陸玉建, 張弘揚(yáng), 朱婷婷, 郭 好, 鄒星月, 楊 瑩

(1.濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院；2.山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心；3.山東省黃河三角洲生態(tài)脆弱帶工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603)

鎘(Cd)是一種廣泛存在于生產(chǎn)生活中的重金屬，其化合物對(duì)哺乳動(dòng)物的許多組織和器官有較強(qiáng)的毒性作用，可影響細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至癌變[1].例如，氯化鎘(CdCl2)可導(dǎo)致雞肝細(xì)胞CaM基因表達(dá)量降低，鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[2].這是由于Cd能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷[3-4].研究證實(shí)，Cd對(duì)條斑星鰈(Veraspermoseri)卵巢細(xì)胞具有顯著的毒性作用，能引起細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性降低和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增高，這種氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]；Cd暴露會(huì)導(dǎo)致大鼠成骨細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)改變，線(xiàn)粒體損傷，出現(xiàn)典型的凋亡特征[6]；Cd容易引起小鼠生殖細(xì)胞凋亡及DNA損傷[7].大量的數(shù)據(jù)表明，Cd可以與DNA形成加合物，損傷DNA分子，引發(fā)細(xì)胞中ROS含量升高，進(jìn)而啟動(dòng)與線(xiàn)粒體相關(guān)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[8]；此外，ROS能通過(guò)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號(hào)通路降低Bcl-2/Bax值，激活caspase-3和caspase-7表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9-10].犬腎上皮(Madin-Daby canine kidney, MDCK)是由Madin和Darby從犬腎臟組織分離培養(yǎng)建立的細(xì)胞系，通常該細(xì)胞呈上皮樣，以貼壁方式生長(zhǎng)，可連續(xù)傳代培養(yǎng)[11].MDCK細(xì)胞系可廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，尤其對(duì)流感病毒的感染具有效率高、增殖快、不易產(chǎn)生變異的優(yōu)點(diǎn)[12]，是目前公認(rèn)的最適合流感疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系之一[13-14].國(guó)外的研究表明，CdCl2能促進(jìn)MDCK細(xì)胞中流感病毒的增殖[15]，但目前我國(guó)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.本試驗(yàn)用不同濃度的CdCl2處理MDCK細(xì)胞，利用毒理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法研究CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用，以期為進(jìn)一步了解Cd的作用機(jī)制提供依據(jù)，也為揭示Cd污染和流感病毒流行之間的關(guān)系提供線(xiàn)索.

1 材料與方法

1.1 材料

MDCK細(xì)胞(上皮型，貼壁生長(zhǎng))，由山東綠都生物科技有限公司提供.DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基，購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，附加10%胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司).CdCl2為Sigma公司產(chǎn)品，稱(chēng)取其粉末加入適量的超純水，配制濃度為0.1 mol·L-1儲(chǔ)存液，過(guò)濾后4 ℃保存?zhèn)溆?蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司.MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司.

1.2 方法

1.2.1 MDCK細(xì)胞經(jīng)CdCl2處理后的形態(tài)學(xué)觀(guān)察 根據(jù)文獻(xiàn)[16]進(jìn)行試驗(yàn)，稍作改動(dòng).MDCK細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，依次加入終濃度為15、25、50、75、100 μmol·L-1的CdCl2，設(shè)置對(duì)照孔(無(wú)CdCl2)，分別處理24、48、72和96 h后觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化.每種處理并列設(shè)3個(gè)孔，相同的試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2 MDCK細(xì)胞存活率檢測(cè) 利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)情況，具體操作詳見(jiàn)MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū).MDCK細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為15、25、50、75、100 μmol·L-1的CdCl2，設(shè)置對(duì)照孔(無(wú)CdCl2).每種濃度并列設(shè)3個(gè)孔，將96孔板在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)中孵育24 h后取出，將MTT用稀釋液稀釋5倍，每孔加50 μL， 37 ℃孵育4 h，使MTT還原為甲臜.棄上清，每孔加150 μL二甲基亞砜，搖勻使甲臜溶解.用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo ScientificTMMultiskanTMFC)在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度.相同的試驗(yàn)重復(fù)3次.

細(xì)胞存活率/%=(加藥細(xì)胞D570 nm值/對(duì)照細(xì)胞D570 nm值)×100

1.2.3 MDCK細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取及其含量測(cè)定 參照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總蛋白質(zhì)的提取.MDCK細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1接種于24孔板，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為15、25、50、75、100 μmol·L-1的CdCl2，設(shè)置對(duì)照孔(無(wú)CdCl2)，每種濃度并列設(shè)3個(gè)孔.分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗，每孔加50～100 μL RIPA蛋白裂解液，吹打細(xì)胞.將裂解后的細(xì)胞吸入EP管內(nèi)，10 000～14 000g離心3～5 min，取上清，上清液即為全細(xì)胞蛋白質(zhì).

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取標(biāo)準(zhǔn)蛋白(1 g·L-1)50 μL、待測(cè)樣品50 μL，另取蒸餾水50 μL，分別加入G-250 3 mL混勻，靜置10 min，于波長(zhǎng)595 nm處，1 cm光徑，空白管(蒸餾水)調(diào)零，測(cè)量光密度，根據(jù)下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量[17].相同的試驗(yàn)重復(fù)3次.

蛋白質(zhì)含量=(測(cè)定管D595 nm值/標(biāo)準(zhǔn)管D595 nm值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(1 g·L-1)

1.2.4 總蛋白SDS-PAGE檢測(cè)與硝酸銀染色 根據(jù)文獻(xiàn)[18]進(jìn)行測(cè)定，稍作改動(dòng).將提取的蛋白質(zhì)和等體積的上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，離心后冷卻備用.制備聚丙烯酰胺凝膠，其中分離膠濃度為10%(質(zhì)量體積比)，濃縮膠濃度為5%(質(zhì)量體積比).上樣后進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓設(shè)定為80 V，進(jìn)入分離膠后調(diào)到120 V.電泳結(jié)束后進(jìn)行硝酸銀染色：用無(wú)離子水漂洗凝膠5 min，固定液固定30 min，敏化液處理30 min，無(wú)離子水漂洗3次，加入硝酸銀溶液染色20 min，顯色處理2～10 min，觀(guān)察到清晰的條帶后，立即用停顯液處理10 min，終止顯色.利用凝膠成像儀(SYSTEM GelDoc XR+IMAGELA Bio-Rad)觀(guān)察、拍照.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2007和SPSS 17軟件處理數(shù)據(jù).通過(guò)Duncan′s多重比較進(jìn)行多組樣本間的差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 CdCl2濃度對(duì)MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)48 h內(nèi)生長(zhǎng)正常(圖1A、2A)，貼壁狀況良好；之后，隨著培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的消耗，對(duì)照細(xì)胞開(kāi)始聚團(tuán)(圖3A)；培養(yǎng)96 h后，對(duì)照細(xì)胞大量聚團(tuán)，有少量細(xì)胞出現(xiàn)脫落(圖4A).15和25 μmol·L-1CdCl2處理24 h后MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)基本正常(圖1B-C)；48～72 h部分細(xì)胞脫落(圖2B-C、3B-C)；96 h后細(xì)胞脫落程度加重(圖4B)，且25 μmol·L-1CdCl2處理的大量細(xì)胞變圓脫落，漂浮于培養(yǎng)基中(圖4C).50 μmol·L-1CdCl2處理24 h后部分細(xì)胞開(kāi)始變圓脫落，細(xì)胞密度有所降低(圖1D)；48 h后細(xì)胞進(jìn)一步脫落(圖2D)；72～96 h大量細(xì)胞變圓脫落，貼壁細(xì)胞少，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制(圖3D、4D).75和100 μmol·L-1CdCl2處理48 h內(nèi)已有大量細(xì)胞脫落，漂浮于培養(yǎng)基中(圖1E-F、2E-F)；72 h后細(xì)胞已完全脫落，并且逐漸碎片化(圖3E-F、4E-F).

A-F：培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖1 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理24 h后的生長(zhǎng)狀態(tài)(40×)Fig.1 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 24 h(40×)

A-F：培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖2 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理48 h后的生長(zhǎng)狀態(tài)(40×)Fig.2 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 48 h(40×)

2.2 CdCl2濃度對(duì)MDCK細(xì)胞存活率的影響

MDCK細(xì)胞經(jīng)15 μmol·L-1CdCl2處理24 h后的存活率接近100%；隨著CdCl2濃度的不斷增大，細(xì)胞存活率逐漸降低，當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到75和100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率小于20%(圖5).

A-F：培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖3 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理72 h后的生長(zhǎng)狀態(tài)(40×)Fig.3 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 72 h(40×)

A-F：培養(yǎng)基中CdCl2的濃度分別為0、15、25、50、75和100 μmol·L-1(箭頭指示部分變圓脫落的細(xì)胞).圖4 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理96 h后的生長(zhǎng)狀態(tài)(40×)Fig.4 Growth states of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 96 h(40×)

柱上不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05).圖5 MDCK細(xì)胞經(jīng)不同濃度CdCl2處理24 h后的存活率Fig.5 Survival rates of MDCK cells treated with different concentrations of CdCl2 after 24 h

2.3 CdCl2濃度對(duì)MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響

利用SDS-PAGE檢測(cè)處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量.圖6顯示，與對(duì)照相比，15和25 μmol·L-1CdCl2處理24 h后細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量變化不明顯；隨著CdCl2濃度的升高，蛋白質(zhì)含量逐漸減少，當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到100 μmol·L-1時(shí)，蛋白質(zhì)含量明顯降低.培養(yǎng)48 h后，對(duì)照細(xì)胞及15和25 μmol·L-1CdCl2處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量都有所下降，50～100 μmol·L-1CdCl2處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量則顯著降低.隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和CdCl2濃度的增大，細(xì)胞蛋白質(zhì)含量下降幅度更加明顯.

圖6 不同濃度CdCl2處理后細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的變化Fig.6 Changes in cellular protein contents after treated with different concentrations of CdCl2

表1也顯示，對(duì)照細(xì)胞和CdCl2處理細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量都隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；CdCl2處理時(shí)間相同時(shí)，蛋白質(zhì)含量隨CdCl2濃度的增大而降低.15 μmol·L-1CdCl2處理24和48 h后細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)，其他濃度處理的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比差異均達(dá)顯著水平(P<0.05).這表明CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成具有抑制作用.

表1 CdCl2濃度對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的影響1)Table 1 Effects of CdCl2 concentrations on cellular protein synthesis

3 討論與結(jié)論

外源性因子對(duì)細(xì)胞的潛在毒性作用可通過(guò)觀(guān)察體外培養(yǎng)細(xì)胞受損的性質(zhì)與程度進(jìn)行判斷，如細(xì)胞形態(tài)的改變、貼壁狀況、生長(zhǎng)速度、退化程度及完整性等[19].有研究表明，CdCl2不僅對(duì)成纖維細(xì)胞具有一定的毒性作用，而且這種作用存在劑量和時(shí)間依賴(lài)性[3].本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，CdCl2處理濃度越大、時(shí)間越長(zhǎng)，MDCK細(xì)胞凋亡和脫落現(xiàn)象越嚴(yán)重，表明CdCl2對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用具有明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng).已有研究表明，隨著CdCl2濃度升高，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，SOD、GSH-Px、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases, GST)等多種抗氧化酶類(lèi)活性降低，MDA含量上升，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)，誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能被破壞，細(xì)胞色素C(cytochrome C, CytC)大量釋放，激活Caspase-9，形成凋亡復(fù)合體，進(jìn)一步激活下游的Caspases，啟動(dòng)線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡程序[4,20-21].由此可以推測(cè)，隨著CdCl2濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MDCK細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積蓄，抗氧化酶類(lèi)活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力下降，氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡.通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)和蛋白質(zhì)含量測(cè)定得出，MDCK細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的變化同樣呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性.可能的原因：隨著CdCl2濃度的增大、時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到的影響越來(lái)越明顯，蛋白質(zhì)合成受到的抑制作用越來(lái)越強(qiáng)烈；同時(shí)，細(xì)胞存活率不斷下降，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，蛋白質(zhì)含量隨之降低.有研究證實(shí)，CdCl2作用的MDCK細(xì)胞以劑量依賴(lài)方式增加流感病毒的復(fù)制，這表明Cd污染物可能加速流感病毒的傳播[15].但CdCl2促進(jìn)MDCK細(xì)胞中流感病毒復(fù)制的機(jī)制尚不明確.此外，細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜，CdCl2引起MDCK細(xì)胞凋亡的具體途徑是什么？CdCl2促進(jìn)流感病毒的增殖與MDCK細(xì)胞凋亡之間是否存在必然的聯(lián)系？要解決這些問(wèn)題，未來(lái)還要開(kāi)展大量的研究.