆;芽苗菜;酚類化合物;抗氧化;黃酮類化合物;異黃酮;γ-GABA

中圖分類號： S521.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0180-06

收稿日期：2020-08-06

基金項目：國家自然科學基金（編號：31902001）;國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術體系生物防治與綜合防控崗位科學家（編號：CARS-08-G15）;江蘇省特糧特經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術體系集成創(chuàng)新中心（編號：JATS[2019]399）。

作者簡介：張曉燕（1988—），女，山東煙臺人，博士，助理研究員，主要從事豆類功能育種與應用研究。E-mail：xyzhang@jaas.ac.cn。

通信作者：陳 新，博士，研究員，主要從事豆類作物遺傳育種研究。E-mail：cx@ jaas.ac.cn。

小豆[Vigna angularis （Willd） Ohwi & Ohashi]是我國主要食用豆之一，在菜用、藥用和產(chǎn)品加工等方面具有較好的經(jīng)濟價值[1]。小豆不僅含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等基本營養(yǎng)物質(zhì)，還富含多酚、黃酮類化合物和皂苷等功能性成分[2-3]。小豆中的功能性成分具有降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)血糖、抗菌、抗氧化等保健功效，并有助于控制或預防慢性和退行性疾病[4]。

發(fā)芽是一種簡單、有效且低成本的改善豆類營養(yǎng)品質(zhì)的技術。大量研究表明，發(fā)芽是一個動態(tài)過程，它不僅降低了抗營養(yǎng)因子等不利成分，提高了蛋白質(zhì)的吸收利用率，還會引起功能性成分含量發(fā)生顯著變化[3]。小豆芽苗菜口感鮮嫩且營養(yǎng)豐富，具有生長周期短、栽培方式靈活等特點，市場前景廣闊。前期研究表明，豆類芽苗菜的營養(yǎng)品質(zhì)主要取決于種子的品質(zhì)和特性[5-6]。目前，關于小豆芽苗菜營養(yǎng)成分的研究多集中于比較同一品種在不同處理下的營養(yǎng)成分變化[7]，因此有必要利用種質(zhì)資源優(yōu)勢系統(tǒng)研究不同品種小豆及其芽苗菜功能性成分及抗氧化特性。

本研究以江蘇省特有的6個不同種皮顏色小豆品種為試驗材料，系統(tǒng)研究其種子及芽苗菜的功能性成分含量及抗氧化特性，分析比較不同品種小豆芽苗菜的生長特性，以期為小豆生產(chǎn)和豆類芽苗菜的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗于2019年11月至2020年3月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所進行。試驗材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)作所豆類作物研究室自主育成的6個不同種皮顏色小豆品種，各試驗材料及其性狀詳見表1。挑選大小均勻、整齊一致且無破損的小豆種子，用0.1%次氯酸鈉溶液消毒后，播種于豆芽機。將豆芽機置于人工氣候培養(yǎng)箱中，黑暗中進行催芽，培養(yǎng)溫度和相對濕度分別為25 ℃和80%。在黑暗中培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移至LED白光下培養(yǎng)，相對濕度為80%，溫度為25 ℃/18 ℃（白天/黑夜），光照時間12 h/12 h（白天/黑夜），光照度 30 μmol/（m2·s）。豆芽機每2 h淋水1次，每天更換1次自來水。小豆芽苗菜生長至10 d時進行取樣。用吸水紙吸干芽苗菜表面水分后快速冷凍到液氮中，并保存至-80 ℃冰箱待用。樣品經(jīng)過冷凍干燥處理后用于測定功能性成分含量和抗氧化能力。

1.2 生長指標測定

小豆芽苗菜生長至10 d時取樣測定生長指標，包括株高、可食用鮮質(zhì)量、全株鮮質(zhì)量和產(chǎn)量。

產(chǎn)量：以每100 g種子生產(chǎn)出的可供食用的芽苗菜計算，單位g/100 g。

可食率=（可食用鮮質(zhì)量/全株鮮質(zhì)量）×100%。

1.3 總酚類和總黃酮類化合物含量測定

總酚類和總黃酮類化合物含量的提取和測定參照 Bobo-García 等的方法[8]，略有改動。稱取0.5 g凍干后研磨至粉末狀的樣品，加入5 mL提取液，充分混勻，于30 ℃超聲提取10 min，4 ℃下 12 000 r/min 離心20 min，收集上清作為待測提取液?？偡宇愇镔|(zhì)含量用福林-肖卡法測定，取上述20 μL提取液于96孔酶標板，加入100 μL福林酚試劑，充分混勻后加入75 μL 10%碳酸鈉溶液，充分混勻，室溫下黑暗中反應2 h，測定750 nm處的吸光度。以沒食子酸（gallic acid）標準溶液繪制標準曲線，總酚類化合物含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

總黃酮類化合物含量的測定參考Horszwald等的方法[9]。取25 μL提取液于96孔酶標板，加入75 μL 95%乙醇溶液，充分混勻后依次加入5 μL 10%氯化鋁溶液、5 μL 1mol/L乙酸鉀溶液和 140 μL 去離子水，充分混勻后室溫反應30 min，測定510 nm處的吸光度。以蕓香苷（rutin）為標準品繪制標準曲線，總黃酮類化合物含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/100 g。

1.4 總異黃酮含量的測定

總異黃酮含量的測定參照Ma等的方法[10]，略作改動。取0.2 g樣品，加入5 mL 80%甲醇（色譜純），60 ℃超聲提取20 min，重復提取1次，離心（12 000 r/min，20 min）后合并上清，將上清過 0.45 μm 濾膜后轉(zhuǎn)入高效液相色譜（HPLC）專用色譜瓶中，4 ℃保存待測。液相色譜柱為Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，0.5 μm），流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，B：13%～18%;10～23 min，B：18%～24%;23～30 min，B：24%～35%;30～50 min，B：35%;50～51 min，B：35%～13%。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長 260 nm，進樣量10 μL。大豆異黃酮標準品染料木素（Genistein）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、大豆苷（daidzin）和黃豆黃苷（Glycitin）均購自Sigma公司。

1.5 皂苷含量的測定

皂苷含量的測定參考Chen等的方法[11]，略作改動。取0.5 g樣品，加入10 mL 80%甲醇，60 ℃恒溫水浴振蕩提取3 h，4 ℃下12 000 r/min離心 20 min，收集上清作為待測液。取0.1 mL待測液，依次加入0.4 mL 80%甲醇、0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液和5 mL 72%硫酸溶液，冰浴混合，60 ℃水浴10 min，冷卻后測定544 nm處的吸光度。以大豆皂苷標準品繪制標準曲線。樣品中大豆皂苷含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.6 γ-氨基丁酸（γ-GABA）含量的測定

γ-GABA含量的測定參考Sharma等的方法[12]，并略作改動。取0.1 g樣品，加入1 mL 70%乙醇，60 ℃超聲提取20 min，4 ℃下12 000 r/min離心20 min，重復提取1次，收集上清并濃縮，濃縮后的提取液作為待測液。測定時取0.1 mL待測液，加入0.2 mL 0.2 mol/L硼酸緩沖液（pH值9.0）、1 mL 6%酚試劑和0.4 mL 7.5%次氯酸鈉溶液。將上述混合反應液沸水浴10 min，冰浴冷卻后測定630 nm處的吸光度。以γ-GABA為標準品繪制標準曲線，樣品中γ-GABA含量以干質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.7 抗氧化能力的測定

待測液的提取方法參考“1.3”節(jié)總酚類物質(zhì)含量測定。二苯代苦味?；杂苫―PPH）清除能力、鐵離子還原抗氧化能力（FRAP）和氧自由基吸收能力（ORAC）的測定參考Horszwald等的方法[9]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

本試驗所有樣品均隨機取樣，試驗數(shù)據(jù)用3次生物學重復的平均值±標準誤表示。采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，顯著性采用Duncans新復極差法檢驗（P<0.05）。相關性分析用Origin 2018軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同品種小豆及其芽苗菜的功能性成分分析

由圖1可知，蘇黑珠1號小豆種子的總酚類化合物含量最高（17.43 mg/100 g），顯著高于除蘇白1號外的其他小豆種子，而蘇品紅1號小豆種子的總酚類化合物含量最低，僅為蘇黑珠1號的40.59%。蘇黑珠1號小豆種子的總黃酮類化合物含量顯著高于其他品種，而異黃酮含量顯著低于除蘇灰1號外的其他品種。蘇品紅1號小豆芽苗菜的總酚類化合物含量最低，蘇灰1號小豆芽苗菜總酚類化合物含量最高，為蘇品紅1號的1.41倍。蘇品紅1號、蘇黃1號和蘇白1號小豆芽苗菜的總黃酮類化合物含量顯著高于相應的小豆種子，分別是其種子的1.39、1.34、1.10倍。類似的，蘇灰1號和蘇黑珠1號小豆芽苗菜的異黃酮含量顯著高于種子，分別是其種子的1.24、1.38倍。

由圖2可知，小豆種子的皂苷含量較高，其中蘇黑珠1號小豆種子的皂苷含量顯著高于其他品種小豆種子，蘇品紅1號、蘇黃1號和蘇白1號小豆芽苗菜的皂苷含量均顯著高于蘇黑珠1號小豆芽苗菜。蘇灰1號和蘇黑珠1號小豆種子的γ-GABA含量顯著高于其他品種小豆種子，蘇翡翠1號小豆芽苗菜的γ-GABA含量顯著高于其他品種小豆芽苗菜。

2.2 小豆芽苗菜的生長特性

由圖3和表2可知，蘇品紅1號、蘇黃1號和蘇白1號小豆芽苗菜的株高較低，顯著低于蘇灰1號和蘇黑珠1號小豆芽苗菜;蘇黑珠1號小豆芽苗菜的產(chǎn)量最高（500.66 g/100 g），顯著高于除蘇黃1號和蘇灰1號之外的其他小豆芽苗菜，而蘇品紅1號小豆芽苗菜的產(chǎn)量最低（235.68 g/100 g）。各品種小豆芽苗菜的可食用鮮質(zhì)量、全株鮮質(zhì)量和可食率無顯著性差異。

2.3 不同品種小豆及其芽苗菜抗氧化能力分析

利用DPPH·清除能力、FRAP、ORAC 3種評價方法對小豆種子和芽苗菜的抗氧化能力進行測定（圖4）?？梢钥闯?，蘇灰1號和蘇黑珠1號小豆種子的DPPH·清除能力顯著高于其他小豆種子，蘇黑珠1號小豆種子的FRAP和ORAC值均顯著高于其他小豆種子，此外蘇白1號小豆種子的FRAP值顯著高于除蘇黑珠1號之外的其他小豆種子。不同品種小豆芽苗菜之間相比，蘇白1號小豆芽苗菜的DPPH·清除能力和FRAP值均顯著高于其他品種小豆芽苗菜，而蘇品紅1號小豆芽苗菜的DPPH·值均顯著低于其他品種小豆芽苗菜。與小豆種子相比，蘇品紅1號小豆芽苗菜的DPPH·、FRAP和ORAC值分別是其種子的1.08、1.34、1.27倍。

2.4 功能性成分與抗氧化能力相關性分析

對小豆種子及其芽苗菜的功能性成分含量和抗氧化能力進行相關性分析（表3）表明，小豆種子總酚類化合物含量與DPPH·清除能力顯著正相關，與FRAP和ORAC極顯著正相關。總黃酮類化合物含量與DPPH·清除能力、FRAP和ORAC顯著或極顯著正相關，γ-GABA含量與DPPH·清除能力顯著正相關，而異黃酮含量與DPPH·清除能力顯著負相關。小豆芽苗菜的總酚類化合物含量與DPPH·清除能力顯著正相關，而總黃酮類化合物含量與DPPH·清除能力、FRAP和ORAC均呈負相關關系。

3 結論與討論

豆類芽苗菜是一類利用豆類種子貯存的營養(yǎng)物質(zhì)，使種子在適宜條件下萌發(fā)而產(chǎn)生的可食用幼苗。與大宗蔬菜相比，豆類芽苗菜具有風味獨特、口感脆嫩、生育周期短和生產(chǎn)不受季節(jié)限制等特點，是一種經(jīng)濟價值較高的蔬菜[13]。豆類芽苗菜主要包括黃豆（大豆）芽、綠豆芽、黑豆苗、豌豆苗、小豆苗和蠶豆苗等。目前，黃豆芽和綠豆芽消費需求量大，同時由于其整個生育期間均在無光或者弱光條件下完成，前、中、后期培育條件較一致，所以工廠化、機械化、產(chǎn)業(yè)化進程較快;而小豆芽苗菜等是伴隨現(xiàn)代設施農(nóng)業(yè)、立體栽培農(nóng)業(yè)和現(xiàn)代科學研究發(fā)展起來的新型特色蔬菜，系統(tǒng)研究不同品種小豆及其芽苗菜的芽用特性及相關栽培技術對于豆類芽苗菜的開發(fā)具有重要意義。

小豆中的總黃酮類化合物（如槲皮素和兒茶素等）具有較強的抗氧化能力[14]。本研究結果也表明，小豆種子富含酚類化合物和黃酮類化合物，且具有較高的抗氧化特性（圖1、圖4）。本研究采用3種體外評價方法研究小豆種子及芽苗菜的抗氧化能力，小豆種子和芽苗菜的總酚類物質(zhì)含量均與DPPH呈顯著正相關關系，這表明酚類化合物的總量在抗氧化能力中起重要作用。蘇黑珠1號小豆種子的總酚類和總黃酮類化合物含量最高，抗氧化能力最強，因此蘇黑珠1號小豆種子最適宜開發(fā)抗氧化保健產(chǎn)品。蘇品紅1號和蘇黃1號小豆芽苗菜的總酚類和總黃酮類化合物含量是其相應種子的 1.10～1.39倍，因此蘇品紅1號和蘇黃1號小豆可用于生產(chǎn)富含酚類和黃酮類化合物的小豆芽苗菜。

前期研究報道，深色種皮的豆類種子由于富含花青素等酚類物質(zhì)而具有較強的抗氧化性，因此更有利于緩解由氧化應激反應引起的疾病[15]。本研究也表明，與淺色種皮的種子相比，深色種皮的小豆種子（如蘇灰1號和蘇黑珠1號小豆）具有更高含量的酚類化合物和更強的抗氧化能力。此外，小豆種子總酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力具有較好的相關性，這與Lin等的研究結果[15]一致。然而，小豆發(fā)芽后子葉不出土，因此造成種皮中色素的損失，最終引起小豆芽苗菜中酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力下降。與此相反，部分淺色種皮的小豆芽苗菜總酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力顯著高于其種子，這可能是由于淺色種皮的小豆芽苗菜對培養(yǎng)過程中的光環(huán)境更敏感，從而在光源下產(chǎn)生了更多的酚類代謝產(chǎn)物。

皂苷是豆類中的一種天然活性物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)，小豆種子是良好的皂苷來源。然而發(fā)芽會造成皂苷含量的損失，這與Guajardo-Flores等對大豆的研究結果[16]不一致。造成這種差異的原因可能是：一方面，皂苷主要存在于種臍中，小豆芽苗菜為子葉留土型芽苗菜，因此造成了芽苗中皂苷的大量損失[17];另一方面，浸種時種子中的皂苷可能被浸出，從而降低整體的皂苷水平[16]。γ-GABA是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有調(diào)節(jié)心率、降血壓和緩解壓力等生理功能。前期研究表明，發(fā)芽可顯著提高豆類的γ-GABA含量[18]，而發(fā)芽過程中的低氧和鹽脅迫等處理可進一步提高大豆和蠶豆芽苗菜的γ-GABA含量[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，小豆種子的γ-GABA含量高于小豆芽苗菜，因此小豆種子可以作為γ-GABA的良好膳食來源。

綜上所述，蘇品紅1號和蘇黃1號小豆可用于生產(chǎn)富含酚類和黃酮類化合物的小豆芽苗菜。蘇黑珠1號小豆種子的功能性成分含量豐富、抗氧化能力最強，且蘇黑珠1號小豆芽苗菜的產(chǎn)量最高，因此蘇黑珠1號小豆既可以直接作為功能性食品的原料，也適合做小豆芽苗菜生產(chǎn)的原料，開發(fā)潛力較大。

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