楊 旎,陳 飛,孔令華,霍 霄,沈 鏗

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科,北京 100730)

宮頸癌發(fā)病率居全球女性癌癥發(fā)病率第二位[1],中國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位[2]。近年來,世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)將宮頸癌預防作為優(yōu)先事項[3],其病死率明顯下降,但資源匱乏地區(qū)由于缺乏合適的篩查計劃,仍然面臨極大的負擔。因此,HPV的免疫,篩查和治療宮頸癌仍至關重要[4]。目前臨床使用的篩查手段并不完美,高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,hrHPV)檢測誤診率高,許多婦女接受了不必要的檢查與治療;細胞學篩查準確性低、結(jié)果可重復性差、醫(yī)生工作負荷過重。多項研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后與腫瘤抑制基因p16和增殖細胞核抗原Ki-67有關[5]。Schmidt等[6]發(fā)現(xiàn),若在一個細胞中同時檢測到p16和Ki-67共表達,則高度提示有宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變的存在,是近年來一種較新的宮頸病變檢測手段。宮頸癌或癌前病變的細胞發(fā)生形態(tài)學改變通常較晚,在不依賴于細胞形態(tài),結(jié)合細胞學p16/Ki-67雙染檢測,可提高宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)2+的檢出率,減少創(chuàng)傷性檢查。本文比較了細胞學p16/Ki-67雙染檢測和hrHPV檢測對ASCUS患者的分流作用與診斷效能,判斷p16/Ki-67雙染作為生物標記物在病理診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例與標本 收集2019年4月1日到2019年5月30日在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收治的52例細胞學診斷為無明確意義的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undermined significance,ASCUS),同時行hrHPV檢測,并有宮頸組織病理學檢查結(jié)果的患者信息,將其剩余宮頸上皮脫落細胞標本進行p16/Ki-67免疫細胞化學雙染檢測。收集2017年3月1日至2019年3月1日在北京協(xié)和醫(yī)院進行陰道鏡、錐切或全子宮切除的153例宮頸組織學標本,進行p16/Ki-67組織學雙染檢測,由2名病理學家進行判讀及評分。從病歷系統(tǒng)獲取患者病史及隨診信息。納入標準:年齡大于20歲;有性生活史,未妊娠;無子宮頸切除術史;細胞學雙染組患者經(jīng)液基細胞學檢查(liquid-based cytology test,LCT)確診為ASCUS,遵循TBS診斷標準[7]。排除標準:妊娠期或哺乳期婦女;參與其他臨床研究者。本研究已獲得倫理委員會審查。

1.2 實驗方法 細胞學雙染:宮頸細胞學采用Thinprep(Hologic公司,Massachusetts,USA)液基薄片法,hrHPV檢測采用Cobas4800檢測系統(tǒng)(Roche診斷產(chǎn)品公司,Newjersey,USA)。將收集的宮頸脫落細胞剩余標本在BD Sure Path載玻片上制備一張薄片,采用全自動免疫組化分析儀(型號為Benchmark GX)進行染色(Roche診斷產(chǎn)品公司,Newjersey,USA),試劑盒為Roche診斷產(chǎn)品公司的配套試劑CINtec PLUS。組織學雙染:將組織蠟塊制片,采用全自動免疫組化分析儀進行染色(Roche診斷產(chǎn)品公司,Newjersey,USA),試劑盒為Roche診斷產(chǎn)品公司的配套試劑p16/Ki-67組織學雙染試劑。整個操作過程嚴格按說明書進行。

1.3 診斷標準 細胞學雙染:p16定位于胞質(zhì),顯棕色;Ki-67定位于胞核,顯紅色。當滿足1個細胞質(zhì)顯棕色(p16),同時胞核顯紅色(Ki-67),則結(jié)果為雙染陽性,無需考慮細胞形態(tài),單獨顯色或不顯色為陰性[8]。細胞學檢查采取巴氏染色法,遵循TBS診斷標準[7]。組織學雙染:使用2019美國陰道鏡檢查與宮頸病理學會(ASCCP)宮頸病理指南為診斷標準,結(jié)合相應的HE染色結(jié)果,由2名病理醫(yī)生在不了解患者病歷信息情況下進行閱片,根據(jù)表1的評分系統(tǒng)[9],將組織學雙染片進行評分。

表1 組織學雙染評分系統(tǒng)

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件包。計數(shù)資料采用χ2檢驗。計量資料比較采用方差分析。計算p16/Ki-67雙染檢測及hrHPV檢測方法的靈敏度、特異度、總符合率、陽性預測值、陰性預測值及Kappa系數(shù)。α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 細胞學雙染 根據(jù)《WHO女性生殖器官腫瘤學分類(第4版)解讀》[10],CIN被分為低級別上皮內(nèi)瘤變(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)和高級別上皮內(nèi)瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia,HSIL)?！吨袊訉m頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識(二)》[11]指出,CIN2中的p16/Ki-67雙染陰性的患者仍歸為LSIL。為與臨床相統(tǒng)一,本部分仍把HSIL分為CIN2和CIN3,進一步觀察p16/Ki-67雙染與hrHPV檢測對ASCUS患者的診斷效能。52例細胞學診斷為ASCUS的患者,其中組織病理金標準診斷結(jié)果正?；颊?2例,CIN1患者9例,CIN2患者3例,CIN3患者5例,宮頸癌患者3例。不同病變程度患者hrHPV和p16/KI-67雙染陽性率的比較,見表2。p16/Ki-67雙染的陽性率與病變程度大致呈正比,特別是在正常和LSIL患者中,p16/Ki-67雙染比hrHPV檢測符合度更高(P=0.6963)。

表2 不同病變程度hrHPV、p16/Ki-67雙染陽性率

若以hrHPV陽性或p16/Ki-67雙染陽性作為ASCUS患者的陰道鏡分流標準,兩者分別會使42例(80.8%),27例(51.9%)患者轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查,p16/Ki-67雙染可減少28.9%的陰道鏡分流。分別計算hrHPV和p16/Ki-67雙染在檢出CIN2+的診斷效能,見表3。兩者的靈敏度均為90.91%,但p16/Ki-67雙染檢出CIN2+的特異度、總體符合率、陽性預測值、陰性預測值和Kappa系數(shù)均優(yōu)于hrHPV檢測。

表3 CIN2+患者hrHPV,p16/Ki-67雙染診斷效能的比較

2.2 組織學雙染 153例患者中,病理診斷結(jié)果正?；颊?例,LSIL患者46例,HSIL患者59例,宮頸微小浸潤癌(microinvasive carcinoma,MIC)患者38例,宮頸癌患者2例。p16/Ki-67雙染的陽性率與病變程度大致成正比,見表4。

表4 組織學雙染評分結(jié)果

3 討 論

近年來hrHPV檢測在宮頸癌篩查中所占的角色越來越重要,已被一些國家作為初篩手段納入宮頸癌篩查體系,但超過90%的HPV感染可自然消退[12]。同時,病理細胞學醫(yī)生缺乏,診斷結(jié)果可重復性差,制片質(zhì)控參差不齊,也限制了其發(fā)展。p16/Ki-67雙染檢測操作簡單、系統(tǒng),無內(nèi)源性生物素干擾,易于觀察,其原理依據(jù)為p16蛋白是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,其過表達提示細胞處于細胞周期的阻滯期。Ki-67反映細胞周期進展及增殖活躍,其陽性提示宮頸細胞處于細胞周期的增殖期。正常生理狀態(tài)下,p16和Ki-67的表達相互制約,達到一種動態(tài)平衡的狀態(tài),不會同時出現(xiàn)在同一個細胞中,二者共表達提示細胞周期調(diào)控失調(diào)[13]。本研究結(jié)果進一步驗證p16/Ki-67雙染有助于識別病變細胞。

hrHPV陽性是臨床上常見的篩查異常結(jié)果,結(jié)合細胞學結(jié)果許多患者的處理流程是轉(zhuǎn)診陰道鏡。Liu等[14]研究表明,平均隨訪2年,僅有2.4%細胞學陰性且 hrHPV陽性患者進展為 CIN2。Yang等[15]研究細胞學陰性且hrHPV陽性患者3年CIN3+累積風險為6.8%,由此可見,以hrHPV陽性作為宮頸癌篩查方法或分流手段會造成過高的陰道鏡轉(zhuǎn)診率,造成了大量的醫(yī)療資源浪費。本研究結(jié)果顯示,p16/Ki-67雙染的陽性率與病變程度大致呈正比,特別是在CIN2-的患者中,比hrHPV檢測結(jié)果符合度更高,降低假陽性率,使患者避免不必要的有創(chuàng)檢查或治療。本研究結(jié)果顯示,hrHPV和p16/Ki-67雙染對檢出CIN2+的敏感性相同,但p16/Ki-67雙染誤診率低,與病理金標準符合率更高,結(jié)果與Peeters等[16]薈萃分析結(jié)果相符;并且,p16/Ki-67雙染讀片簡單易行,對單純細胞學讀片也有輔助作用,對于醫(yī)療資源不發(fā)達、設施不完善的貧困偏遠地區(qū)的宮頸癌篩查推進有十分重要的意義。

本研究比較了不同組織病變程度下組織學p16/Ki-67雙染結(jié)果,并進行了評分,以探討p16/Ki-67雙染在判斷宮頸癌前病變患者轉(zhuǎn)歸方面的作用,以及p16/Ki-67雙染是否可作為宮頸病變病理診斷輔助生物標記物。本研究發(fā)現(xiàn),p16/Ki-67雙染陰性患者的病理結(jié)果優(yōu)于雙染陽性的患者。本研究顯示,p16/Ki-67雙染與病理金標準有很好的符合度,其隨著病變程度加重雙染陽性率升高。因此,對于p16/Ki-67雙染陽性的患者,臨床上應重點關注,注意運用多學科進行排查,密切隨訪,及時預測和發(fā)現(xiàn)HSIL等病變,做到早診斷、早治療。

p16/Ki-67雙染全部染色過程在全自動免疫組化儀內(nèi)進行,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠,無需占用醫(yī)生工作時間,可提高工作效率,縮短病理報告發(fā)放周期。雖然p16/Ki-67雙染有著較好的病變符合率,提高了CIN2+病變的檢出率,但仍存在一定的漏診和誤診,這可能由于實驗過程中制片質(zhì)量與方法不穩(wěn)定,使雙染片中存在細胞稀疏或成團,從而影響判讀結(jié)果;同時因為閱片經(jīng)驗不足,可能導致誤判。為提高制片質(zhì)量,可從以下幾個方面進行改進:(1)制片前去除標本中的血液黏液,使背景更清晰。(2)宮頸細胞存放在液基細胞保存液中不宜超過6周,以防止抗原丟失。(3)雙染實驗應在干燥液基細胞學玻片制備好后3天內(nèi)進行。(4)注意試劑保質(zhì)期極儀器定期維護。

綜上所述,p16/Ki-67雙染可提高CIN2+的診斷效能,其作為一種宮頸篩查分流手段,可有效減少陰道鏡轉(zhuǎn)診率,同時具有簡便易重復、客觀高效等優(yōu)點。p16/Ki-67雙染作為一種生物學標記物,與組織病理學有很好的符合度,可輔助病理診斷以及對臨床轉(zhuǎn)歸的判斷。