施寧雪 張燁 倪歡 韋永淑 靳晶豪 陳孝仁

摘要：研究草莓體內(nèi)能夠分離培養(yǎng)的微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)，對(duì)健康草莓穩(wěn)態(tài)菌群的構(gòu)建和保持具有重要意義。以健康草莓為研究樣本，對(duì)其根、莖、葉內(nèi)的真菌和細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，分別利用真菌rDNA-ITS引物和細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后基于測(cè)序及其生物信息學(xué)分析鑒定微生物種類。結(jié)果表明，從健康草莓根、莖、葉部獲得了真菌1個(gè)門4個(gè)屬中的14株菌株和細(xì)菌3個(gè)門6個(gè)屬中的14株菌株，其中細(xì)菌內(nèi)生菌的多樣性高于真菌類群;3個(gè)器官中根部內(nèi)生菌的多樣性程度最高;芽孢桿菌（Bacillus）和葡萄孢屬（Botrytis）是豐度較高的2個(gè)內(nèi)生菌屬。本研究初步明確了草莓不同部位可培養(yǎng)內(nèi)生菌的分布特點(diǎn)和規(guī)律，為探索利用這些內(nèi)生菌以促進(jìn)草莓健康生長奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：草莓;內(nèi)生菌;根;莖;葉;多樣性;促生作用

中圖分類號(hào)：S668.401;S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）07-0130-05

收稿日期：2020-07-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31671971、31871907）;2016年度江蘇高校青藍(lán)工程項(xiàng)目;2018年度揚(yáng)州大學(xué)“高端人才支持計(jì)劃”（拔尖人才成長計(jì)劃）。

作者簡介：施寧雪（1996—），女，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害研究，E-mail：whoilove1996@163.com;

共同第一作者：張 燁（1995—），男，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害研究，E-mail：424396702@qq.com。

通信作者：陳孝仁，博士，教授，主要從事植物真菌病害研究。E-mail：xrchen@yzu.edu.cn。

內(nèi)生微生物（endophytic microorganisms）是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是一大類能夠在健康植物活組織內(nèi)生存而不引起明顯寄主植物病變的微生物，主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌和病毒[1-4]。內(nèi)生微生物一生或在生活史的某個(gè)階段生活于植物活組織內(nèi)，在長期的進(jìn)化過程中與寄主植物建立了和諧聯(lián)合的關(guān)系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中巨大而寶貴的資源庫[5-6]。自20世紀(jì)90年代以來，植物內(nèi)生微生物逐漸成為微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，對(duì)它的認(rèn)識(shí)逐漸深入。首先，內(nèi)生微生物種類多樣，最常見的是細(xì)菌、真菌和放線菌，亦被合稱為內(nèi)生菌（endophytes）。已經(jīng)明確地球上所有科的植物都含有內(nèi)生真菌[7]。其次，內(nèi)生微生物不僅可以提高植物抗生物逆境（抗病、抗蟲及其他食草動(dòng)物）和抗非生物逆境能力，還可以幫助植物吸收磷、氮、硫及微量元素[8-9]。此外，內(nèi)生菌能夠降解環(huán)境中的有害污染物，具有生物修復(fù)能力[6]。

深入了解植物內(nèi)生微生物，尤其是內(nèi)生菌的種類、生活史、新陳代謝及其與寄主植物的相互關(guān)系，對(duì)其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用具有重要意義。目前，尚不清楚植物內(nèi)生菌的具體種類和數(shù)量。一般而言，不同地理環(huán)境下生長的植物具有的內(nèi)生菌可能不一樣。例如，高緯度地區(qū)的植物內(nèi)生菌種類較少，且多來自子囊菌門;而熱帶地區(qū)植物的內(nèi)生菌種類則更加豐富[10]。此外，在相似環(huán)境下生長的不同植物可能擁有不同的內(nèi)生菌[11]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用高通量測(cè)序等技術(shù)分析微生物的核糖體RNA （rRNA）序列可對(duì)植物內(nèi)生菌進(jìn)行全面而快速的鑒定[12]，微生物組學(xué)（microbiome）也應(yīng)運(yùn)而生。盡管如此，這些分子生物學(xué)手段未涉及到植物內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)，因此也就無法進(jìn)行下一步的內(nèi)生菌開發(fā)利用工作。

草莓是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）的多年生草本植物，其果實(shí)酸甜可口、營養(yǎng)豐富，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果。目前，針對(duì)草莓的微生物組研究主要是圍繞草莓根際土壤、果實(shí)表面或者葉片表面的微生物類群，針對(duì)其內(nèi)生菌的研究報(bào)道很少，不利于草莓內(nèi)生菌的開發(fā)利用[13-20]。開發(fā)利用植物內(nèi)生菌，首要條件就是可以人工分離、培養(yǎng)這些微生物，以進(jìn)一步分析其生活史、生理生化性狀以及與植物的關(guān)系。有鑒于此，本試驗(yàn)從健康草莓的根、莖、葉不同部位分離內(nèi)生真菌和細(xì)菌，并利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行快速鑒定，分析草莓不同部位內(nèi)生菌的分布特點(diǎn)和規(guī)律，以期為探索利用這些內(nèi)生菌以促進(jìn)草莓健康生長奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年5月在江蘇省揚(yáng)州市施橋鎮(zhèn)揚(yáng)子村任橋露地草莓園（119°43′7.00′′E，32°31′7.00′′N）采集草莓品種章姬（Akihime）為試材。在無病田選取3處進(jìn)行“S”形取樣，共采集15株草莓，整株挖出，用無菌袋低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室。利用自來水沖洗掉植株根部和表面的土壤和殘屑，再用無菌水徹底沖洗植株，晾干待用。

1.2 內(nèi)生菌的分離

分離健康草莓根、莖、葉部的內(nèi)生真菌和細(xì)菌。葉片取樣分3個(gè)部位（從葉片邊緣切取的約5 mm×5 mm的組織、主葉脈中間段2側(cè)切取的約5 mm×5 mm 的組織、5～8 mm的葉柄中段）。根狀莖取樣分2個(gè)部位：韌皮部和木質(zhì)部各取5 mm×5 mm的組織。根取樣分3個(gè)部位進(jìn)行：表皮、皮層和維管束各取5 mm×5 mm的組織。

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 植物組織置于0.5%次氯酸鈣溶液中消毒0.5～1 min，然后在無菌水中漂洗3次，晾干后置放在含0.5 μL/mL 96%乳酸的PDA平板（馬鈴薯200 g，葡萄糖16.0～20.0 g，瓊脂16.0～20.0 g，蒸餾水1 000 mL）上。平板靜置于霉菌培養(yǎng)箱（22±2） ℃內(nèi)培養(yǎng)3 d，長出的菌絲尖端轉(zhuǎn)入新的PDA平板。利用分生孢子進(jìn)行菌株純化，獲得的單孢株保存于4 ℃。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離 將植物組織用0.5%次氯酸鈣消毒0.5～1 min，然后用無菌水沖洗3次，將組織塊加入無菌水中搗碎制成懸浮液，然后吸取100 μL懸浮液用劃線法涂布于NA固體培養(yǎng)基（牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0，瓊脂16.0 g）上，晾干后將培養(yǎng)皿置于30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，挑取單菌落進(jìn)行劃線純化。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取 在PDA平板表面鋪上滅菌的玻璃紙，將真菌菌株接種到玻璃紙上，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，再利用金屬鏟收集玻璃紙上的菌絲。利用杭州愛思進(jìn)公司基因組DNA試劑盒（AP-MN-MS-GDNA-250）提取菌絲的基因組DNA。

挑取細(xì)菌單菌落加入到含有5 mL KB培養(yǎng)液的試管中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。取1.5 mL菌液離心收集菌體，利用CTAB/NaCl法[21]提取細(xì)菌基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為16S 33F：5′-ATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S 1387R：5′-TATTGGTGTGACGGGGGGTGT-3′。利用真菌rDNA-ITS （internal transcribed spacer，核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′。

PCR擴(kuò)增體系：2 μL 1×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol/L Mg2+、100～300 ng DNA、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，無菌水補(bǔ)齊到 20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 1 min，31個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，通過膠回收、TA載體克隆，送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BlastN比對(duì)，并登錄GenBank。將獲得的所有序列進(jìn)行多重比對(duì)，再用MEGA7的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自舉法（bootstrap）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，共1 000次循環(huán)，以保證系統(tǒng)樹的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

本研究從健康草莓根、莖、葉這3個(gè)器官的8個(gè)部位采樣，分成兩等份分別進(jìn)行細(xì)菌和真菌的分離，最后共獲得14株真菌菌株和14株細(xì)菌菌株（表1）。其中，來自葉片的真菌菌株有8株，細(xì)菌菌株有5株;來自莖的真菌菌株有1株，細(xì)菌菌株有4株;來自根部的真菌和細(xì)菌菌株各有5株。菌株數(shù)目的不同可能與不同器官分離的部位數(shù)量有一定關(guān)系。

2.2 屬水平上內(nèi)生菌的多樣性

對(duì)細(xì)菌菌株的16S rDNA、真菌菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆與測(cè)序，獲得了長度分別為1 455～1 519、563～615 bp的片段序列， 提交GenBank進(jìn)行登記（表1）?；谶@些序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比較，將菌株鑒定到屬或者種水平。由表1可知，分離獲得的真菌菌株來自真菌界的4個(gè)屬：葡萄孢屬（Botrytis）、枝穗霉屬（Clonostachys）、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）和小不整球殼屬（Plectosphaerella）。分離獲得的細(xì)菌菌株來自原核生物界的6個(gè)屬：芽孢桿菌屬（Bacillus）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、微桿菌屬（Microbacterium）。細(xì)菌的多樣性高于真菌。

進(jìn)一步對(duì)分離的菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)草莓不同部位中可培養(yǎng)內(nèi)生菌在屬水平上呈現(xiàn)出多樣性的特點(diǎn)。按照內(nèi)生菌多樣性的豐富度從高到低排列，根部>葉部>莖部。其中，根部分離出3個(gè)屬的真菌和4個(gè)屬的細(xì)菌，多樣性程度最高（圖1）。

在分離的真菌類群中，獲得葡萄孢屬菌株的比例最高，達(dá)到43% （6/14）;其次是枝穗霉屬，分離比為36%。在細(xì)菌類群中，芽孢桿菌屬出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)到43%;其次是新鞘氨醇桿菌屬，分離比為21%。真菌中1個(gè)屬、細(xì)菌中3個(gè)屬各分離獲得1株菌株，代表性最低（圖2）。

2.3 屬以上階元內(nèi)生菌的多樣性

對(duì)獲得的內(nèi)生菌進(jìn)行進(jìn)一步的分類階元梳理，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，真菌內(nèi)生菌均來自真菌界子囊菌門（Ascomycota），而細(xì)菌來自原核生物界的3個(gè)門：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）;在綱（Class）水平上，真菌來自2個(gè)綱：錘舌菌綱（Leotiomycetes）和糞殼菌綱（Sordariomycetes），細(xì)菌則來自4個(gè)綱：芽孢桿菌綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和放線菌綱

（Actinobacteria）?？梢姡诟呒?jí)分類階元上細(xì)菌內(nèi)生菌的多樣性也高于真菌類群。

3 討論

植物內(nèi)生微生物定殖于健康植物體內(nèi)，與寄主植物在長期進(jìn)化過程中形成了和諧共生的關(guān)系，對(duì)寄主植物具有防病、促生、固氮和生物修復(fù)等生物學(xué)作用，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[4，11]。目前，內(nèi)生細(xì)菌和真菌不僅應(yīng)用于植物病蟲害的生物防治，還用來促進(jìn)植物生長[8-9，22]。深入了解植物內(nèi)生菌資源，是其開發(fā)利用中的重要一步。草莓作為一種重要的作物，2018年在世界范圍內(nèi)的種植面積約為 37萬hm2，產(chǎn)量約為834萬t（世界糧農(nóng)組織，http：//www.fao.org/faostat/）。目前并不清楚草莓內(nèi)生微生物，尤其是細(xì)菌和真菌的種類以及分布情況。已有的關(guān)于草莓微生物組的研究主要是調(diào)研草莓根際土壤、果實(shí)或者葉片表面的微生物類群，針對(duì)其內(nèi)生菌的研究報(bào)道很少，影響了草莓內(nèi)生菌的開發(fā)利用[13-20]。針對(duì)該問題，本研究同時(shí)對(duì)草莓根、莖、葉3個(gè)部位的內(nèi)生菌進(jìn)行分離純化，獲得了真菌界子囊菌門4個(gè)屬中的14株菌株、原核生物界3個(gè)門6個(gè)屬中的14株菌株。這是首次分析草莓不同器官內(nèi)生菌（真菌和細(xì)菌）的分布特點(diǎn)，為下一步分析內(nèi)生菌的侵染定殖規(guī)律、生物學(xué)性狀及其開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

目前，分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于植物內(nèi)生菌種類的分析研究。直接以植物組織中提取的總DNA為材料，通過構(gòu)建文庫、測(cè)序等方法可獲得內(nèi)生菌的種類信息[4]。這些方法不需要對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，減少了復(fù)雜的分離過程，而且其高通量測(cè)序可快速、全面地了解植物內(nèi)生菌多樣性的真實(shí)水平。但是，盡管用分子手段得到的植物內(nèi)生菌的多樣性較為豐富，然而植物內(nèi)生菌的開發(fā)利用仍然離不開對(duì)內(nèi)生菌的定殖、生理生化性狀以及寄主植物和其他微生物的相互作用等方面的認(rèn)識(shí)，這必然要求首先要獲得可人工培養(yǎng)的內(nèi)生菌菌株以進(jìn)行相關(guān)研究。例如，Marian等從草莓組織中分離獲得了226個(gè)放線菌菌株，利用離體葉片分析試驗(yàn)最終篩選出一株能夠抑制草莓炭疽病的菌株MBFA-172;在隨后的溫室防控試驗(yàn)中，該菌株顯示出類似于殺菌劑甲基代森鋅的防控效果，表明該菌株具有作為草莓炭疽病生防制劑的應(yīng)用潛力[20]。當(dāng)然，分離培養(yǎng)的方法也存在一定的局限性。首先，由于難以模擬一些內(nèi)生菌的生長條件而不能獲得其純培養(yǎng)，導(dǎo)致內(nèi)生菌多樣性被低估;其次，分離內(nèi)生菌時(shí)對(duì)植物組織表面的消毒以及消毒時(shí)長可能會(huì)影響內(nèi)生菌調(diào)查的準(zhǔn)確性;再次，分離時(shí)所選用的培養(yǎng)基以及所用抗生素、乳酸等對(duì)內(nèi)生菌的數(shù)量和種類也存在一定的影響[8]。這些問題需要在后續(xù)的研究中加以思考。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，有助于解決這些問題。

研究發(fā)現(xiàn)，不同的寄主植物擁有不同的內(nèi)生菌，植物不同器官內(nèi)生菌的分布也存在較大差異。現(xiàn)有研究表明，根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他植物器官的內(nèi)生細(xì)菌，具有寄主植物多樣性和種屬多樣性特征，這是多種生物因素和非生物因素共同作用的結(jié)果[1，22]。本研究從根部分離出3個(gè)屬的真菌和4個(gè)屬的細(xì)菌，其多樣性程度高于葉和莖部;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus）是細(xì)菌類群中豐度最高的屬。這與大豆、玉米、小麥、水稻、馬鈴薯等多種作物的組織中分離的結(jié)果[23]一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，健康的草莓體內(nèi)也攜帶有多種病原真菌，如灰葡萄孢（Botrytis cinereal）、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）和小不整球殼屬（Plectosphaerella）?；移咸焰呤且环N典型的死體營養(yǎng)型病原真菌，寄主范圍很廣。研究發(fā)現(xiàn)，在多花報(bào)春（Primulax polyantha）的幼苗上接種灰葡萄孢，一般在植株開花之前不會(huì)表現(xiàn)出癥狀;附著在種子表面的灰葡萄孢孢子侵入植物體內(nèi)后可以在萵苣體內(nèi)生長，但不引起癥狀;入侵植物矢車菊（Centaurea stoebe）中也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生性生長的灰葡萄孢[24-26]?？梢?，植物病原真菌在植物體內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生性生長的現(xiàn)象是普遍存在的，也許可以將它們視為一類特殊的“內(nèi)生真菌”;但在特定條件下，尤其是植物的抗性受到削弱時(shí)，它們就會(huì)促使植物產(chǎn)生癥狀[9]。

本研究采用傳統(tǒng)的病菌分離方法從健康草莓根、莖、葉部獲得了真菌1個(gè)門4個(gè)屬中的14株菌株和細(xì)菌3個(gè)門6個(gè)屬中的14株菌株，其中細(xì)菌內(nèi)生菌的多樣性高于真菌類群;3個(gè)器官中根部內(nèi)生菌的多樣性程度最高;芽孢桿菌（Bacillus）和葡萄孢屬（Botrytis）是豐度較高的2個(gè)內(nèi)生菌屬。本研究分析了草莓體內(nèi)可培養(yǎng)真菌和細(xì)菌的分布情況、菌群結(jié)構(gòu)及生物多樣性間的差異和豐富度，為草莓內(nèi)生菌的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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