胡凱強(qiáng), 廖家凱, 席飛虎, 高鵬飛, 陳 凱, 魏文桃, 丁家治, 苗 苗, 顧連峰

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

林木物種世代周期長(zhǎng)，缺乏便捷有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，這對(duì)優(yōu)良種質(zhì)資源的培育極其不利.傳統(tǒng)的林木基因工程受到基因組雜合度高、倍性復(fù)雜[1]等條件的約束，無(wú)法對(duì)基因組進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，導(dǎo)致林木物種的遺傳多樣性難以得到有效利用.隨著生物大數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，繼早期的歸巢核酸內(nèi)切酶(meganucleases)、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease, ZFN)、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)以及由鈰—乙二胺四乙酸復(fù)合物執(zhí)行切割功能的化學(xué)方法[2]之后產(chǎn)生的CRISPR/Cas系統(tǒng)可在基因組中引入定點(diǎn)突變，其組裝復(fù)雜性、編輯效率等問(wèn)題得到明顯改善，為林木基因功能驗(yàn)證與解析、突變體創(chuàng)制、快速育種等提供參考.

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中的研究現(xiàn)狀

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷程

科學(xué)家最早在負(fù)責(zé)大腸桿菌(Escherichiacoli)堿性磷酸酶的同工酶轉(zhuǎn)換的iap基因區(qū)附近發(fā)現(xiàn)了一種“重復(fù)—間隔—重復(fù)”的基因序列[3].2000年Mojica et al[4]發(fā)現(xiàn)多種原核生物均具有這類(lèi)序列，其間隔序列唯一且長(zhǎng)度固定，重復(fù)序列通常為包含24～40 bp的短部分回文序列.隨后這種特異性片段被命名為成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced palindromic repeats, CRISPR)，兩側(cè)的同源基因被命名為CRISPR相關(guān)基因Cas[5].Horvath et al[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒入侵時(shí)，細(xì)菌會(huì)整合新間隔序列并對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性.研究[7]發(fā)現(xiàn)“重復(fù)—間隔—重復(fù)”中的重復(fù)序列來(lái)源于細(xì)菌和古生菌自身，間隔序列來(lái)自入侵的噬菌體病毒等.CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展歷程如圖1所示.2013年Yang et al[8]首先在人類(lèi)細(xì)胞中建立基因編輯工具，實(shí)現(xiàn)靶基因的多重編輯，CRISPR/Cas系統(tǒng)自此誕生.同年，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)等植物中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功進(jìn)行基因靶向?qū)嶒?yàn)[9-11]，這是CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物研究中的首次報(bào)道.2014年由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cas9系統(tǒng)靶向甜橙(CitrussinensisL.)CsPDS基因，葉片通過(guò)柑橘黃單胞柑橘亞種[12](Xanthomonascitrisubsp.citri, Xcc)促使農(nóng)桿菌滲透，該系統(tǒng)在林木物種中首次得到應(yīng)用[13].雖然葉片出現(xiàn)白化斑點(diǎn)，但由于它是瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化，并沒(méi)有獲得穩(wěn)定遺傳的編輯后代.隨著研究的深入，該技術(shù)逐漸在調(diào)控植物內(nèi)源基因表達(dá)[14]、性狀改良[15]以及抗病毒研究[16]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用.

圖1 CRISPR/Cas技術(shù)研究的關(guān)鍵事件Fig.1 Key events for CRISPR/Cas technology

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的缺點(diǎn)及對(duì)策

1.2.1 序列限制 Cas蛋白會(huì)識(shí)別不同的原間隔序列臨近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，但是PAM序列在基因組上的分布頻率有限，在一些目的基因上無(wú)法尋找到合適的位點(diǎn)，這嚴(yán)重制約了全基因組范圍內(nèi)的編輯.開(kāi)發(fā)識(shí)別不同PAM序列的新Cas蛋白則可以有效降低PAM序列的依賴(lài)性.通過(guò)特異性識(shí)別NAG、NAGG和NAAG等PAM系統(tǒng)有效擴(kuò)展了CRISPR/Cas靶向基因組的范圍[17].2019年CRISPR/Cpf1(CRISPR/Cas12a)系統(tǒng)首次在木本植物葡萄柚(C.paradisi)中成功編輯CsLOB1等位基因，解決了Cas9系統(tǒng)因受到單核苷酸序列多態(tài)性限制，其單個(gè)sgRNA難以修飾兩個(gè)等位基因的難題[18].

1.2.2 脫靶、編輯效率低 脫靶是指Cas蛋白對(duì)目標(biāo)靶基因以外的其他序列進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生不必要的突變.Yang et al發(fā)現(xiàn)SpCas9-NG系統(tǒng)不僅會(huì)靶向水稻基因組，而且會(huì)靶向sgRNA本身，這極大地增加了脫靶風(fēng)險(xiǎn)[19].科研人員針對(duì)這一問(wèn)題已搭建多種生物信息學(xué)平臺(tái)，以設(shè)計(jì)高特異性gRNA元件.Xie et al開(kāi)發(fā)的CRISPR-PLANT可為8種植物基因組預(yù)測(cè)低脫靶位點(diǎn)的sgRNA[20].基因編輯工具包CRISPR-GE不僅能用于設(shè)計(jì)目標(biāo)sgRNA，還可以用于預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)以及后續(xù)的突變分析[21].通過(guò)開(kāi)發(fā)突變體Cas9-HF1產(chǎn)生較弱的Cas9-DNA關(guān)聯(lián)度來(lái)確保核酸酶僅在完全匹配的DNA位點(diǎn)進(jìn)行切割[22].

該技術(shù)還存在編輯效率低等問(wèn)題，這與Cas9的密碼子優(yōu)化以及靶點(diǎn)處的GC含量有很大關(guān)系[23,24].同種或相近物種密碼子優(yōu)化和70%左右GC含量的靶位點(diǎn)有助于提高打靶效率.除此之外，溫度、光照等環(huán)境因素也會(huì)影響編輯效率，因此該技術(shù)目前基本上局限在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)而無(wú)法得到大規(guī)模田間應(yīng)用.科學(xué)家們?nèi)缃褚呀?jīng)通過(guò)開(kāi)發(fā)溫度敏感型CRISPR/Cas12a系統(tǒng)[25]等來(lái)提高植物基因編輯效率.

1.3 CRISPR/Cas技術(shù)在植物研究中的新方向

1.3.1 單堿基編輯技術(shù) 單堿基編輯技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單一堿基的編輯，與傳統(tǒng)的CRISPR/Cas技術(shù)相比具有精準(zhǔn)且不會(huì)產(chǎn)生隨機(jī)突變等優(yōu)點(diǎn).最初的單堿基編輯系統(tǒng)是可以實(shí)現(xiàn)C·G到T·A轉(zhuǎn)換的胞嘧啶編輯器(CBEs).隨后Liu et al[26]開(kāi)發(fā)了腺嘌呤堿基編輯器(ABEs)，介導(dǎo)基因組DNA中A到G的轉(zhuǎn)化.Qin et al[27]在棉花(GossypiumhirsutumL.)中實(shí)現(xiàn)了由A·T到G·C的精確編輯，由GhBE3產(chǎn)生的堿基編輯可從T0代遺傳到T1代.Wen et al[28]在玉米(ZeamaysLinn.)中建立優(yōu)化的基于靶向差異sgRNAs的代理報(bào)告系統(tǒng)(discriminated sgRNAs based surrogate system, DisSUGs)，以實(shí)現(xiàn)單堿基編輯細(xì)胞的高效富集，提高了突變細(xì)胞的篩選效率.單堿基編輯技術(shù)的應(yīng)用使植物的遺傳改良更加精確與安全.

1.3.2 RNA堿基編輯 RNA編輯是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因修飾，依賴(lài)PPR、MORF等蛋白家族發(fā)揮作用，可以有效提高編輯的精確性，增加基因產(chǎn)物的多樣性.Zhang et al[29]首先證明RNA在哺乳動(dòng)物中可以被編輯，并使用失活的Cas13蛋白(dCas13)建立了一種沒(méi)有嚴(yán)格序列限制、可以編輯包含致病性突變的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的系統(tǒng).Jesser et al[30]利用CRISPR/Cas13a能夠靶向噬菌體基因組的特性在煙草中實(shí)現(xiàn)對(duì)蕪菁花葉病毒(turnip mosaic virus,TuMV)和GFP融合轉(zhuǎn)錄本的干擾，為植物的抗病毒研究提供了一種新的技術(shù)手段.植物中的RNA編輯多存在于自身的細(xì)胞器內(nèi)[31]，目前人工開(kāi)發(fā)的編輯系統(tǒng)非常少，應(yīng)用前景廣闊.

1.3.3 系統(tǒng)優(yōu)化 傳統(tǒng)的CRISPR/Cas系統(tǒng)使用固定的幾種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas蛋白和sgRNA.常用的玉米泛素Ubi等啟動(dòng)子太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致單一載體只能連接較少的sgRNA，否則會(huì)導(dǎo)致載體過(guò)大，難以轉(zhuǎn)化和降低編輯效率.基于此，科研人員在OsU3/U6的基礎(chǔ)上篩選優(yōu)化出4個(gè)更加精簡(jiǎn)的啟動(dòng)子(mOsU3、mOsU6a、mOsU6b和mOsU6c).使用這些啟動(dòng)子能夠提高單一載體sgRNA表達(dá)盒的組裝數(shù)量，進(jìn)而提高多靶位點(diǎn)編輯的能力[32].此外，Zhang et al[33]在柑橘(CitrusreticulataBlanco.)中使用YAO基因的啟動(dòng)子，借助CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了快速高效的基因編輯，這類(lèi)啟動(dòng)子在植物花粉中高表達(dá)，有助于將編輯性狀遺傳給后代.這些新元件為CRISPR/Cas技術(shù)的深入研究以及植物的遺傳改良等提供了便利.

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的遞送與編輯鑒定方式

2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中的遞送方式

將CRISPR/Cas系統(tǒng)遞送進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)是該系統(tǒng)發(fā)揮作用的前提.目前植物領(lǐng)域應(yīng)用最多的主要有傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因遞送方法，納米材料的應(yīng)用則提供了更加便捷高效的遞送方法.

2.1.1 轉(zhuǎn)基因遞送 轉(zhuǎn)基因遞送方法主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，這是最為常見(jiàn)且可以獲得穩(wěn)定表達(dá)后代的一種方式.Zhu et al[34]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化山橘(Fortunellahindsii)愈傷組織，靶向編輯其F.hindsii基因.Lin et al[35]通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化綠竹(Bambusaoldhamii)、粟(Setariaitalica)、玉米等材料的原生質(zhì)體進(jìn)行基因編輯.Andersson et al[36]通過(guò)對(duì)分離的馬鈴薯原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和再生，對(duì)淀粉合酶相關(guān)基因進(jìn)行功能完全性敲除.此外，還可通過(guò)基因槍等粒子轟擊的方法將該系統(tǒng)導(dǎo)入到植物體內(nèi)，但是昂貴的費(fèi)用限制了其應(yīng)用.

2.1.2 非轉(zhuǎn)基因遞送 轉(zhuǎn)基因法導(dǎo)致外源基因的隨機(jī)插入，因此具有潛在的生態(tài)安全性隱患.而體外組裝的核糖核蛋白復(fù)合體(RNPs)可以在遞送進(jìn)細(xì)胞后立即切割靶標(biāo)，無(wú)需轉(zhuǎn)錄和翻譯，迅速降解，從而避免轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生，提高生物安全性.Woo et al[37]將體外預(yù)組裝的RNPs成功遞送到擬南芥、萵苣(Lactucasaliva)等植物中，并在再生植物中達(dá)到46%的突變效率.CRISPR/Cas9相關(guān)的RNP也已經(jīng)成功遞送到葡萄(Vitisvinifera)、蘋(píng)果(Maluspumila)等林木物種原生質(zhì)體當(dāng)中，實(shí)現(xiàn)了無(wú)轉(zhuǎn)基因編輯[38].此外，農(nóng)桿菌被用來(lái)介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，在煙草(Nicotianatabacum)中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)[39]，在再生白化植株中用特異性PCR檢測(cè)到5株植株不含T-DNA.這為CRISPR/Cas系統(tǒng)的非轉(zhuǎn)基因遞送提供了一種新方法，尤其適合童期較長(zhǎng)、多靠營(yíng)養(yǎng)繁殖的林木物種.

2.1.3 新穎的遞送方式 納米材料為CRISPR/Cas的遞送開(kāi)辟了另一條路徑.Doyle et al[40]通過(guò)葉面噴施含有CRISPR/Cas9質(zhì)粒包被的納米顆粒，實(shí)現(xiàn)了SPO11基因的編輯.該技術(shù)簡(jiǎn)單、高效、成本低廉，使非模式植物和轉(zhuǎn)化困難植物的基因組編輯成為可能.發(fā)育調(diào)控因子(DRs)可促進(jìn)植物在葉腋處的再生，利用該原理將分別含有DRs和sgRNA的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)Cas9的煙草，獲得了白化芽并且成功遺傳給后代[41].Daniel et al[42]提前生成過(guò)表達(dá)Cas9的本氏煙，然后將能夠表達(dá)sgRNA的RNA病毒轉(zhuǎn)化到提前生成的植株上，利用病毒可以遷移到生殖器官的特點(diǎn)在后代中創(chuàng)造有效突變.這兩種方法省時(shí)高效，可以消除組織培養(yǎng)的冗長(zhǎng)過(guò)程和遺傳轉(zhuǎn)化的壁壘.

圖2 CRISPR/Cas試驗(yàn)流程Fig.2 The flowchart of CRISPR/Cas experiment

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中的編輯鑒定

CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯中NHEJ途徑具有隨機(jī)性特點(diǎn)，容易產(chǎn)生非預(yù)期目標(biāo)突變.同時(shí)樣本當(dāng)中還混合著大量非編輯群體需要進(jìn)行篩選.對(duì)多種木本植物的突變類(lèi)型進(jìn)行分析，結(jié)果表明插入多局限在1～2 bp，其中1 bp的插入是最常見(jiàn)的，且缺失范圍大[43].因此，對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯情況進(jìn)行鑒定顯得尤為重要.目前可應(yīng)用于植物的鑒定方法主要有以下幾種.

2.2.1 非測(cè)序方法 目前常用的突變鑒定方法有T7EI(T7 endonucleaseI)、Surveyor核酸酶分析、PCR-RE(PCR/restriction enzyme)、HRM(high-resolution melting assay)和ACT-PCR法等.T7EI的原理與Surveyor核酸酶分析法相似，都是利用特異性核酸酶切割異源雙鏈錯(cuò)配DNA分子.Arai et al[44]在煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)中用Surveyor酶鑒定出cyp51A基因的單點(diǎn)突變株系，該方法在植物基因編輯研究中尚未見(jiàn)報(bào)道.PCR-RE法的原理是將目標(biāo)DNA進(jìn)行酶切，突變的靶序列會(huì)被富集，凝膠電泳后出現(xiàn)殘留條帶[45].Fengrui et al[46]對(duì)葡萄進(jìn)行T7EI和PCR/RE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)sgRNA中GC含量為65%時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生最高的編輯效率.HRM法是通過(guò)將突變片段的構(gòu)象和熔解曲線與野生型相比，將發(fā)生改變并且在PAGE膠上的遷移率發(fā)生變化的鑒定為突變體[47].Denbow et al用HRM法檢測(cè)到了擬南芥單堿基對(duì)的插入和缺失[48].ACT-PCR利用在臨界溫度下退火的原理鑒定編輯樣本，特異性引物包含切割位點(diǎn)，在突變體中無(wú)法進(jìn)行有效擴(kuò)增.Wang et al[49]用該方法在水稻中快速鑒定出了單突變體和多突變體.此外，還可用純化的核糖核蛋白復(fù)合體對(duì)目標(biāo)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割(PCR/RNP).Gao et al[50]用PCR/RNP方法和Sanger測(cè)序成功地對(duì)六倍體小麥(TriticumaestivumL.)和水稻的突變結(jié)果進(jìn)行基因型分型.

T7EI和Surveyor核酸酶分析法能夠快速檢測(cè)突變事件的發(fā)生，但是這兩種方法無(wú)法區(qū)分野生型和純合突變，也不能區(qū)分雙等位基因突變和雜合突變體[51].PCR-RE法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度較高，但是受到限制性酶切位點(diǎn)的限制.ACT-PCR僅需一個(gè)PCR步驟便可進(jìn)行凝膠電泳，確定編輯情況，可用于準(zhǔn)確測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的突變頻率.HRM法既可以對(duì)已知的突變類(lèi)型進(jìn)行分析，又可以對(duì)未知的突變進(jìn)行篩選，但是只能分析純度單一的小片段DNA，無(wú)法對(duì)長(zhǎng)片段和雜合片段進(jìn)行分析鑒定.相對(duì)而言PCR/RNP法更加靈敏，無(wú)需限制酶切位點(diǎn)，比PCR/RE方法更適用，可以區(qū)分野生型和純合突變、雙等位基因突變與雜合突變，但是RNP的制備也較復(fù)雜.

2.2.2 測(cè)序方法 測(cè)序法包括Sanger測(cè)序和高通量測(cè)序兩種.Sanger測(cè)序能夠鑒定一些純合突變，提供突變類(lèi)型的詳細(xì)信息，但是對(duì)多倍體基因組突變以及雜合突變的檢測(cè)能力較低.Giorio et al[52]在番茄(Solanumlycopersicum)中使用Sanger測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到的編輯效率為84%，但未檢測(cè)到嵌合體.Ma et al[53]考慮到雜合突變類(lèi)型的測(cè)序會(huì)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)并序列解碼(degenerate sequencedecoding, DSD)方法，能夠快速解碼測(cè)序圖中的雙峰信息，但是這種方法只適用于小規(guī)模的解碼.高通量二代測(cè)序(nextgenerationsequencing, NGS)技術(shù)則可以對(duì)一些嵌合突變或者大規(guī)模的突變樣本進(jìn)行鑒定分析[54]，尤其適合基因組倍性復(fù)雜、遺傳雜合度高的林木物種.基于NGS的Hi-TOM平臺(tái)可對(duì)水稻中CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的突變進(jìn)行高通量分析，從而檢測(cè)多個(gè)靶位點(diǎn)的突變，尤其適合對(duì)復(fù)雜的嵌合突變進(jìn)行鑒定[55].Yan et al[56]通過(guò)改進(jìn)MassARRAY和靶向捕獲測(cè)序技術(shù)在基因組龐大復(fù)雜的玉米中實(shí)現(xiàn)高通量和低成本的靶標(biāo)突變鑒定.高通量測(cè)序的方法雖然可以同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模的測(cè)序和分析，但費(fèi)用高，耗時(shí)長(zhǎng)[57].CRISPResso等工具的開(kāi)發(fā)則在逐步縮短時(shí)間，降低成本，解決高通量測(cè)序過(guò)程中帶來(lái)的難題[58].

2.2.3 熒光檢測(cè)方法 熒光標(biāo)簽的常規(guī)應(yīng)用主要是作為報(bào)告基因融合到載體T-DNA插入?yún)^(qū)來(lái)檢測(cè)處理的后代是否發(fā)生CRISPR/Cas元件的插入，便于進(jìn)一步篩選編輯后代[59].Yi et al[60]將GFP融合到CRISPR轉(zhuǎn)化載體上，了解轉(zhuǎn)化的香蕉(MusananaLour.)再生苗是否發(fā)生CRISPR/Cas元件的整合.這種方法雖然不能直接檢測(cè)到編輯事件的發(fā)生，但有助于進(jìn)一步篩選突變植株.Ye et al[61]在六倍體麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)中將含有靶向mGFP突變位點(diǎn)的sgRNA質(zhì)粒與含有mGFP的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，在育孵72 h后成功觀測(cè)到了綠色熒光，證明mGFP的突變位點(diǎn)復(fù)原，CRISPR/Cas系統(tǒng)可靶向編輯外源基因.該方法使得編輯事件可視化，適合原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率較高的物種.Leblanc et al[62]通過(guò)突變連接在內(nèi)源基因后的GFP來(lái)測(cè)定突變效率.此方法通過(guò)觀察報(bào)告基因的表達(dá)量同樣可以直觀地進(jìn)行突變鑒定，但是需要有穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的植株；對(duì)于缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系和再生周期較長(zhǎng)的林木物種來(lái)說(shuō)不太適用.

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在林木中的應(yīng)用

在林木中利用CRISPR/Cas系統(tǒng)通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得穩(wěn)定的編輯后代，目前該系統(tǒng)只應(yīng)用在楊樹(shù)(PopulusL.)[63]、山豆麻屬植物(Parasponiaandersonii)[64]、麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)以及蘋(píng)果[65]、甜橙[13]等少數(shù)幾個(gè)林木物種.該技術(shù)在林木中的研究應(yīng)用包含以下幾個(gè)方面.

3.1 技術(shù)體系的探索與建立

許多林木樹(shù)種在CRISPR領(lǐng)域的研究尚停留在技術(shù)體系摸索階段.Muhammad et al[66]從Cas蛋白的選擇、sgRNA的設(shè)計(jì)、突變體驗(yàn)證、在棗椰樹(shù)(PhoenixdactyliferaL.)中存在的局限性等方面論述了對(duì)椰棗樹(shù)進(jìn)行多重基因編輯的可行性，以期為使用該技術(shù)培育抵抗脅迫的棗椰樹(shù)提供理論指導(dǎo).鵝掌楸(Liriodendronchinensis)是我國(guó)特有的珍稀物種，目前其相關(guān)的CRISPR載體構(gòu)建工作已經(jīng)展開(kāi)[67].唐雨薇等[68]針對(duì)茶樹(shù)(CamelliasinensisL.)的咖啡堿合成酶編碼基因(TCS)構(gòu)建了CRISPR雙靶點(diǎn)表達(dá)載體，通過(guò)優(yōu)化茶樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化和組培再生體系，成功將載體導(dǎo)入到茶樹(shù)體細(xì)胞胚中并獲得插入突變[69].2015年，喬治亞大學(xué)的研究人員在毛白楊(Populustomentosa)中使用Cas9成功敲除木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因，結(jié)果表明該系統(tǒng)在楊樹(shù)中具有較高的效率和序列特異性[70].這是CRISPR/Cas系統(tǒng)在木本植物中得到編輯后代的首次成功應(yīng)用，自此打開(kāi)了林木基因編輯的大門(mén).

木薯(ManihotesculentaCrantz)常規(guī)的育種方法受到生命周期長(zhǎng)、雜合度高和近親衰退的限制[71].Odipio et al[72]開(kāi)發(fā)CRISPR/Cas9技術(shù)靶向木薯MePDS基因外顯子，將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化木薯胚性愈傷組織，AtU6和35S被用來(lái)構(gòu)建該表達(dá)載體；編輯后代出現(xiàn)白化和矮化表型，并且白化植株存活不會(huì)超過(guò)3個(gè)體外繁殖周期.篩選分析發(fā)現(xiàn)，堿基替換比插入和缺失頻率高，在T0代中純合子突變達(dá)到了21.1%，雜合子突變達(dá)到了89.5%[72]，在6～8周便可以檢測(cè)突變事件的發(fā)生，可為再生周期長(zhǎng)的樹(shù)種的編輯結(jié)果提供快速的評(píng)估和優(yōu)化.2018年，Lin et al[35]使用CRISPR/Cas9載體靶向綠竹的PDS基因，并進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，48 h后發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化效率僅為6.6%，這些突變均為1～13 bp的缺失或1 bp的替換；用限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增子后檢測(cè)富集的突變達(dá)到71%.該系統(tǒng)分別用OsU3、OsU6和35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng).雖然沒(méi)有獲得再生植株，但是在原生質(zhì)體中成功地對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行編輯，為林木相關(guān)基因功能鑒定提供了一種便捷的手段.這些初級(jí)階段的工作為后續(xù)使用CRISPR/Cas系統(tǒng)培育具有優(yōu)良生產(chǎn)特性的新品系奠定了基礎(chǔ).

3.2 生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的功能解析

Muhr et al[73]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成該團(tuán)隊(duì)先前鑒定的楊樹(shù)候選基因BRANCHED1-1和BRANCHED2-1突變體，結(jié)果顯示BRANCHED1-1突變體的芽伸長(zhǎng)；BRANCHED2-1突變體具有極端的芽生長(zhǎng)表型，并且在每個(gè)結(jié)節(jié)處都有兩個(gè)異位葉，這對(duì)以后楊樹(shù)芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)甚至是株型調(diào)控具有重要的參考意義.Christin et al敲除銀灰楊(P.tremula×alba)的UGT71L1基因后，其毛狀根中的水楊酸含量明顯下降，表明該基因是楊樹(shù)水楊酸合成途徑中的關(guān)鍵基因[74].但是另一個(gè)基因UGT78M1并未敲除成功，表明林木sgRNA的設(shè)計(jì)要求更為嚴(yán)苛、精確.山豆麻屬植物Parasponiaandersonii是除豆科植物外唯一可以進(jìn)行固氮的木本植物.Zeijl et al對(duì)該植物與固氮有關(guān)的PanHK4、PanEIN2等候選基因進(jìn)行了定點(diǎn)誘變.研究人員用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建二元轉(zhuǎn)化表達(dá)載體，使用AtU6p驅(qū)動(dòng)小核RNA，并用35S驅(qū)動(dòng)擬南芥密碼子優(yōu)化的Cas9.使用農(nóng)桿菌侵染外植體，然后將外植體與再生的愈傷分開(kāi)，激發(fā)芽的形成；新生芽可在4～6周內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，3個(gè)月內(nèi)生成T1代小苗.基因分型顯示，超過(guò)85%的轉(zhuǎn)化子含Cas9并且有50%以上的發(fā)生突變.進(jìn)一步試驗(yàn)分析表明，穩(wěn)定的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化與CRISPR/Cas9基因組編輯相結(jié)合可以有效地用于該物種的反向遺傳分析[64].Ye et al通過(guò)農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的方式編輯麻竹，突變掉了一個(gè)響應(yīng)赤霉素信號(hào)的基因GRG1，與野生型相比再生植株的節(jié)間長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，株高增大[61]，這對(duì)于研究禾本科竹子的快速伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)具有重要意義.

用材樹(shù)種的生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵在于木質(zhì)部的生長(zhǎng)發(fā)育.對(duì)桉樹(shù)(Eucalyptusspp.)與木材生長(zhǎng)的相關(guān)基因CCR1和IAA9A用毛狀根轉(zhuǎn)化的方式進(jìn)行編輯，結(jié)果表明幾乎所有的毛狀根都被編輯，但等位基因的編輯效率隨目標(biāo)基因的不同有很大差異[75].研究發(fā)現(xiàn)，SNP位點(diǎn)越靠近PAM，越有可能造成編輯無(wú)效.這對(duì)具有高度雜合基因組的林木物種來(lái)說(shuō)，其sgRNA的設(shè)計(jì)必須更加精確、特異，必須考慮到頻繁出現(xiàn)的SNP才能實(shí)現(xiàn)有效的基因組編輯[70].對(duì)基因組中含有大量SNP的物種來(lái)說(shuō)，其突變鑒定必須更加小心謹(jǐn)慎，以防受到干擾.研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)在楊樹(shù)中會(huì)高效生成高特異性的雙等位基因突變.Luo et al[76]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成了毛白楊的PtoDWF4突變體，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，PtoDWF4突變體中次級(jí)細(xì)胞壁的生物合成降低，細(xì)胞層數(shù)和木質(zhì)部面積都大幅度降低.該研究解析了楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育的關(guān)鍵基因，為以后培育高產(chǎn)量木材的楊樹(shù)品種打下了基礎(chǔ).

3.3 抗逆相關(guān)基因解析

Luo et al通過(guò)編輯ProPtrWRKY18和ProPtrWRKY35證實(shí)毛白楊中的這兩個(gè)基因參與對(duì)生物脅迫的響應(yīng)，突變體對(duì)真菌的抗性明顯下降[77].速生楊樹(shù)容易受到干旱等脅迫[78]，Luo et al在2019年還敲除了毛果楊的PtrADA2b等基因，揭示了組蛋白H3K9ac參與干旱脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制[79].2017年，劉慧慧等[80]對(duì)美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)翅形成相關(guān)基因Wnt-1進(jìn)行編輯，結(jié)果顯示該基因隨著胚胎發(fā)育其表達(dá)量逐漸下降，這對(duì)于解析其基因功能、降低美國(guó)白蛾的遷徙能力具有重要意義.2019年Li et al[81]對(duì)美國(guó)白蛾生殖相關(guān)基因用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)編輯，突變體后代表現(xiàn)出特異性不育.該技術(shù)雖然沒(méi)有直接應(yīng)用于林木自身，但對(duì)林木蟲(chóng)害防治具有重要的生物學(xué)意義.

柑橘是最早應(yīng)用CRISPR/Cas技術(shù)的林木物種之一，其遺傳改良受到物種生長(zhǎng)緩慢、多胚和單性結(jié)實(shí)的限制[82].2019年，Jia et al[18]利用CRISPR/cpf1系統(tǒng)靶向了柑橘潰瘍病易感基因CsLOB1并生成突變?cè)偕仓?至此，使用CRISPR/Cas技術(shù)對(duì)柑橘進(jìn)行遺傳改良又向前邁進(jìn)了一步.上述研究通過(guò)對(duì)林木抗逆基因或與之相關(guān)的病蟲(chóng)害基因的解析為林業(yè)生產(chǎn)中防治大袋蛾(Claniavartegata)、松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)等林木蟲(chóng)害[83]，培育抗逆新種提供了新思路.

3.4 非轉(zhuǎn)基因育種的探究

因涉及到轉(zhuǎn)基因安全問(wèn)題，非轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段在水果類(lèi)植物中應(yīng)用較多.科學(xué)家針對(duì)葡萄易感基因MLO-7和蘋(píng)果的DIPM-1、DIPM-2、DIPM-4基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，將純化的CRISPR/Cas9核糖核蛋白直接遞送進(jìn)兩種植物的原生質(zhì)體進(jìn)行定向基因組編輯.靶向深度測(cè)序以及生物學(xué)重復(fù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，葡萄的突變率為0.1%，而蘋(píng)果的突變率是0.5%～6.9%.雖然突變頻率較低，但該方法不會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因殘留，這為培育無(wú)外源DNA污染的新品種鋪平了道路[38].

除水果作物之外，橡膠樹(shù)異花授粉、童期長(zhǎng)、缺素等容易導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢[84]，傳統(tǒng)的育種方法難以滿(mǎn)足生產(chǎn)橡膠原材料的需求.Hua et al針對(duì)橡膠樹(shù)花期相關(guān)基因FT和TFL1設(shè)計(jì)sgRNA，然后通過(guò)將RNP轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法成功建立了橡膠樹(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，為培育非轉(zhuǎn)基因、高產(chǎn)橡膠新品系提供參考[85].

3.5 林木生殖相關(guān)基因研究

麻瘋樹(shù)種子提煉的生物油可以替代化石燃料，被認(rèn)為是一種潛在的生物能源.但是現(xiàn)階段麻瘋樹(shù)的種子產(chǎn)量很低，難以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn).Xu et al報(bào)道外源細(xì)胞分裂素可以提高雌雄花的比例進(jìn)而提高種子產(chǎn)量[86].為了探究細(xì)胞分裂素對(duì)麻瘋樹(shù)成花機(jī)制的調(diào)控作用，Xu et al利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變?cè)撐锓N中的一個(gè)細(xì)胞分裂素合成相關(guān)基因JcCYP735A；突變體生長(zhǎng)遲緩，其內(nèi)源反式/順式玉米素與核苷濃度顯著降低，細(xì)胞分裂素含量下降.這些結(jié)果將有助于細(xì)胞分裂素代謝基因功能的進(jìn)一步研究，提高麻瘋樹(shù)種子的產(chǎn)量[87].

Charrier et al[88]研究了梨(PyruscommunisL.)的PcTFL1.1基因，編輯體多為嵌合突變類(lèi)型且呈現(xiàn)出早花表型.對(duì)該基因的研究有助于培育提前開(kāi)花結(jié)實(shí)的新品種和加速梨樹(shù)的快速生殖繁育.Elorriaga et al[89]對(duì)楊樹(shù)的花分生組織同源基因LEAFY和兩個(gè)花器官同源基因AGAMOUS進(jìn)行編輯，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫靶事件，轉(zhuǎn)化子達(dá)到了77.5%的突變效率.楊樹(shù)多為無(wú)性生殖，其遺傳力衰退嚴(yán)重，該研究對(duì)于研究楊樹(shù)的開(kāi)花結(jié)實(shí)和實(shí)生生殖意義重大.

CRISPR/Cas系統(tǒng)在木本模式植物楊屬中的應(yīng)用見(jiàn)表1[90-103].

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)在楊樹(shù)等林木物種中的研究與應(yīng)用 Table 1 Research and application of CRISPR/Cas system in poplar and other forest species

4 展望

針對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的不足，科學(xué)家如今已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多CRISPR/Cas新技術(shù).Benjamin et al設(shè)計(jì)的Cas9突變體SpRY可以靶向幾乎所有的PAM序列，且在人類(lèi)細(xì)胞中獲得了以前無(wú)法獲得的與疾病相關(guān)的遺傳變異[104].Gao et al在水稻和小麥中建立的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(plant prime editing, PPE)能夠?qū)崿F(xiàn)12種類(lèi)型的精準(zhǔn)編輯，為植物的遺傳育種提供豐富的突變類(lèi)型，生成更多可供選擇的優(yōu)良性狀[105].HDR途徑、單堿基編輯器、RNA編輯和這些更加高效精準(zhǔn)的CRISPR/Cas新技術(shù)目前只在人類(lèi)醫(yī)學(xué)、動(dòng)物和農(nóng)作物當(dāng)中得到應(yīng)用，在木本植物研究中應(yīng)用較少或未有相關(guān)報(bào)道.這些技術(shù)將有利于林木基因序列多態(tài)性的高效開(kāi)發(fā)與利用.

雖然麻竹、橡膠樹(shù)等物種的原生質(zhì)體實(shí)現(xiàn)了基因編輯，但大多數(shù)林木物種的原生質(zhì)體制備、高效轉(zhuǎn)化以及再生仍然是一個(gè)技術(shù)難題.而且RNP法也多依賴(lài)于原生質(zhì)體的高效轉(zhuǎn)化與再生.因此，開(kāi)發(fā)高效的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和再生體系對(duì)林木基因編輯新品系的開(kāi)發(fā)具有重要的助推作用.同時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)在林業(yè)上的研究多集中在經(jīng)濟(jì)水果中，局限于廣譜性基因的研究，對(duì)于用材和生態(tài)保護(hù)類(lèi)物種的研究較少.目前僅對(duì)裸子植物中的落葉松進(jìn)行相關(guān)研究[100]，林木裸子物種未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道.這與木本植物基因組測(cè)序工作相對(duì)滯后、靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)分析平臺(tái)收錄的林木物種基因組數(shù)據(jù)不夠完善、多數(shù)林業(yè)品種存在遺傳轉(zhuǎn)化壁壘等有關(guān).因此建立健全開(kāi)放的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建高通量突變體文庫(kù)，加快林業(yè)良種的基因組測(cè)序，收錄更多林業(yè)生產(chǎn)上常見(jiàn)品種的基因組信息，探索建立穩(wěn)定高效、耗時(shí)短、成本低廉的遺傳轉(zhuǎn)化體系等，將會(huì)極大拓展CRISPR/Cas系統(tǒng)在林業(yè)科學(xué)尤其是木本良種選育中的應(yīng)用范圍.

在林業(yè)科學(xué)研究當(dāng)中，CRISPR/Cas系統(tǒng)多應(yīng)用于林木物種自身的基因編輯，而在與其相關(guān)的生物脅迫上的應(yīng)用十分有限.當(dāng)然，這涉及到昆蟲(chóng)學(xué)、微生物學(xué)和樹(shù)木病理學(xué)等其他學(xué)科的發(fā)展.只有多學(xué)科協(xié)同發(fā)展，才能使CRISPR/Cas技術(shù)更好地服務(wù)于木本植物病蟲(chóng)害研究，促進(jìn)林業(yè)科學(xué)發(fā)展.此外，轉(zhuǎn)基因遞送方式會(huì)帶來(lái)外源基因的插入與表達(dá)，木本植物的世代周期一般很長(zhǎng)，很難通過(guò)后代群體分離而剔除.這無(wú)論是對(duì)植物本身還是對(duì)生物環(huán)境都會(huì)帶來(lái)不可預(yù)估的影響.在生物安全備受關(guān)注的今天，除RNP法外，更多無(wú)外源DNA污染的遺傳轉(zhuǎn)化方法的開(kāi)發(fā)已是大勢(shì)所趨.CRISPR/Cas技術(shù)的安全發(fā)展需要國(guó)家及時(shí)出臺(tái)相關(guān)法律法規(guī)，對(duì)基因編輯植物進(jìn)行監(jiān)管.隨著技術(shù)的進(jìn)步，CRISPR/Cas系統(tǒng)必將更加安全完善，使植物遺傳改良向著有利于人類(lèi)社會(huì)的方向發(fā)展.