國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心生物樣本庫(kù)專家組

生物樣本作為基礎(chǔ)及臨床研究的寶貴資源，對(duì)推進(jìn)臨床診療能力、提高精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究水平都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。我國(guó)呼吸系統(tǒng)疾病生物資源庫(kù)建設(shè)尚處于初級(jí)階段，普遍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化操作流程[2]。除通用樣本，例如血液、尿液、手術(shù)病理組織外，呼吸系統(tǒng)疾病特有樣本還包括痰液（包括誘導(dǎo)痰）、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、咽拭子浸液、支氣管黏膜活檢組織以及針刺活檢組織等。同時(shí)，還應(yīng)注意感染性疾病樣本具有傳染性。因此，樣本采集和保藏時(shí)應(yīng)區(qū)別對(duì)待，并遵循相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。本文重點(diǎn)闡述呼吸系統(tǒng)疾病生物樣本采集、保藏、管理技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)程。

1 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

生物樣本采集保藏應(yīng)遵循的流程[3]：①知情同意。②登記臨床信息，打印條碼。③采集樣本。④入庫(kù)前處理。⑤入庫(kù)登記。⑥入庫(kù)儲(chǔ)存。⑦管理、質(zhì)控。⑧申請(qǐng)出庫(kù)、科學(xué)研究。

1.1 血液樣本采集和保藏

1.1.1 準(zhǔn)備

運(yùn)輸箱、采血針，真空采血管。常用采血容器用途見(jiàn)表1。

表1 常用采血管用途

1.1.2 采集

抗凝管、非抗凝管各1 管（5 mL）。

1.1.3 處理

1.1.3.1 血漿 ①分離：離心力815 g，10 min，4℃。②提取：取上清液。③二次離心：離心力2500 g，10 min，4℃。④分裝：取上清液[4]。

1.1.3.2 血清 ①凝血：30 min，室溫。②離心：離心力1500 g，10 min，4℃。③分裝：取上清液[4]。

1.1.3.3 血凝塊 ①分離：分離血清。②混勻：無(wú)菌玻璃棒混勻。③分裝：2 支凍存管（血凝塊體積1 cm3）[5]。

1.1.3.4 白細(xì)胞 ①分離：a）預(yù)熱：淋巴細(xì)胞分離液、RPMI1640 培養(yǎng)液至室溫。b）提取：加入RPMI1640（1∶1）。c）鋪血：加入淋巴細(xì)胞分離液（3 mL）。d）離心：離心力450 g，30 min，室溫。e）吸取：白膜至5 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）離心管。f）離心和洗滌：離心力450 g，1 min，室溫；棄上清液，加入5 mL PBS 再次洗滌、離心。②程控降溫儀處理：a）混勻：棄上清液，加凍存劑保護(hù)液3 mL。b）分裝：3 支凍存管中（每支1 mL）。c）降溫：每分鐘降1℃，直至-80℃?；騌NAlater 處理：a）混勻：棄上清液，加入3 mL RNAlater。b）分裝：3 支凍存管中（每支1 mL）。c）過(guò)夜：置4℃冰箱。見(jiàn)圖1。③注意事項(xiàng)：a）處理時(shí)間＜1 h。b）離心機(jī)自然降速。c）無(wú)菌操作。d）凍存劑保護(hù)液預(yù)先配置并冷凍，后續(xù)置于冰上操作[6]。

圖1 白細(xì)胞處理流程圖

1.1.4 保藏

①全血：-80℃。②血清、血漿：液氮?dú)庀嗷?80℃。③血凝塊：-80℃。④白細(xì)胞：-80℃[6]。血液標(biāo)本采集和保藏流程見(jiàn)圖2。

圖2 血液標(biāo)本采集及保藏流程圖

1.2 尿液樣本收集和保藏

1.2.1 準(zhǔn)備

清潔外陰；使用合格容器。

1.2.2 收集

按要求收取樣本[7]（表2），具體流程見(jiàn)圖3。

表2 常用尿液樣本種類

圖3 尿液樣本采集和保藏

1.2.3 處理

立即送檢，不能立即可置于2～8℃保存。

1.2.4 保藏

①短期：4℃冰箱。②長(zhǎng)期：含防腐劑容器，-20℃冰箱[8]。防腐劑添加見(jiàn)表3。

表3 尿液樣本防腐劑添加

1.2.5 注意事項(xiàng)

①晨尿?yàn)橐?。②嬰幼兒可用黏附劑收集袋。③容器材質(zhì)透明、穩(wěn)定。④注明標(biāo)記。⑤避免污染。⑥運(yùn)輸、保藏需避光。

1.3 痰液樣本采集和保藏

1.3.1 準(zhǔn)備和采集

①詢問(wèn)癥狀及肺功能。②沙丁胺醇?xì)忪F劑：適用于一秒用力呼氣容積（FEV1）60%～80%，且無(wú)氣促者，霧化前10 min，400 μg。③高滲鹽水霧化：?jiǎn)我粷舛确ǎ?%或4.5%）或梯度濃度法（3%、4%、5%）；霧化10 min后漱口、擤鼻、咳嗽；FEV1＜60%或存在氣促無(wú)需霧化[9]。

1.3.2 處理

1.3.2.1 痰上清液 ①采集：痰栓。②稱重。③孵育：加入8 體積杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）。④渦旋：15 s，冰上孵育15 min。⑤離心：790 g，4℃，10 min。⑥分裝：取上清液，等分。

1.3.2.2 細(xì)胞涂片 ①采集并稱重。②孵育：加入4 體積的0.1%二硫蘇糖醇，渦旋15 s，冰上孵育15 min。③過(guò)濾：300 目濾布。④灌板計(jì)數(shù)：臺(tái)盼藍(lán)染色方法計(jì)數(shù)。⑤離心：790 g，4℃，10 min。⑥制片：涂片2 張，室溫風(fēng)干，甲醛固定。

1.3.2.3 細(xì)胞團(tuán)塊 ①混合：細(xì)胞懸液1 mL 轉(zhuǎn)移至含2 mL 核糖核酸酶微量離心管。②離心：400 g，4℃，5 min，棄上清液。③懸浮：500 μL RNAlater 細(xì)胞試劑懸浮細(xì)胞團(tuán)塊[9]。

1.3.3 轉(zhuǎn)運(yùn)及保藏

①痰上清液、細(xì)胞團(tuán)塊：“干冰”低溫運(yùn)送，-80℃下儲(chǔ)存。②細(xì)胞涂片或細(xì)胞離心涂片：室溫下運(yùn)送、儲(chǔ)存。見(jiàn)圖4。

圖4 誘導(dǎo)痰/痰留取、處理、保藏流程圖

1.3.4 注意事項(xiàng)

如未能及時(shí)處理，樣本置于4℃，放置時(shí)間＜2 h。

1.4 組織病理（含支氣管黏膜及TBNA）樣本采集和保藏

1.4.1 組織樣本處理

1.4.1.1 準(zhǔn)備及采集 ①清洗。②取材：病變及對(duì)照組織。③切割：根據(jù)需要，選擇快速冰凍、RNAlater 保存、石蠟包埋和最佳切割溫度（OCT）包埋等中一至數(shù)種。④記錄：病理診斷和處理方法。

1.4.1.2 處理方法 ①快速冰凍：處理流程參見(jiàn)《組織樣本快速冰凍》[10]。②RNAlater 處理：處理流程參見(jiàn)《組織樣本RNAlater 處理》[10]。③OCT 包埋：處理流程參見(jiàn)《組織樣本OCT 包埋及冰凍切片制作》[10]。④石蠟包埋：處理流程參見(jiàn)《組織樣本石蠟包埋及石蠟切片》[10]。

1.4.2 組織樣本保藏

①快速冰凍：凍存管，液氮?dú)庀喹h(huán)境。②OCT 包埋：凍存管，-80℃。③冰凍切片：切片盒，-20℃。④石蠟包埋：干燥、室溫。⑤石蠟切片：切片盒，干燥、室溫[10]。采集與儲(chǔ)存流程見(jiàn)圖5。

圖5 組織病理樣本采集和保藏流程

1.5 BALF 樣本采集和保藏

1.5.1 準(zhǔn)備

①評(píng)估操作風(fēng)險(xiǎn)。②預(yù)熱灌洗液（蒸餾滅菌水，37℃）。③樣本罐置于冰上。

1.5.2 采集

①部位：病變段，彌漫性病變選擇右肺中葉或左上肺舌段。②灌洗量：每次25～50 mL，總量60～120 mL。③回收：50～100 mmHg 負(fù)壓吸引，回收率≥30%。④過(guò)濾：回收液置于冰上。雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾，裝入滅菌容器，記錄總量[11]。操作流程見(jiàn)圖6。

圖6 肺泡灌洗液留取、處理、保藏流程圖

1.5.3 處理

1.5.3.1 BALF 上清 ①轉(zhuǎn)移：10～15 mL 至離心管，剩余液體轉(zhuǎn)移至50 mL 管。②離心：1000 g，4℃，5 min。③提取：留取上清液。④儲(chǔ)存：保留為10×1 mL 等份和1×50 mL，標(biāo)注。

1.5.3.2 沉渣涂片 ①提?。弘x心所得細(xì)胞沉淀。②混勻：添加生理鹽水，混勻。③離心：轉(zhuǎn)移60 μL 細(xì)胞懸液至4 個(gè)細(xì)胞離心涂片機(jī)每一個(gè)的漏斗，1000 g，5 min，4℃。④調(diào)整：顯微鏡下調(diào)整濃度。⑤制片：染色2 片；另外2 玻片完成第一步固定。使用Shandon 差異-快速試劑盒[11]。

1.5.4 保藏

①上清液：-80℃。②細(xì)胞涂片或離心涂片：室溫[12]。

1.5.5 注意事項(xiàng)

①內(nèi)鏡頂端緊密楔入支氣管開(kāi)口。②麻醉充分。③無(wú)菌操作。④大氣道病變，第一管回收液?jiǎn)为?dú)處理，非大氣道疾病可混合后分送。

1.6 胸腔積液樣本采集和保藏

1.6.1 采集

按診療常規(guī)胸腔穿刺留取[13]。

1.6.2 處理

①第一管微生物培養(yǎng)，第二管常規(guī)檢查，第三管生化檢查，第四、五管樣本儲(chǔ)存。②如不能送檢可加入乙醇固定，病理和細(xì)胞學(xué)檢查采用EDTA 鹽抗凝，化學(xué)檢查采用肝素抗凝。③無(wú)菌操作[14]。

1.6.3 保藏

①-40℃或-80℃冰箱。②凍融后不能再次入庫(kù)。③每3 個(gè)月抽樣檢測(cè)[14]。采集與儲(chǔ)存流程見(jiàn)圖7。

圖7 胸腔積液留取、處理、保藏流程圖

1.7 鼻咽拭子樣本采集及保藏

1.7.1 準(zhǔn)備

評(píng)估口鼻咽或口咽部情況。

1.7.2 采集

1.7.2.1 咽拭子 無(wú)菌拭子左右兩面及拭子頭部刮取扁桃腺兩側(cè)及咽后壁的分泌物[15]。

1.7.2.2 鼻拭子 無(wú)菌拭子以垂直面部的方向輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留15～30 s，輕輕旋轉(zhuǎn)3 次，緩慢退出[16]。

1.7.3 處理

①拭子頭部折斷后置于裝有病毒運(yùn)送液的螺口塑料試管。②試管口及棉簽塞火焰上消毒后旋緊。③搖動(dòng)試管，混勻。

1.7.4 轉(zhuǎn)運(yùn)

4℃環(huán)境。

1.7.5 保藏

①儲(chǔ)存＜48 h：4℃冰箱。②儲(chǔ)存＞48 h：-70～-80℃冰箱。

1.7.6 注意事項(xiàng)

①進(jìn)食2 h 內(nèi)勿采集。②樣本容器無(wú)菌、干燥。③真菌培養(yǎng)須采集潰瘍表面分泌物。

1.8 唾液樣本采集及保藏

1.8.1 準(zhǔn)備

①禁食1 h。②清水漱口。③漱口后等待10 min。④牙齦或口腔出血不宜留取。

1.8.2 采集

1.8.2.1 混合性唾液 ①棄去最初唾液，留取后續(xù)唾液2 mL。②舌下放置干燥脫脂紗布，10 min 后取出，擠出唾液備用[17]。③商業(yè)用唾液收集管（遵循相關(guān)說(shuō)明書）。

1.8.2.2 單一腺體唾液 ①腮腺唾液：口腔科醫(yī)生采集。②頜下腺唾液：塑料吸盤固定于舌下腺區(qū)收集[17]。

1.8.3 處理

①-20℃冰箱。②4℃環(huán)境中≤2 h。

1.8.4 保藏

＞6 個(gè)月，-80℃[17]。

1.9 高致病性樣本采集和保藏

1.9.1 樣本采集

①呼吸道：72 h 內(nèi)采集。②血液：急性期盡快收集，恢復(fù)期在發(fā)熱后3 周內(nèi)收集。③尿液：置于無(wú)菌密閉容器，安全加蓋并封以石蠟。④胸腔積液：置于無(wú)菌塑料螺口管。⑤肺組織活檢：在超聲或X 線定位下，經(jīng)皮穿刺取肺組織活檢樣本，置于含3 mL 采樣液的塑料螺口管中。

1.9.2 樣本包裝

①生物安全Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝成一式三份：一份當(dāng)?shù)貦z測(cè)用，一份送第三方檢測(cè)，一份儲(chǔ)存以備復(fù)核[18]。②每件塑料袋密封一份樣本。③填寫“疑似人感染高致病性疾病/不明原因肺部感染樣本送檢單”，用塑料袋密封。④注意事項(xiàng)：a）收集容器帶螺旋蓋，內(nèi)有墊圈、耐冷凍，密封性好。b）樣本外泄需立刻用消毒毛巾擦拭，后用安爾碘消毒液反復(fù)擦拭5 遍以上。c）采集者需Ⅱ級(jí)以上防護(hù)；如防護(hù)用品受污染，應(yīng)立即更換。d）所有樣本均需注明姓名、床號(hào)、ID 號(hào)及收集日期。e）長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)需4℃保存。f）一次性采集器械用后即焚燒銷毀[19]。

1.9.3 樣本保藏

①24 h 內(nèi)置于4℃保存；24 h 內(nèi)無(wú)法檢測(cè)置于-70℃或以下儲(chǔ)存；如無(wú)-70℃儲(chǔ)存條件，則于-20℃儲(chǔ)存。②血清4℃保存3 d、-20℃以下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。③儲(chǔ)存地點(diǎn)應(yīng)符合傳染病規(guī)范，設(shè)立專庫(kù)或?qū)９駟为?dú)儲(chǔ)存[20]。采集及保藏流程見(jiàn)圖8。

圖8 高致病性樣本留取、處理、保藏流程圖

2 樣本入庫(kù)管理規(guī)程

2.1 目的

規(guī)范儲(chǔ)存管理，保證儲(chǔ)存質(zhì)量。

2.2 適用范圍

長(zhǎng)期儲(chǔ)存樣本。

2.3 人員職責(zé)

負(fù)責(zé)樣本入庫(kù)，對(duì)儲(chǔ)存容器和設(shè)備進(jìn)行監(jiān)督管理。

2.4 設(shè)備要求

①室內(nèi)溫度、濕度。②氧含量監(jiān)測(cè)報(bào)警裝置。③照明調(diào)節(jié)設(shè)施。④消防設(shè)施。⑤應(yīng)急電路。⑥門禁系統(tǒng)。⑦緊急處置預(yù)案。⑧緊急聯(lián)系人名單[21]。

2.5 入庫(kù)任務(wù)

①樣本質(zhì)量控制。②確保樣本位置唯一性和可溯源性。③實(shí)時(shí)反映樣本位置信息。

3 在庫(kù)樣本管理和質(zhì)量控制

3.1 目的

正確、安全地儲(chǔ)存樣本。

3.2 適用范圍

保證樣本儲(chǔ)存質(zhì)量，確保樣本儲(chǔ)存位置正確。

3.3 人員職責(zé)

核實(shí)庫(kù)存，確保信息正確。

3.4 庫(kù)存核實(shí)

①至少一年一次。②隨機(jī)選取至少1‰新入庫(kù)樣本量。③安全儲(chǔ)入控制措施。④安全防護(hù)措施。⑤避免樣本損耗。⑥核實(shí)后樣本歸位。⑦記錄結(jié)果。⑧更正錯(cuò)誤信息及數(shù)據(jù)。⑨記錄糾錯(cuò)措施，填寫分析報(bào)告[21]。

3.5 冷鏈系統(tǒng)管理和維護(hù)

冷鏈由基礎(chǔ)設(shè)施、儲(chǔ)存設(shè)備、凍存耗材、監(jiān)控設(shè)備等構(gòu)成[22]。

3.5.1 基礎(chǔ)設(shè)施

①冰箱與液氮設(shè)備分開(kāi)放置。②冰箱背靠墻，或間隔15 cm 以上背對(duì)背擺放。③配置備用電源。④重要樣本需備份，并分開(kāi)放置。

3.5.2 儲(chǔ)存設(shè)備

①-80℃儲(chǔ)存設(shè)備（超低溫冰箱）。②-140℃儲(chǔ)存設(shè)備（液氮?dú)庀啵盒鑲湟旱詣?dòng)檢測(cè)設(shè)備和自動(dòng)加注設(shè)備。③-196℃儲(chǔ)存設(shè)備（液相液氮罐和液氮儲(chǔ)存箱）。

3.5.3 監(jiān)控設(shè)備

包括冰箱溫度探頭、冰箱運(yùn)行溫度記錄，液氮容器液位監(jiān)控、遠(yuǎn)程報(bào)警、視頻監(jiān)控等。

3.5.4 凍存耗材

建議使用帶有螺紋密封的凍存管，外旋凍存管適用于超低溫冰箱，內(nèi)旋凍存管適用于液氮?dú)庀嗷蛏罾浔洹?/p>

4 樣本出庫(kù)管理規(guī)程

4.1 目的

確保樣本及其信息的出庫(kù)符合規(guī)定。

4.2 需用材料

液氮、干冰、樣本盒、手套。

4.3 參與人員

資源庫(kù)技術(shù)員、管理員、樣本用戶。

4.4 所需條件

①提交申請(qǐng)。②審核批復(fù)。③簽署協(xié)議。④信息跟蹤。⑤信息隱私化。

4.5 審批程序

①申請(qǐng)方提出申請(qǐng)，管理方登記“發(fā)放單”。②申請(qǐng)批準(zhǔn)后，管理方批準(zhǔn)“發(fā)放單”。③管理方查詢樣本加入“發(fā)放單”。④管理方移交樣本。⑤申請(qǐng)方簽收，管理方確認(rèn)“發(fā)放單”。

5 樣本運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

5.1 樣本運(yùn)輸程序

發(fā)貨方與收貨方書面確認(rèn)：①發(fā)貨通知單。②發(fā)貨清單。③物流跟蹤。④收樣確認(rèn)。⑤審查包裝測(cè)試報(bào)告。⑥送樣測(cè)試。

5.2 樣本運(yùn)輸條件

5.2.1 法規(guī)要求

①符合國(guó)際、國(guó)內(nèi)法規(guī)。②參與運(yùn)送員工具備資質(zhì)。

5.2.2 環(huán)境要求

①溫度要求：a）20～30℃：隔熱包裝。b）2～8℃：冰塊或凝膠袋（-15℃）。c）-20℃：冷凍凝膠袋（-20℃或-20℃以下）。d）-70℃：干冰顆粒、干冰塊、干冰片。包裝貼上危險(xiǎn)物品標(biāo)識(shí)符。e）≤-150℃：干燥液氮罐運(yùn)輸。②濕度要求：濕度敏感樣本，需加入干燥劑。③時(shí)間要求：交由具備資質(zhì)的快遞公司。④數(shù)量要求：分為多個(gè)小包裝運(yùn)輸，備充足冷凍劑[23]。

5.2.3 注意事項(xiàng)

①樣本置于冷凍劑間。②剩余空間用塑料泡沫填充。③清除殘留標(biāo)簽。④運(yùn)輸容器定期消毒。⑤空運(yùn)單不可重復(fù)使用。

5.3 國(guó)際運(yùn)輸

①了解接收國(guó)家法律、法規(guī)。②預(yù)估運(yùn)輸時(shí)間。③雇傭有資質(zhì)貨代公司或快遞公司。④遭遇延誤，可委托快遞公司補(bǔ)充冷凍劑。

6 樣本銷毀管理

包括生物樣本和相應(yīng)材料的銷毀，銷毀樣本符合法律法規(guī)要求[24]。

6.1 申請(qǐng)銷毀

①提出申請(qǐng)，附銷毀質(zhì)檢報(bào)告，第三方隨機(jī)抽檢復(fù)核。②申請(qǐng)批準(zhǔn)后，由第三方銷毀。

6.2 實(shí)施銷毀

①核對(duì)待銷毀樣本。②將樣本連同容器放入防生物危害銷毀袋，移交第三方。③記錄銷毀原因、批準(zhǔn)和執(zhí)行時(shí)間及執(zhí)行人員。④刪除樣本數(shù)據(jù)，保留知情同意撤銷申請(qǐng)和樣本銷毀記錄。

7 科學(xué)研究

樣本使用要做到資源共享，物盡其用；科學(xué)研究后樣本如有剩余，對(duì)于可反復(fù)使用的樣本，在確保未被污染及可再用情況下，應(yīng)運(yùn)回資源庫(kù)再次入庫(kù)；對(duì)于不可反復(fù)使用的樣本，不能再次入庫(kù)。

執(zhí)筆：丁永杰，羅文婷，李慶云，鄭勁平。

專家組成員（按姓氏拼音排列）：丁永杰（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸病研究所），顧文超（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院），郝創(chuàng)利（蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院），黃樹(shù)棟（陽(yáng)江市人民醫(yī)院），李國(guó)平（成都市第三人民醫(yī)院），李慶云（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸病研究所），李雪琴（山西晉城無(wú)煙煤礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司總醫(yī)院），劉恩梅（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院），劉光輝（武漢大學(xué)中南醫(yī)院），劉清華（梅州市人民醫(yī)院），盧震輝（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院），羅文婷（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心），邱晨（深圳市人民醫(yī)院），任蕾（上海市第四康復(fù)醫(yī)院），榮光生（合肥市第三人民醫(yī)院），孫云（銀川市婦幼保健院），田東波（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院），王琪（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院），魏春華（濰坊衛(wèi)恩醫(yī)院），魏立平（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院），余詠梅（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院），張宏（甘肅省人民醫(yī)院），張淇釧（汕頭市中心醫(yī)院），張蓉芳（甘肅省婦幼保健院），張玉焱（惠陽(yáng)三和醫(yī)院），趙冰融（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院），鄭勁平（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心），鄭智遠(yuǎn)（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院）。