孟金玉,潘惜雨,褚 然,宋 坤

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科,濟南 250012)

卵巢癌是40歲以上女性最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率居婦科惡性腫瘤首位[1]。卵巢癌早期臨床表現(xiàn)隱匿,加之缺乏有效的早期篩查手段,患者確診時多已處于III期和IV期,5年生存率低于50%[2]。目前,卵巢癌的治療以腫瘤細胞減滅術(shù)為主,輔以化療、放療及靶向治療等多種治療方法,但仍有相當一部分病例經(jīng)初始的手術(shù)治療及化療之后出現(xiàn)復(fù)發(fā),或?qū)熌退嶽3]。因此,卵巢癌亟需探究一種新的早期篩查和治療手段。

DNA損傷修復(fù)是目前癌癥治療的研究熱點。DNA單鏈損傷時,其完整的互補鏈可作為模板,通過堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)、錯配修復(fù)(mismatch repair,MR)等途徑進行DNA損傷修復(fù)。而DNA雙鏈損傷則主要通過非同源末端剪接(non-homologous end joining,NHEJ)及同源重組修復(fù)(homologous recombination repair,HRR)途徑進行修復(fù)[4]。DNA損傷中,單鏈DNA損傷(single-strand break,SSB)會發(fā)展為致死性最強的雙鏈DNA斷裂(double-strand break,DSB),而DNA雙鏈損傷如得不到及時修復(fù),將會出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定和細胞死亡[5]。如果存在同源重組修復(fù)缺陷(homologous recombination deficiency,HRD),如 BRCA1、BRCA2 突變等,則可選擇性地利用PARP抑制劑(PARP inhibitors,PARPi)抑制DNA單鏈損傷修復(fù),導(dǎo)致未修復(fù)或修復(fù)不良的腫瘤細胞發(fā)生合成致死[6]。已有研究表明,PARP1異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),PARP1在乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中異常表達[7]。本研究旨在通過數(shù)據(jù)庫分析卵巢癌組織與正常卵巢組織的PARP1表達差異,結(jié)合病理組織學(xué)樣本探討PARP1表達與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,探討PARP1作為上皮性卵巢癌常規(guī)檢測指標的臨床意義,進而為卵巢癌臨床診療提供一定參考價值。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫資料來源 使用R語言下載腫瘤細胞系百科全書(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)數(shù)據(jù)庫信息,獲取特定的卵巢腫瘤矩陣數(shù)據(jù)并進行GO功能的富集。使用基因表達譜數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)在線數(shù)據(jù)庫下載卵巢癌(426例)與正常卵巢組織(88例)數(shù)據(jù)。新加坡癌癥科學(xué)研究所卵巢癌數(shù)據(jù)庫(ovarian cancer database of Cancer Science Institute Singapore,CSIOVDB)提取上皮性卵巢癌的臨床病理學(xué)特征,分析PARP1表達量與卵巢癌分期、分級、鉑耐藥等臨床特征之間的關(guān)系。Kaplan Meier Plotter(KM plotter)數(shù)據(jù)庫分析了PARP1與上皮性卵巢癌患者生存、預(yù)后之間的關(guān)系。

1.2 臨床資料來源 隨機選取2015年至2017年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收治的45例上皮性卵巢癌患者及12例行子宮附件切除術(shù)的非卵巢病變者的臨床標本。45例上皮性卵巢癌患者的年齡29～73歲,≥55歲25例,＜55歲20例;組織病理學(xué)診斷均為高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer,HGSOC);FIGO分期(2014版分期):I/II期8例,III/IV期37例;腫瘤直徑≥8cm 25例,＜8cm 20例;腹水陽性30例,陰性15例;CA125≥35U/mL 41例,＜35U/mL 4例;患者死亡10例,存活35例。上皮性卵巢癌患者納入標準:(1)術(shù)后病理確診為高級別漿液性卵巢癌;(2)患者術(shù)前均未接受化療、放療、免疫治療等其他治療;(3)無其他腫瘤及卵巢相關(guān)疾病病史。(4)患者的年齡、腹水、分化程度、分期、腫瘤大小、CA125、預(yù)后等相關(guān)臨床信息完整。本臨床研究獲得山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會的批準許可。

1.3 主要試劑 PARP1兔抗人單克隆抗體(ab91217)購自英國Abcam公司;生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(SP-9000)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)購自中杉金橋;電子顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.4 免疫組化染色 所有臨床組織學(xué)樣本均經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水及石蠟包埋處理,制備成4μm切片備用。65℃烤片1h,二甲苯溶液中脫蠟透明,于梯度乙醇中脫去二甲苯。枸櫞酸抗原修復(fù)30min,內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育30min,山羊血清工作液室溫孵育30min以封閉非特異性抗原,一抗4℃過夜。次日室溫復(fù)溫1h。二抗室溫孵育30min。辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育30min。顯微鏡下DAB顯色45s,置于自來水中充分沖洗,蘇木素染色7min,自來水充分沖洗。玻片置于1%鹽酸酒精分化1～2s,1%氨水反藍10s。將玻片置于梯度乙醇中脫水,二甲苯I、II透明,中性樹脂封片。

1.5 免疫組化結(jié)果評估 PARP1表達在細胞核,染色陽性結(jié)果為胞核呈黃色或黃褐色。免疫組化分析結(jié)果由兩個獨立的病理醫(yī)師進行評估。染色強度評分:陰性0分;弱陽性1分;中等陽性2分;強陽性3分。陽性細胞率評分:少于5%,0分;5% ～25%,1分;26% ～50%,2分;51% ～75%,3分;大于75%,4分。評分為染色強度和染色區(qū)域的乘積:0～7分為低表達,8～12分為高表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用R3.6.1、GraphPad8.0及SPSS24.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計數(shù)資料用率(%)表示,采用卡方檢驗。Kaplan-Meier生存分析用于比較兩組患者間總生存率(overall survival,OS)的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCLE數(shù)據(jù)庫富集PARP1的功能 使用R進行腫瘤細胞系百科全書數(shù)據(jù)庫(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)的數(shù)據(jù)下載,獲取特定的卵巢腫瘤矩陣數(shù)據(jù)并進行GO功能的富集,結(jié)果顯示PARP1主要參與RNA剪切、DNA損傷修復(fù)等功能(圖1)。

圖1 CCLE數(shù)據(jù)庫中PARP1的功能富集

2.2 數(shù)據(jù)庫分析PARP1在上皮性卵巢癌中的表達使用基因表達譜數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)分析PARP1在不同腫瘤中的表達水平。結(jié)果顯示,PARP1在乳腺癌、淋巴瘤、食道癌、卵巢癌等組織中的表達高于相應(yīng)的正常組織(圖2A)。新加坡癌癥科學(xué)研究所卵巢癌數(shù)據(jù)庫(ovarian cancer database of Cancer Science Institute Singapore,CSIOVDB)進一步分析顯示,上皮性卵巢癌多種腫瘤組織學(xué)類型中,漿液性癌和內(nèi)膜樣癌中的 PARP1表達高于其他類型(圖2B)。

圖2 數(shù)據(jù)庫分析PARP1表達

2.3 PARP1在上皮性卵巢癌和正常卵巢組織中的表達差異 使用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫分析PARP1在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達差異,PARP1在卵巢癌中的表達高于正常卵巢組織(圖3A),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 數(shù)據(jù)庫分析PARP1在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達差異

2.4 PARP1在臨床樣本中的表達差異 臨床組織學(xué)樣本顯示,PARP1主要表達在細胞核,染色陽性為核呈黃色或黃褐色,高級別漿液性卵巢癌中PARP1高表達,而正常卵巢組織中PARP1不表達或弱表達(圖4A-D)。

2.5 數(shù)據(jù)庫分析PARP1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 CSIOVDB在線數(shù)據(jù)庫分析顯示:G1、G2、G3級卵巢癌中 PARP1表達分別為 8.553、8.910、9.012,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖4A)。不同分期卵巢癌中 PARP1表達分別為8.737、8.956、8.986和 8.934,其中 I、II、III 期卵巢癌中的 PARP1表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),III、IV期卵巢癌中PARP1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B)?；熌退帍?fù)發(fā)組中PARP1表達高于PARP1耐藥組及PARP1敏感組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖4C)。KM plotter在線數(shù)據(jù)庫顯示,PARP1高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān),PARP1高表達與患者的總生存率無關(guān)(P=0.11)(圖4D),但患者的無進展生存期(progression-free-survival,PFS)明顯縮短(P=0.0042)(圖4E),PARP1低表達組患者較高表達組患者,具有更好的總生存期(overall survival,OS)(P=0.025)(圖4F)。

圖4 PARP1在正常卵巢組織及卵巢癌組織中的表達情況

2.6 臨床組織學(xué)樣本分析PARP1表達與病理學(xué)特征之間的關(guān)系 上皮性卵巢癌患者中PARP1表達量與患者的年齡、分期、腹水等臨床特征無顯著相關(guān)(P均＞0.05),與患者的生存有顯著相關(guān)性(P=0.029)(表1)。

表1 PARP1分組患者基本特征

圖5 數(shù)據(jù)庫分析PARP1表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討 論

卵巢癌早期臨床表現(xiàn)隱匿,發(fā)現(xiàn)時多處于晚期,晚期5年生存率低于30%,死亡率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中居首位[8]。鑒于傳統(tǒng)治療手段效果有限,因此尋找具有診斷、預(yù)后和預(yù)測潛力的診斷標記物及新治療靶點成為現(xiàn)階段的研究熱點。目前,針對靶向藥物的臨床前研究及臨床試驗取得了較好的進展,提示各種新型靶向藥物的分析與研究將成為卵巢癌的研究熱點,具有重要的臨床意義與科研價值。

目前已有許多PARP抑制劑獲得美國食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)的批準用于臨床,如奧拉帕利、盧卡帕利、尼拉帕利等,還有其他一些PARP抑制劑正處于臨床實驗階段[9]。其中,奧拉帕利和尼拉帕利是目前研究最廣泛的口服小分子PARP1/2抑制劑。2014年歐洲藥品管理局(European Medicines Agency,EMA)批準奧拉帕利用于鉑敏感復(fù)發(fā)BRCA突變卵巢癌的維持治療,同時被美國批準用于治療既往接受過三線或三線以上鉑類化療復(fù)發(fā)的BRCA突變晚期卵巢癌[10]。2017年FDA批準尼拉帕利用于復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌、輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌的維持治療[11]。PARP抑制劑在腫瘤治療中已經(jīng)取得了相當大的進展,但在臨床治療過程中仍有部分患者存在原發(fā)耐藥等問題[12]。研究發(fā)現(xiàn),PARP1在乳腺癌耐藥細胞中的表達低于敏感細胞,這表明PARP1蛋白的表達水平可能具有治療相關(guān)性[13]。對PARP抑制劑治療的劑量依賴性臨床反應(yīng)表明,腫瘤細胞中PARP1表達量可能反應(yīng)PARP1抑制劑的治療效果[14]。Domagala等[15]在有關(guān)PARP1與乳腺癌的研究中指出,高表達PARP1的三陰性乳腺癌較低表達PARP1者可能更適應(yīng)用PARP抑制劑。因此腫瘤中PARP1表達水平將有助于預(yù)測患者對PARPi治療的敏感性,實現(xiàn)更加精準的靶向治療,從而起到預(yù)測和提高患者預(yù)后的作用。

PARP1是存在于真核細胞細胞核的DNA損傷修復(fù)酶,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)退行性疾病及自身免疫性疾病等多個過程[16-17]。乳腺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中PARP1表達高于正常組織,且PARP1表達與腫瘤的分期及患者的不良預(yù)后也有顯著的關(guān)系[18-19]。研究表明,PARP1可作用于Snail的啟動子,參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)過程,從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。PARP1還可與轉(zhuǎn)錄因子相互作用,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達,從而促進腫瘤血管的生成[21]。此外,有研究表明PARP1參與免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié),抑制PARP1靶點可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性,增加腫瘤的突變負荷[22]。當前的研究顯示,PARP1作為關(guān)鍵的DNA損傷修復(fù)酶,在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,并在卵巢癌的治療研究中顯示了良好的應(yīng)用前景。除PARP1的酶活性之外,PARP1自身的表達可能也是潛在的卵巢癌治療與預(yù)測靶點。

本研究發(fā)現(xiàn),PARP1作為一種聚腺苷二磷酸核糖聚合酶,主要參與RNA剪接、DNA損傷修復(fù)等多種生理學(xué)過程。PARP1在多種腫瘤組織中高表達,而在卵巢癌中,內(nèi)膜樣癌和漿液性癌中PARP1表達高于其他組織學(xué)類型。數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),PARP1在卵巢癌組織中的表達高于正常卵巢組織,在臨床組織學(xué)樣本中也驗證了該結(jié)果。PARP1在卵巢癌中的表達與分級呈正相關(guān)(P＜0.05),而與卵巢癌的分期無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。此外,數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)PARP1高表達可能參與化療耐藥及化療耐藥后復(fù)發(fā),且PARP1高表達與患者的PFS相關(guān)(P=0.0042)。臨床組織學(xué)樣本發(fā)現(xiàn),PARP1的高表達與更低的總體生存率相關(guān)(P=0.025),而與其他的臨床病理特征無明顯的相關(guān)性。本研究存在一些局限性,如用于驗證研究結(jié)果的臨床病理組織切片樣本量較少,導(dǎo)致一些臨床數(shù)據(jù)的偏倚,有待進一步擴大臨床數(shù)據(jù)量,對研究結(jié)果進一步驗證。

綜上所述,卵巢癌組織中PARP1表達水平較正常卵巢組織明顯升高,高表達水平的PARP1與卵巢癌的化療耐藥、復(fù)發(fā)及患者的不良預(yù)后相關(guān),提示PARP1可能具備作為卵巢癌常規(guī)篩查標記物的潛在價值。本研究僅檢測了PARP1蛋白在卵巢癌組織中的異常表達,且臨床樣本有限,其與卵巢癌發(fā)生發(fā)展及化療耐藥的相關(guān)性,仍需多中心、大樣本及體內(nèi)外基礎(chǔ)實驗來進行更深層次的研究。