李德全 汪寶華 曹云英 鄧自發(fā)

摘要：在比較枯草芽孢桿菌NH-8及其突變體B2、H7抑菌活性的基礎上，以蘇粉8號番茄幼苗為試材，比較枯草芽孢桿菌NH-8及其高效突變體對番茄幼苗生長、抗性酶活性的影響。結果表明，NH-8菌株及其高效突變菌株對番茄生長具有明顯的促進作用，接種H7菌株的番茄幼苗其幼苗株高、主莖高度、鮮質量、干質量分別為42.50 cm、282 cm、1498 g/株、4.65 g/株，較清水對照增加73.04%、276.00%、77.28%、100.43%;2個高效突變菌株的拮抗能力較枯草芽孢桿菌NH-8有所提高，其促生作用和誘導抗性酶活性大多相應增強;接種生防菌株H7的番茄葉片過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性相對最大，分別為4.5、55.5、47.6、14.7 U。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌NH-8;突變體;番茄;抗性酶;酶活性;抗性誘導

中圖分類號： S641.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0111-04

收稿日期：2020-07-09

基金項目：江蘇省南通市應用基礎研究項目（編號：MS12015089）;南通大學重點項目（編號：03080227）。

作者簡介：李德全（1975―），男，江蘇豐縣人，博士，副教授，從事生物防治和抗性生理研究。E-mail：lidequan@ntu.edu.cn。

芽孢桿菌為芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，既能產(chǎn)生芽孢以抵抗各種化學和物理的脅迫，又能產(chǎn)生多種抗菌活性物質抑制病原物，促進植物生長，在植物病害生物防治中應用廣泛[1-5]。誘導植物產(chǎn)生抗病性保護是植物產(chǎn)生主動抗性的一種表現(xiàn)，經(jīng)典抗性誘導是在植物體上先接種病原菌或誘導物，導致在接種部位產(chǎn)生病斑，進而產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，而多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等酶的活性大小往往與植物抗性強弱有密切關系[6-9]，可用于指征植物對病原菌的抗性能力。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NH-8是從近海海藻分離篩選到的具有良好抑菌活性的產(chǎn)芽孢桿菌[10]，生長快，能產(chǎn)生抗生素，對多種植物病原生物具有較強的拮抗作用，是一種能在植物病害防治中發(fā)揮重要作用的生物防治因子[11]。本試驗利用比單一誘變更為有效的氮離子注入法[12]對海洋細菌NH-8進行誘變處理，篩選獲得2株拮抗性能比菌株NH-8更為高效的突變體;在此基礎上，以蘇粉8號番茄幼苗為試材，測定接種生防菌NH-8和2株高效突變菌株的番茄葉片多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等活性水平，并分析比較其對番茄幼苗的控病促生作用，旨在明確生防菌NH-8和2株突變菌株的誘抗能力，為評價該生防菌株的應用價值、生防作用機制及對植物病害的有效防治提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌NH-8及其高效突變菌株B2、H7、小麥紋枯病原菌，由南通大學生命科學學院實驗室保存提供，供試番茄品種為蘇粉8號。

1.2 試驗時間、地點

田間盆栽試驗于2019年2—5月選擇在南通大學植物試驗園進行，室內試驗在南通大學生物技術重點實驗室進行。

1.3 菌株NH-8及其高效突變株的抑菌活性比較

以小麥紋枯菌為指示菌，采用平板對峙法驗證抑菌活性，其具體操作過程：將菌株NH-8及其2株突變菌株分別移植到牛肉膏、蛋白胨液體培養(yǎng)基中，26℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，備用;將紋枯病病原菌移植到直徑為90 mm的PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)48 h;打孔器打孔，將菌塊移植到直徑為90 mm的空白PDA平板中央培養(yǎng)8 h，對角接種NH-8及其2株高效突變體，26 ℃培養(yǎng)48 h;測量接種菌株的菌圈直徑，計算抑制率，重復6次。抑制率計算公式：

抑制率=菌圈直徑/45×100%。

式中：45為平板半徑值，mm。

1.4 菌株NH-8及其高效突變菌株對番茄生長的影響

選取生長相對一致的番茄幼苗，移栽到按順序擺放、裝有滅菌土的塑料盆中，每盆移栽1株，接種菌含量為1010 CFU/mL的菌株NH-8及其高效突變菌株發(fā)酵液250 mL/株，分別以空白培養(yǎng)基、清水處理為對照，移栽后15、25 d再用相應的溶液處理1次;定植后30 d，每處理隨機選擇5點，每點選取番茄6株，取出植株，用自來水洗凈，晾干;分別采用直尺、游標卡尺測量株高、短縮莖粗度，采用電子秤稱量植株的鮮質量、干質量;稱量干質量時，將番茄植株在烘箱中55 ℃烘干。每次處理試驗植株數(shù)為30株，重復4次。

1.5 番茄葉片抗性酶活性的測定

1.5.1 接種處理 以番茄幼苗為試材，分別噴施菌含量為1010 CFU/mL的NH-8、H7、B2菌株發(fā)酵液100 mL/株，以噴等量清水為對照，共計4個處理;分別在接種后1、2、3、4、5、6 d取適量番茄葉片，測定其抗性酶活性，重復4次。

1.5.2 番茄葉片酶活性測定方法[13] （1）過氧化物酶和多酚氧化酶。取番茄葉片1.2 g，加入pH值6.8的0.05 mol/L磷酸緩沖液5 mL、石英砂少許，冰浴下研磨成勻漿;4 ℃、12 000 r/min離心 20 min，取上清液，采用紫外分光光度計測定波長。過氧化物酶：以0.18 mol/L愈瘡木酚為底物，室溫反應 6 min，以測定波長為460 nm的吸光度D420 nm 1 min 增加0.1所需酶量為1個酶活單位，U;多酚氧化酶：以150 μmol/L聯(lián)苯三酚為底物，反應10 min，加人15% H2SO4 中止，以測定波長為 420 nm 的吸光度D420 nm 1 min增加0.001所需酶量為1個酶活單位，U。（2）超氧化物歧化酶和過氧化氫酶。取番茄葉片1.2 g，加入pH值7.8的 0.05 mol/L 緩沖液 5 mL、石英砂少許，冰浴下研磨成勻漿;4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，采用紫外分光光度計測定波長。超氧化物歧化酶：測定波長為560 nm的吸光度值D560 nm，以抑制氮藍四唑光化學反應還原50%為1個酶活性單位，U;過氧化氫酶：測定以0.2%過氧化氫為底物，室溫反應3 min，以測定波長為240 nm的吸光度D240 nm 1 min減少0.01所需酶量為1個酶活單位，U。

2 結果與分析

2.1 菌株NH-8及其高效突變體的抑菌效果

由表1、圖1可見，菌株NH-8的2個高效突變體H7、B2的抑菌率分別為80.4%、72.0%，其拮抗能力明顯好于出發(fā)菌株NH-8，分別較菌株NH-8增加23.6、32.0百分點;H7菌株對紋枯病病原菌的拮抗能力最強，其菌落直徑相對最大，為36.2 cm。

2.2 菌株NH-8及其高效突變體對番茄幼苗的促生效果

由表2可見，與對照相比，各個菌株發(fā)酵液處理對番茄生長均有顯著的促生作用（P<0.05），菌株發(fā)酵液處理20 d，番茄幼苗株高、主莖高度、鮮質量、干質量分別顯著高于清水對照，其中接種H7菌株的番茄幼苗增加相對最高，幼苗株高、主莖高度、鮮質量、干質量分別為42.50 cm、2.82 cm、14.98 g/株、4.65 g/株，分別較清水對照顯著增加73.04%、276.00%、77.28%、100.43%（P<0.05）。

2.3 菌株NH-8及其突變體處理對番茄抗性酶活性的影響

由圖2可見，噴施拮抗菌NH-8及其高效突變株B2、H7菌液，番茄葉片抗氧化酶活性均呈先上升后下降趨勢。接種H7菌液的番茄葉片其過氧化物酶活性在接種3 d、多酚氧化酶活性在接種4 d、超氧

化物歧化酶活性在接種2 d、過氧化氫酶活性在接種3 d時達到最大，4個酶活性分別為4.5、14.7、55.5、47.6 U，接種6 d時均接近于對照水平;B2、H7這2個高效突變株的防御酶活性多高于出發(fā)菌株NH-8，說明防御酶系的活性隨著拮抗菌株的拮抗能力和促生作用提高而增強。

3 結論與討論

有研究認為，誘導植物獲得系統(tǒng)抗性（SAR）在生防菌防病作用中起重要的作用[14]，而誘導抗病性保護是植物產(chǎn)生主動抗性的一種表現(xiàn)[15]。王美琴等認為，生防菌可以影響與植物抗病性相關的重要酶活性，植物早期防御反應可提高木質化程度，增強氧化酶活性等，這都與誘導抗病性有關[16-17]?？莶菅堪麠U菌對人畜無毒害，對環(huán)境無污染，具有明顯的抗菌活性和極強的抗逆能力，本試驗采用的枯草芽孢桿菌NH-8對多種植物病原生物具有較強的拮抗性能，與其高效突變菌株對番茄幼苗生長有明顯的促進作用。本試驗盆栽促生試驗結果顯示，接種H7菌株的番茄幼苗的株高、主莖高度、鮮質量、干質量分別為4250 cm、2.82 cm、14.98 g/株、4.65 g/株，較清水對照顯著增加73.04%、27600%、77.28%、100.43%（P<0.05）。

生防菌對植物病害的防病作用可能是促生、產(chǎn)生抗菌物質及誘導宿主抗性產(chǎn)生等多因素綜合作用的結果[18-19]。拮抗菌株NH-8和突變菌株可以誘導番茄幼苗葉片內過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶等與抗病性相關的防御酶活性大幅度提高，而2個高效突變株的防御酶活性比出發(fā)菌株NH-8略高。因此，有必要進一步加強對高效突變菌株的研發(fā)與應用。

參考文獻：

[1]Yourman L F，Jeffers S N. Resistance to benzimidazole and dicarboximide fungicides in greenhouse isolates of Botrytis cinerea[J]. Plant Disease，1999，83（6）：569-575.

[2]Wsahington W S，Shanmuganathan N. Fungicide control of strawberry fruit rots and the field occurrence of resistance of Botrytis cinera to iprodione，benomyl and dichlofluanid[J]. Crop Protection，1992，11（4）：355-360.

[3]Peng G，Sutton J C. Evaluation of microorganisms for biocontrol of Botrytis cinerea in strawbeerry[J]. Plant Pathology，1991，13（3）：247-257.

[4]張 鵬，洪 葵，莊 令，等. 抗真菌活性物質的分離純化及生物活性研究[J]. 福建熱作科技，2006，31（1）：5-7.

[5]Vollenbroich D，Ozel M，Vater J，et al. Mechanism of inactivation of enveloped viruses by the biosurfactant surfactin from Bacillus subtilis[J]. Biologicals，1997，25（3）：289-297.

[6]何 紅，歐雄常，王立才，等. 紅樹內生海洋細菌CⅢ-1菌株對辣椒青枯病的防病效果[J]. 植物保護學報，2008，35（6）：497-500.

[7]Mohammed S H，Saedy M A，Enan M R，et al. Biocontrol efficiency of Bacillus thuringiensis toxins against root-knot nematode，Meloidogyne incognita[J]. Journal of Cell and Molecular Biology，2008，7（1）：57-66.

[8]李德全，錢亞明，周鳴鳴，等. 海洋細菌NH-8防治草莓灰霉病機理及其抗菌物質分析[J]. 植物保護學報，2016，43（2）：215-221.

[9]李德全，談 蓉，周鳴鳴，等. 篩選和利用海洋細菌防治玉米紋枯病試驗[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（8）：118-120，121.

[10]陳志誼，劉永鋒，陸 凡. 井岡霉素和生防菌Bs-916協(xié)同抗病作用及增效機理[J]. 植物保護學報，2003，30（4）：431-434.

[11]Rosslenbroich H J，Stuebler D. Botrytis cinerea-history of chemical control and novel fungicides for its management[J]. Crop Protection，2000，19（8/10）：557-561.

[12]余增亮. 離子束生物技術引論[M]. 合肥：安徽科學技術出版社，1998：34-46.

[13]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000：25-49.

[14]van Peer R，Niemann G J，Schippers B. Induced resistance and phytoalexin accumulation in biological control of Fusarium wilt of carnation by Pseudomonas sp. strain WCS417[J]. Phytopathology，1991，81：728-734.

[15]田 黎，顧振芳，陳 杰，等. 海洋細菌B-9987菌株產(chǎn)生的抑菌物質及對幾種植物病原真菌的作用[J]. 植物病理學報，2003，33（1）：77-80.

[16]王美琴，賀運春，薛 麗，等. 番茄內生細菌的分離及拮抗菌株的篩選[J]. 植物保護學報，2007，34（5）：559-560.

[17]Jeon Y H，Chang S P，Hwang I G. Involvement of growth-promoting rhizobacterium Paenibacillus polymyxa in root rot of stored Korean ginseng[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2003，13（6）：881-891.

[18]李德全，鄧自發(fā)，曹云英，等. 芽孢桿菌NH-8對番茄根結線蟲病的生防效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（8）：108-110.

[19]Hong H，Qiu S，F(xiàn)angping H，et al. Advance in biological effects of endophytic bacteria[J]. Bacteria Journal of Microbiology，2004，24（3）：40-45.