陳洪德, 陳旭豐, 林仁穗, 鄒雙全, 阮國(guó)洪, 楊素芳

(1.福建農(nóng)林大學(xué)資產(chǎn)經(jīng)營(yíng)管理有限責(zé)任公司,福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002；5.福建醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)系,福建 福州 350108；6.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108)

由于生活節(jié)奏快、工作壓力大、作息缺規(guī)律等因素，現(xiàn)代人的免疫力普遍下降，多數(shù)成年人處于亞健康狀態(tài).鑒此絞股藍(lán)烏龍保健茶應(yīng)運(yùn)研制，適用于亞健康人群食用，對(duì)提高人體免疫功能和防治疾病具有重要意義.

絞股藍(lán)烏龍保健茶選用絞股藍(lán)、烏龍茶和黃芪為原料，經(jīng)科學(xué)配比加工而成.研究表明，絞股藍(lán)總皂甙可促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)IL-1和IL-2的活性，提高血清溶血素水平和脾臟指數(shù)等[1-4]；絞股藍(lán)多糖能增強(qiáng)自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞活性，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化[5-6]；茶多酚可增加小鼠的體重、脾重和IgG含量，誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α和IL-2[7-8]；茶多糖可調(diào)節(jié)小鼠IL-2和IL-1的分泌[9-10]；茶氨酸復(fù)合制劑可增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫[11]；黃芪多糖能增強(qiáng)氣虛小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力，恢復(fù)胸腺和脾臟的功能[12-14]；黃芪甲苷能改善免疫各項(xiàng)指標(biāo)，減輕大鼠免疫性肝損傷[15-16].可見(jiàn)，絞股藍(lán)烏龍保健茶的主原料含有明顯提高機(jī)體免疫力的多活性成分.

《脾胃論》載：“百病皆由脾胃衰而生”，脾胃氣盛，正氣不虛，不招外邪，維體強(qiáng)健，否則氣血不足而機(jī)體的免疫力低下.本研究選用的主原料不僅具有能增強(qiáng)免疫的功能因子，而且都有“健脾益氣”的功效，通過(guò)“健脾益氣法”探究絞股藍(lán)烏龍保健茶增強(qiáng)免疫的功能.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 絞股藍(lán)烏龍保健茶由福州福萬(wàn)生物技術(shù)工程有限公司生產(chǎn).

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選用上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供的清潔級(jí)ICR雌性小鼠200只[許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002]，體重18～22 g，飼養(yǎng)于福建省疾病預(yù)防控制中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[許可證號(hào)：SYXK(閩)2012-0008].

1.1.3 儀器與試劑 儀器包括2-16K臺(tái)式離心機(jī)、Co-150型C02恒溫培養(yǎng)箱、MODEL680酶標(biāo)儀、UV-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、Olympus Ⅸ71倒置顯微鏡.

試劑包括注射用墨汁、刀豆蛋白A、MTT、DNFB、丙酮、SRBC、雞紅細(xì)胞、羊紅細(xì)胞、Giemsa染液、YAC-1細(xì)胞、Hank′s液(pH 7.2～7.4)、RPMI1640完全培養(yǎng)液、乳酸鋰、典硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)、NAD、Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)、1% NP40、酸性異丙醇、臺(tái)酚蘭等.

1.2 樣品配制

在900 g絞股藍(lán)烏龍保健茶中加入10倍量的蒸餾水，于85 ℃、常壓下浸泡30 min后過(guò)濾，重復(fù)該步驟1次，合并2次濾液，于65 ℃、減壓條件下濃縮至6 L(該濃縮液含樣品0.15 g·mL-1).量取100 mL濃縮液作為高劑量組試驗(yàn)樣品；量取40 mL高劑量組試驗(yàn)樣品加蒸餾水至120 mL，作為中劑量組試驗(yàn)樣品；量取40 mL中劑量組試驗(yàn)樣品加蒸餾水至80 mL，作為低劑量組試驗(yàn)樣品.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

樣品按60 kg體重的成年人每天推薦用量(6.0 g·d-1，即0.1 mL·kg-1)的5、10和30倍，設(shè)置0.5、1.0和3.0 g·kg-1高、中、低3個(gè)劑量組和空白對(duì)照組.將200只小鼠按體重分成5個(gè)大組，即免疫Ⅰ～Ⅴ組，每組40只.免疫Ⅰ組進(jìn)行臟器指數(shù)測(cè)定、溶血空斑和血清溶血素試驗(yàn)；免疫Ⅱ組進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)水平試驗(yàn)；免疫Ⅲ組進(jìn)行NK細(xì)胞活性測(cè)定和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)；免疫Ⅳ組進(jìn)行碳廓清試驗(yàn)；免疫Ⅴ組進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn).上述試驗(yàn)均按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)[17]的方法進(jìn)行.

再按照體重將小鼠隨機(jī)分為4個(gè)小組，每組10只.小鼠以20 mL·kg-1的劑量每天灌胃1次絞股藍(lán)烏龍保健茶，連續(xù)30 d后測(cè)定血清免疫功能指標(biāo).

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

采用《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)[17]的方法測(cè)定各處理小鼠血清免疫功能指標(biāo).

1.4.1 淋巴細(xì)胞的增殖能力 用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的光密度(D).用△D表示淋巴細(xì)胞的增殖能力.△D=D(加刀豆蛋白的A孔)-D(不加刀豆蛋白的A孔).

1.4.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度 用左右耳重量之差表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度.

1.4.3 抗體細(xì)胞生成能力 用空斑數(shù)/全脾細(xì)胞表示抗體細(xì)胞生成能力.

1.4.4 血清溶血素水平 血清凝集程度一般分為0～Ⅳ級(jí).抗體積數(shù)=(S1+2S2+3S3……nSn).式中，1、2、3…n表示對(duì)倍稀釋的指數(shù)，S表示凝集程度的級(jí)別.抗體積數(shù)越大，表示血清抗體水平越高.

1.4.6 腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力 顯微鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片計(jì)數(shù)100個(gè)，計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù).吞噬百分率/%=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))×100;吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù).

1.4.7 NK細(xì)胞活性 NK細(xì)胞活性/%=[D(反應(yīng)孔)-D(自然釋放孔)]/[(D(最大釋放孔)-D(自然釋放孔)]×100.

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)10次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析.經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的數(shù)據(jù)采用LSP法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Tambane法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[18].

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠體重的影響

由表1可見(jiàn)，樣品各劑量組小鼠的體重都有不同程度的增加，但與空白對(duì)照組的增加程度比較接近，差異不顯著(P>0.05).

表1 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on weight of normal mice g

2.2 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠免疫器官的影響

表2 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠免疫器官的影響1)Table 2 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on immune organ of normal mice

由表2可見(jiàn)，樣品各劑量組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與空白對(duì)照組的差異均無(wú)顯著性(P>0.05).

2.3 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

2.3.1 對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響 由表3可見(jiàn)，樣品高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力與空白對(duì)照組的差異顯著(P<0.05).

2.3.2 對(duì)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響 由表3可見(jiàn)，樣品各劑量組小鼠左右耳重量之差與空白對(duì)照組的差異均無(wú)顯著性(P>0.05).

2.4 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

2.4.1 對(duì)小鼠抗體細(xì)胞生成能力的影響 表3顯示，各劑量組樣品均可提高小鼠的溶血空斑數(shù)，高劑量組與空白對(duì)照組的差異顯著(P<0.05)，表明絞股藍(lán)烏龍保健茶能促進(jìn)抗體細(xì)胞的生成.

表3 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫功能的影響1)Table 3 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on cellular immunity, humoral immunity of normal mice

2.4.2 對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響 表3顯示，各劑量組樣品均能提高小鼠抗體積數(shù)，抗體積數(shù)隨著樣品劑量的增加而提高，高劑量組與空白對(duì)照組的差異顯著(P<0.05)，表明絞股藍(lán)烏龍保健茶可以顯著提高小鼠血清溶血素水平.

2.5 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠單核—巨噬細(xì)胞功能的影響

2.5.1 對(duì)小鼠碳廓清能力的影響 表4顯示，樣品高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)a明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，表明絞股藍(lán)烏龍保健茶可以顯著提高小鼠碳廓清能力.

表4 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠碳廓清能力、巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞活性的影響1)Table 4 Effect of G.pentaphyllum oolong health tea on carbon clearance, macrophage phagocytosis, natural killer cell activity of normal mice

2.5.2 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 表4顯示，樣品各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)、吞噬率與空白對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05).

2.6 絞股藍(lán)烏龍保健茶對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

表4顯示，高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05).

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾為氣血生化之源，經(jīng)脾化生的“衛(wèi)氣”能保衛(wèi)肌表、抗御外邪，類似于西醫(yī)學(xué)的免疫預(yù)防功能；經(jīng)脾化生的“營(yíng)氣”能化生血液、營(yíng)養(yǎng)全身，類似于西醫(yī)學(xué)的免疫自穩(wěn)功能；“脾主諫議之官”能糾正身體受損，類似西醫(yī)學(xué)的免疫監(jiān)視功能.可見(jiàn)，中醫(yī)脾化生的“衛(wèi)氣營(yíng)血”與西醫(yī)學(xué)的“免疫”具有相關(guān)性，脾氣旺盛則免疫功能強(qiáng)大.

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)[17]有關(guān)增強(qiáng)免疫力功能的判定標(biāo)準(zhǔn)，在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核—巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性4個(gè)方面中有任何兩項(xiàng)結(jié)果呈陽(yáng)性，可判定該受試樣品可增強(qiáng)免疫力.

在本研究條件下，高劑量絞股藍(lán)烏龍保健茶明顯增強(qiáng)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力，明顯提高小鼠NK細(xì)胞活性，抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和血清溶血素測(cè)定結(jié)果均呈陽(yáng)性.表明絞股藍(lán)烏龍保健茶具有增強(qiáng)免疫力的功能.

絞股藍(lán)烏龍保健茶通過(guò)“健脾益氣法”能提高細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)胃腸、腎、肺等多臟器功能的恢復(fù)[18-21].分析本研究主原料的中藥性能，其中，絞股藍(lán)健脾補(bǔ)腎，烏龍茶溫脾健運(yùn)，黃芪補(bǔ)脾益肺，三藥配伍后協(xié)同發(fā)揮“健脾益氣”的功效.與前人所見(jiàn)略同，本研究結(jié)果顯示了絞股藍(lán)烏龍保健茶通過(guò)“健脾益氣法”的增強(qiáng)免疫作用，符合張仲景“四季脾旺不受邪”的觀點(diǎn)，體現(xiàn)了健脾強(qiáng)體是“治未病”的重要原則，也是本研究絞股藍(lán)烏龍保健茶臨證養(yǎng)生的理論依據(jù).