王 明，王萬興，何長征，胡新喜，熊興耀，秦玉芝*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

脯氨酸是植物對逆境脅迫響應的重要生理指標[1]，植物在干旱[2]、高溫、低溫、鹽漬等不利環(huán)境下，伴隨著脯氨酸的積累。關于脯氨酸積累對植物保護作用的機制有多種說法，如作為滲透調(diào)節(jié)劑、自由基清除劑或大分子結(jié)構(gòu)保護劑等來維持植物正常的代謝[3]。Kemble和Macpherson[4]發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草脯氨酸的抗旱機制，在干旱脅迫下其葉片累積脯氨酸，脯氨酸的含量隨著脅迫時間的延長而增多。Hadi和Fuller[5]研究表明脯氨酸含量與干旱（R2=0.524）和鹽（R2=0.786）耐受性呈顯著正相關。前期研究發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)和液泡中的脯氨酸的分布約為15～98∶1。鹽和干旱脅迫下，脯氨酸首先在細胞質(zhì)中積累，當細胞轉(zhuǎn)至滲透下，液泡中的脯氨酸含量開始下降[6]。無論哪種逆境，脯氨酸在植物中的積累，可以比原始含量增加數(shù)十至數(shù)百倍。盡管不同組織或部位游離脯氨酸的變化存在差異，但其含量與其抗逆性呈正相關[7-13]，這也說明脯氨酸對植物各部位的自我保護起著重要作用。

越來越多的研究表明，脯氨酸轉(zhuǎn)運體可能在脯氨酸積累過程中起重要作用。脯氨酸轉(zhuǎn)運體ProT1、ProT2和ProT3相繼在擬南芥中鑒定出來，其中AtProT1在全株韌皮部或韌皮部薄壁組織細胞中均有表達，說明其在相容性溶質(zhì)的長距離運輸中起作用[14]。在植物中，有多個氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族，如氨基酸通透酶家族（AAPs）、賴氨酸組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白家族（LHTs）和脯氨酸轉(zhuǎn)運體家族（ProTs）參與脯氨酸在各個器官間的運輸[15]。脯氨酸的合成與降解在細胞內(nèi)呈區(qū)室化分布，脅迫條件下脯氨酸積累，而脅迫消除時脯氨酸迅速降解，說明細胞內(nèi)脯氨酸的轉(zhuǎn)運體在逆境中起重要作用。另外，脯氨酸轉(zhuǎn)運體同樣存在于細胞間，缺水條件下白三葉草的韌皮部出現(xiàn)高濃度的脯氨酸積累[16]。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中馬鈴薯經(jīng)常遭受干旱、鹽堿和極端溫度等非生物脅迫，而關于馬鈴薯ProT家族的生物信息學分析以及非生物脅迫相關性研究尚且不多。本研究采用RT-PCR技術，從馬鈴薯GS393中克隆了1個ProT家族基因StProT3，對其核酸及蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)進行系統(tǒng)分析，同時研究了StProT3基因的組織表達特異性及其在不同非生物脅迫下的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為馬鈴薯GS393（Solanumcommersonii-LZ3.4-Wisconsin，United States）。

主要試劑：植物去多糖多酚總RNA提取試劑盒和2 000 bp DNA Ladder，購自北京天根生化科技有限公司，GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit，PCR Master Mix，2×T5 Fast qPCR Mix，pClone007 Vector及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自北京擎科新業(yè)生物技術有限公司；IAA、GA3、ABA、6-BA和聚乙二醇6000（PEG-6000）購自Sigma。相關引物（表1）由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。

表1 馬鈴薯StProT3 PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification of potato StProT3

1.2 方法

1.2.1 材料處理和采集

用MS固體培養(yǎng)基（MS液體培養(yǎng)基+0.7%瓊脂粉+3%蔗糖，pH 5.8～6.0）培養(yǎng)馬鈴薯30 d，選擇具有相同生長勢的組培苗，分別進行處理。將樣品包裹在錫箔紙中，在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃冰箱中備用。將組培苗用漂浮板將根部浸泡在氯化汞（200 mg/L）、氯化鎘（200 mg/L）、氯化銅（200 mg/L）、氯化鋁（200 mg/L）、NaCl（11.7 g/L）和PEG-6000（20 g/L）中，蒸餾水為對照；將組培苗放置霜凍箱中4℃處理；重金屬和低溫處理均按0，2，8，24，36和48 h取樣。用IAA（100 mg/L）、GA3（100 mg/L）、ABA（100 mg/L）、6-BA（100 mg/L）噴施GS393組培苗，每瓶噴施3 mL，均按0，2，8，24和36 h取樣。每組處理設置3個重復。

1.2.2 馬鈴薯總RNA提取及基因ORF的擴增

馬鈴薯總RNA提取采用植物去多糖多酚總RNA提取試劑盒，用微量紫外分光光度計測量濃度和純度。RNA反轉(zhuǎn)錄用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京擎科新業(yè)生物技術有限公司）完成。根據(jù)實驗室轉(zhuǎn)錄組測序所得到的StProT3的5'和3'的序列，利用Primer 5.0設計在基因StProT3的ORF起始子ATG和終止子TAA處設計特異引物。以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR。反應體系為Mix 12.5 uL，上、下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 9.5μL。PCR擴增條件：98℃運行2 min，98℃運行30 s，55℃運行30 s，72℃運行30 s，72℃運行10 min，10℃保存。對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠、回收后連接載體pClone007，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)，37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR檢測篩選陽性克隆后送至測序。

1.2.3 StProT3序列的生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0軟件，對CDS序列進行翻譯和蛋白質(zhì)序列多重比對，并對蛋白質(zhì)分子式、等電點、疏水性和蛋白分子量等理化性質(zhì)進行預測分析；通過NCBI中的Protein blast進行相似蛋白的搜索，并下載茄科植物的ProT蛋白序列；利用TMHMM判定是否為膜蛋白；利用SMART預測蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域；采用SWISS-MODLE在線預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；用MEGA 7.0構(gòu)建氨基酸序列系統(tǒng)進化樹；通過PlantCare對StProT3基因進行啟動子調(diào)控元件分析。

1.2.4 基因表達模式分析

熒光定量儀器使用Applied Biosystems Q5型定量PCR儀，基因的相對表達量采用2-ΔΔCT公式計算，分析基因StProT3的表達情況。用Primier 5.0設計基因StProT3熒光定量引物，并以Actin作為內(nèi)參對照。以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，反應體系為20 uL，參照2×T5 Fast qPCR Mix熒光定量試劑盒，反應程序為95℃運行1 min，95℃運行10 s，60℃運行15 s，40個循環(huán)。每個樣品均設置3個重復。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism6制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆及序列分析

通過比對馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，并以PCR驗證，獲得的目的基因含完整CDS序列，目的基因CDS大小為1 317 bp（圖1），編碼438個氨基酸，位于染色體ch05上。分子式為C2266H3449N557O578S15。生物信息學分析結(jié)果顯示，該序列編碼的蛋白相對分子量為48 223.60 Da，理論等電點為9.32；不穩(wěn)定指數(shù)為31.56，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為110.53，親水性的平均值是0.596，屬于疏水性蛋白。結(jié)構(gòu)域預測分析表明，該蛋白存在12個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2），還含有2個低復雜結(jié)構(gòu)，存在于57～81位氨基酸和272～285位氨基酸。用SignalP 4.1 Server預測信號肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)StProT3蛋白的S平均值為0.113，小于0.5，預測不存在信號肽。用SOPMA二級結(jié)構(gòu)和SWISS-MODEL 3D結(jié)構(gòu)進行預測的結(jié)果表明，StProT3蛋白主要由46.35%的α螺旋，22.60%的延伸鏈，4.34%的β折疊和26.71%的無規(guī)則卷曲組成（圖3）。

圖1 StProT3的PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測Figure1 Electrophoretic detection of PCR amplification productsof StProT3

圖2 StProT3基因的氨基酸序列分析Figure 2 Amino acid sequence analysis of StProT3 gene

2.2 StProT3蛋白同源性分析

與茄科植物蛋白數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表明，該蛋白與番茄（Solanum lycopersicum）ProT基因家族的SlyProT3具有96%的相似性，其次是辣椒（Capsicumannuum），一致性達92%，因此將其命名為StProT3，NCBIID注冊為MH027990.1。

選擇水稻、擬南芥和番茄3個物種的ProT同源蛋白序列與StProT3進行氨基酸多重序列比對。多重序列比對結(jié)果顯示一致性為69.01%（圖4），這些ProT蛋白的ProT結(jié)構(gòu)域高度保守。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示（圖5），馬鈴薯StProT3與同屬同科的番茄和辣椒ProT3蛋白親緣關系最近。

2.3 基因StProT3啟動子元件分析

在https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html馬鈴薯數(shù)據(jù)庫里查找StProT3基因的啟動子序列，截取起始子ATG上游區(qū)域約1 500 bp啟動子序列，通過PlantCare預測表明基因StProT3在翻譯起始子上游含有光響應元件Box 4、Gap-box、I-box和Sp1，低溫響應元件LTR，MYB結(jié)合位點參與干旱誘導的順式作用元件MBS，以及參與晝夜控制的順式作用調(diào)節(jié)元件circadian。具體順式作用元件見圖6。

2.4 StProT3組織表達特異性

組織表達分析結(jié)果（圖7A）（P＜0.05）表明，StProT3在馬鈴薯根、莖、葉、匍匐莖和塊莖中皆有表達，其中，表達量最高的組織是根，莖次之，表達量最低的組織是匍匐莖。

2.5 StProT3的非生物脅迫表達分析

StProT3的重金屬誘導表達分析結(jié)果顯示（圖7B）（P＜0.01），馬鈴薯中StProT3受汞脅迫誘導最大，在48 h內(nèi)處在上調(diào)階段，表達量在24 h最高。基因StProT3受Al脅迫誘導較明顯，在48h是對照10.2倍。在CdCl2處理24h時，StProT3顯著高于對照，為對照的4倍，48h時，該基因的表達基本恢復到與對照相近的水平。CuCl2處理2h時表達量達到最高，約為對照的25.3倍，處理24h時，該基因的表達低于對照達到最低，為對照的0.7倍，之后恢復到對照相近的水平。

圖4 茄科不同物種ProT氨基酸序列的多重比對Figure4 Multiplealignment of ProT amino acid sequencesin different speciesof Solanaceae

圖5 StProT3氨基酸序列與不同物種ProT氨基酸的系統(tǒng)進化樹Figure 5 Phylogenetic tree of StProT3 amino acid sequence and ProT amino acids of different species

圖6 基因StProT3啟動子序列分析Figure 6 Sequence analysis of the gene StProT3 promoter

激素脅迫處理表明（圖7C）（P＜0.05），在36 h內(nèi)ABA抑制基因StProT3的表達，36 h時最低，是對照的0.04倍。6-BA處理24 h時，StProT3的表達顯著高于對照，達到最高峰，為對照的16倍。在GA3脅迫下基因StProT3 2 h內(nèi)處于上調(diào)，在2 h時表達量達到最大值，是對照的4.8倍；在8～24 h處于下調(diào)，在24 h時表達量達到最小值為對照的0.1倍。在IAA處理下，8 h時基因的表達量達到最高，約為對照的7.1倍。

圖7D結(jié)果顯示（P＜0.01），StProT3的表達受低溫抑制，但受鹽脅迫和干旱脅迫的誘導。在4℃低溫脅迫下，8 h時表達量達到最低，約為對照的0.05倍。NaCl處理8 h時，StProT3的表達顯著高于對照。PEG-6000處理48 h內(nèi)基因StProT3的表達一直處于上調(diào)水平，48 h仍顯著高于對照。

3 討論

StProT3在馬鈴薯的根、莖、葉、匍匐莖和塊莖中的相對表達量差異顯著，在根中的相對表達量明顯高于其他組織，推測馬鈴薯根部形態(tài)建成可能與StProT參與有關。Shen等[17]在榆錢菠菜中克隆的AhProT1基因在擬南芥和番茄中表達的ProT氨基酸序列均含有11個核心跨膜結(jié)構(gòu)域（cTM），都是高度保守區(qū)，這與前人的研究相一致；Akihiro等[18]在鹽脅迫下也發(fā)現(xiàn)HvProT基因在大麥的根尖部強烈表達，這與前人的研究相一致。說明ProT家族蛋白具有分布廣和功能多的性質(zhì)，其家族基因在植物生長和發(fā)育中起重要作用。

圖7 StProT3基因在馬鈴薯不同組織和非生物脅迫中的相對表達量Figure 7 Relative expression of StProT3 gene in different tissues and under abiotic stresses of potato

本研究的馬鈴薯被氯化汞、氯化鎘、氯化銅、氯化鋁、PEG-6000、NaCl、IAA、GA3、6-BA處理能誘導StProT3基因表達，而被低溫和ABA處理則抑制表達，表明StProT3基因參與了馬鈴薯的激素信號傳導以及非生物脅迫響應。對StProT的脅迫表達模式研究表明，StProT3基因在鹽脅迫、鎘脅迫、銅脅迫和IAA脅迫的表達量呈升-降的趨勢，推測該基因表達存在反饋調(diào)控。Liu和Bush[19]的結(jié)果表明，在StProT3和AtProT2啟動子中有1個重要的干旱響應元件（DRE）。在干旱時擬南芥為適應環(huán)境AtProT2基因表達上調(diào)[2]，也有文獻記載馬鈴薯在干旱滲透脅迫下顯示出較強的適應能力，短時間內(nèi)脯氨酸達到對照的300倍左右[20]。另外，在鋁脅迫和GA3脅迫下出現(xiàn)的趨勢是“升-降-升”，可能在受到脅迫時，脯氨酸蛋白維持在較高水平，使該基因轉(zhuǎn)錄受反饋機制調(diào)節(jié)。重金屬脅迫下，StProT3對汞脅迫的響應最劇烈，高達對照的439倍，說明ProT3對汞脅迫更敏感。而在低溫下，StProT3基因的表達量下調(diào)，結(jié)合其啟動子上LTR元件說明了該基因具有響應低溫的特性，調(diào)控機制還有待探索。以上印證了ProT基因存在馬鈴薯植物各組織中，而表達水平受滲透脅迫誘導[21]。越來越多的證據(jù)表明，植物氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因受到多種環(huán)境和發(fā)育信號的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[22]。

諸多研究表明脯氨酸轉(zhuǎn)運體基因是植物體內(nèi)脯氨酸轉(zhuǎn)運、調(diào)配的功能基因[11,16,17,23]。本研究發(fā)現(xiàn)，StProT基因在應對低溫、鹽、干旱、重金屬脅迫和激素處理等非生物脅迫方面起了重要作用，為進一步研究馬鈴薯StProT蛋白家族的生物學功能和機制奠定了基礎。