秦 楓，潘孝青，邵 樂，翟 頻，楊 杰，張 霞，李 健，顧洪如*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

【研究意義】豬舍環(huán)境是養(yǎng)豬生產(chǎn)的制約因素之一，影響豬的正常生理行為。在規(guī)模化養(yǎng)殖環(huán)境下，豬經(jīng)常表現(xiàn)出咬尾、咬耳、拱腹等異常行為，嚴(yán)重影響豬生理健康，進(jìn)而造成生產(chǎn)損失。【前人研究進(jìn)展】隨著動(dòng)物福利重視程度的提高，自由舒適的養(yǎng)殖環(huán)境已引起國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注[1-3]，動(dòng)物福利已得到世界上100多個(gè)國家和地區(qū)的重視和發(fā)展[4]。為提高養(yǎng)殖福利，歐美等發(fā)達(dá)國家通過向傳統(tǒng)圈舍投放秸稈、干草、木屑、菌糠等農(nóng)作物的方式來營造富集環(huán)境[3]。發(fā)酵床養(yǎng)殖是新興的生態(tài)養(yǎng)豬模式，在母豬生產(chǎn)[5]、育肥豬生長[6-10]有很好的效果，且可提高斷奶仔豬平均日增重[11-12]，降低料肉比[6]。發(fā)酵床養(yǎng)殖可以為豬提供自由舒適的富集環(huán)境，被認(rèn)為是改善動(dòng)物福利的有效養(yǎng)殖模式[13-14]。研究表明，發(fā)酵床飼養(yǎng)可通過對(duì)豬舍內(nèi)環(huán)境和行為特征的影響，提高動(dòng)物福利[14-15]。發(fā)酵床飼養(yǎng)可增加仔豬或育肥豬的站立、運(yùn)動(dòng)、探究等行為[6,16]。發(fā)酵床養(yǎng)殖能滿足豬天性的釋放，提高豬生理健康，但對(duì)豬機(jī)體生理的變化研究較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)以60日齡蘇鐘豬為試驗(yàn)動(dòng)物，研究發(fā)酵床飼養(yǎng)對(duì)豬情緒相關(guān)物質(zhì)及抗抑郁因子P11基因mRNA表達(dá)的影響，探討豬機(jī)體生理的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】此研究結(jié)果為發(fā)酵床飼養(yǎng)改善動(dòng)物福利提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵床墊料制作

本試驗(yàn)2012 年6-9 月， 在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗(yàn)基地進(jìn)行。發(fā)酵床豬舍為經(jīng)濟(jì)型鋼管大棚結(jié)構(gòu)，頂部覆蓋聚乙烯遮陽網(wǎng)。發(fā)酵床為地下式發(fā)酵床，發(fā)酵池地面下挖70 cm，形成地下發(fā)酵池。于試驗(yàn)開始前14 d，以風(fēng)干重為基礎(chǔ)，將金針菇菌糠、木屑和稻殼按比例(3∶1∶1)放到發(fā)酵池中，均勻噴灑發(fā)酵菌劑(按比例稀釋)，翻耕調(diào)整水分(濕度約為55 %)，堆積發(fā)酵，當(dāng)溫度約為70 ℃時(shí)即平鋪墊料，厚度約為70 cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

選取日齡(60 ± 3)d、體重為(28.4 ± 0.30)kg的健康蘇鐘豬60頭，隨機(jī)分為水泥地面飼養(yǎng)組和發(fā)酵床飼養(yǎng)組，每組設(shè)3個(gè)飼喂欄(即3 個(gè)重復(fù))，每個(gè)重復(fù)分別為10頭，重復(fù)內(nèi)公母各占一半。育肥前期，水泥地面飼養(yǎng)組和發(fā)酵床飼養(yǎng)組飼養(yǎng)密度均為1.0 m2/頭。育肥后期，為避免因動(dòng)物糞尿排泄量的增加造成發(fā)酵床床體腐爛情況出現(xiàn)，在育肥前期結(jié)束后稱進(jìn)行1 次飼養(yǎng)密度調(diào)整，即調(diào)整為2.0 m2/頭，試驗(yàn)前統(tǒng)一驅(qū)蟲，試驗(yàn)期為90 d。試驗(yàn)日糧由上海新農(nóng)飼料股份有限公司提供(313 型、314 型育肥飼料)。發(fā)酵床飼養(yǎng)組日常管理主要是進(jìn)行墊料維護(hù)，將豬糞尿比較集中地方散開，每周墊料深耕1次(表層至30 cm)。水泥地面飼養(yǎng)組每天早上8：00 和下午16：00清糞1 次。試驗(yàn)期間，每天09：00 和16：00 人工投料1 次，自由采食和飲水，免疫程序均按常規(guī)進(jìn)行。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 唾液采集與測(cè)定 于試驗(yàn)結(jié)束前3 d，每個(gè)重復(fù)選擇3 頭進(jìn)行唾液采集(每組5公4母)。為避免動(dòng)物自身生理受晝夜節(jié)律變化的影響，采集于上午9：00-10：00 進(jìn)行[17]。具體采集方法：用柄長為30 cm 醫(yī)用棉簽于育肥豬口中充分咀嚼直至棉球完全潤濕，每頭豬2個(gè)棉簽，4 ℃離心(4000 r/min,10 min)，-20 ℃冰箱保存，待測(cè)。5-HT、β-EP、Ach、Cortisol按試劑盒(南京建成生物工程研究所)規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 血清指標(biāo)采集與測(cè)定 在育肥試驗(yàn)第45天(即肥育前期，豬體質(zhì)量為60 kg 左右)、第90天(即肥育后期，豬體質(zhì)量為90 kg 左右)采血，每組選取15 頭，采用注射器耳緣靜脈采血10 mL，離心機(jī)4000 r /min 離心10 min，分離血清，-20 ℃保存用于相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，5-HT、β-EP、Ach、Cortisol、Mg、Zn按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)期結(jié)束，每組選擇體重相近豬5頭，空腹24 h 后，進(jìn)行屠宰，采集腦部下丘腦，液氮保存，用于P11蛋白R(shí)T-PCR檢測(cè)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

Trizol 法提取樣品總RNA，樣品中RNA 濃度用紫外分光光度計(jì)(260 nm)測(cè)定。采用10 μl 反應(yīng)體系，隨機(jī)引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用20 μl反應(yīng)體系即10 μmol/L Forward primer 0.4 μl，10 μmol/L Reverse primer 0.4 μl，2 × qPCR Master Mix(SYBR Green)10 μl，RNase free H2O 7.2 μl，RT 產(chǎn)物2 μl。

以actin為內(nèi)參基因，以腦部下丘腦組織cDNA作為模板，進(jìn)行P11蛋白基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，用得出的CT 值制作擴(kuò)增效率曲線。試驗(yàn)采用比較Ct 法(2-△△Ct)進(jìn)行P11蛋白 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)以actin 作為持家基因，從而校正不同樣品初始模板量的差異，每個(gè)樣品重復(fù)3次，從而獲得平均Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算樣品間P11蛋白基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。2-△△Ct法采用的公式如下：△△Ct=[Ct(目的基因，試驗(yàn)樣品)-Ct(actin，試驗(yàn)樣品)]-[Ct(目的基因，參照樣品)-Ct(actin，參照樣品)]。每個(gè)樣品的2-△△Ct值即是該樣品P11蛋白基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因引物序列信息

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 初步處理后，采用SPSS17.0軟件中的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析。以P<0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼養(yǎng)方式對(duì)豬唾液中情緒物質(zhì)的影響

由表2可見，唾液中，發(fā)酵床飼養(yǎng)組5-HT、Cortisol濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，β-EP、Ach濃度則無顯著差異(P>0.05)。

2.2 不同飼養(yǎng)方式對(duì)育肥前期豬血清情緒物質(zhì)的影響

由表3可見，育肥前期(45 d)，發(fā)酵床飼養(yǎng)組豬血清β-EP、Cortisol、Zn濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，5-HT、Ach濃度有提高的趨勢(shì)(P=0.065，P=0.062)，Mg濃度則無顯著差異(P>0.05)。

2.3 不同飼養(yǎng)方式對(duì)育肥后期豬血清情緒物質(zhì)的影響

由表4可見，育肥后期(試驗(yàn)第90 天)，發(fā)酵床飼養(yǎng)組豬血清β-EP、cortisol、5-HT濃度顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)，Ach濃度，則顯著低于對(duì)照組(P< 0.05)，Zn、Mg則無顯著差異(P>0.05)。

2.4 不同飼養(yǎng)方式對(duì)育肥后期豬下丘腦P11蛋白基因mRNA表達(dá)的影響

圖1為RT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，發(fā)酵床飼養(yǎng)組豬下丘腦P11蛋白基因mRNA相對(duì)表達(dá)量高于水泥地面飼養(yǎng)組，且有提高的趨勢(shì)(P=0.062)。

3 討 論

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，集約化飼養(yǎng)模式優(yōu)點(diǎn)突出，但存在問題也逐步顯現(xiàn)，高密度飼養(yǎng)模式雖提高了單位產(chǎn)量，卻限制行為，減少人畜互動(dòng)影響了家畜的健康及福利，直接或間接影響生產(chǎn)性能。單調(diào)環(huán)境影響家畜的正常生理行為，易造成家畜欲求不滿、甚至精神恐懼、挫敗感外顯沉郁，不利于動(dòng)物福利及生產(chǎn)性能的發(fā)揮。發(fā)酵床模式能夠提供更好的畜舍環(huán)境，利于豬情緒天性的釋放，提高福利。5-HT、β-EP、Ach、Zn是機(jī)體內(nèi)與學(xué)習(xí)認(rèn)知、情緒密切相關(guān)的物質(zhì)。本試驗(yàn)中，發(fā)酵床飼養(yǎng)組豬唾液和血清中5-HT、Cortisol、β-EP的濃度顯著提高。已知5-HT參與情緒調(diào)節(jié)，通過神經(jīng)傳遞機(jī)能的減退參與情緒障礙包括抑郁與焦慮的形成[18-20]。常用的抗抑郁藥主要是調(diào)節(jié)5-HT濃度，抗抑郁藥能提高突觸內(nèi)5-HT水平來緩解抑郁。血漿β-EP可能是診斷抑郁癥的一種重要指標(biāo)[21]。有研究認(rèn)為抑郁癥患者血漿β-EP升高，也有研究表明抑郁癥患者血漿β-EP降低。Djurovic等[22]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性和非內(nèi)源性抑郁癥患者血漿β-EP均低于正常組，且經(jīng)治療后均有顯著上升。另有研究表明向大鼠腦室中注入β-EP能顯著增加5-HT的含量[23]。豬唾液和血清5-HT、β-EP含量的提高可以看出豬機(jī)體處于生理愉悅狀態(tài)。

表2 不同飼養(yǎng)方式對(duì)育肥后期豬唾液中情緒物質(zhì)的影響

表3 不同飼養(yǎng)方式對(duì)育肥前期豬血清情緒物質(zhì)的影響

表4 不同飼養(yǎng)方式對(duì)育肥后期豬血清情緒物質(zhì)的影響

探究行為是豬固有的遺傳習(xí)性，是其在野生狀態(tài)下生存的重要手段，主要以嗅、啃、拱等行為加以體現(xiàn)。豬探究行為動(dòng)機(jī)主要來源于兩個(gè)方面[24]，一方面是尋找食物或?qū)ふ沂孢m地方躺臥即外在探究(欲求探究)，另一方面搜集周圍生活環(huán)境信息即內(nèi)在探究(好奇探究)。探究行為是一種積極行為。豬的探究行為是動(dòng)物福利的重要指標(biāo)，反映豬認(rèn)知學(xué)習(xí)、情緒生理。集約化的養(yǎng)豬環(huán)境中，物質(zhì)貧瘠，嚴(yán)重剝奪豬的探究行為，大多數(shù)豬表現(xiàn)“無精打采”，甚至沉郁。發(fā)酵床養(yǎng)殖能夠增加仔豬和育肥豬的探究行為[6,16]。Lay 等[25]研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床飼養(yǎng)能夠增加豬玩耍行為，降低異常行為。Ach和Zn與認(rèn)知學(xué)習(xí)行為密切相關(guān)。Ach由大腦、海馬、皮層等區(qū)域釋放，促進(jìn)學(xué)習(xí)、記憶、注意、自發(fā)活動(dòng)、探究等認(rèn)知活動(dòng)[26]，鋅離子在大腦中發(fā)揮第二信使作用[27]，哺乳動(dòng)物的大腦皮層、海馬和杏仁核中發(fā)現(xiàn)了谷氨酸能神經(jīng)元中有大量富含鋅的囊泡，影響學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知及情緒[28]。發(fā)酵床提供了較大的自由空間，增強(qiáng)了豬的認(rèn)識(shí)學(xué)習(xí)活動(dòng)。育肥前期發(fā)酵床飼養(yǎng)組中豬血清Ach、Zn濃度顯著提高。由此可見，發(fā)酵床養(yǎng)殖可以顯著提高豬唾液或血清的情緒物質(zhì)，釋放豬的運(yùn)動(dòng)天性，使豬群情緒處于愉悅狀態(tài)，生理行為福利顯著改善。本次試驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床飼養(yǎng)組唾液或血清Cortisol顯著高于傳統(tǒng)水泥地面組。皮質(zhì)醇測(cè)定樣本來源主要有兩種，即血液和唾液。目前，關(guān)于富集環(huán)境飼養(yǎng)對(duì)豬唾液中皮質(zhì)醇含量的影響存在爭議。朱洪龍等[16]研究報(bào)道，發(fā)酵床飼養(yǎng)組唾液中皮質(zhì)醇濃度顯著高于傳統(tǒng)水泥地面組。Klont等[29]研究也表明，富集環(huán)境飼養(yǎng)組豬唾液皮質(zhì)醇濃度顯著高于未墊草的傳統(tǒng)飼養(yǎng)組，這均與本次結(jié)果相一致。但Morrison 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)水泥地面相比，發(fā)酵床飼養(yǎng)對(duì)豬唾液皮質(zhì)醇含量無顯著影響。De Jong 等[30]報(bào)道，11周齡時(shí)富集環(huán)境飼養(yǎng)組仔豬唾液皮質(zhì)醇含量低于未墊草的傳統(tǒng)飼養(yǎng)組。發(fā)酵床飼養(yǎng)為豬提供自由、舒適的生活環(huán)境，一定程度讓豬回歸自然狀態(tài)，滿足了豬翻拱覓食等習(xí)性，這可能對(duì)豬下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生了影響，從而引起皮質(zhì)醇的升高。且整個(gè)試驗(yàn)期發(fā)酵床飼養(yǎng)組豬并未處于應(yīng)激狀態(tài)，沒有影響生產(chǎn)性能，發(fā)酵床有可能提高了豬對(duì)環(huán)境變化的耐受性。皮質(zhì)醇的升高可能還會(huì)對(duì)后期運(yùn)輸有影響，但還需進(jìn)一步的研究。

P11蛋白(又名S100A10) 參與抑郁癥發(fā)病，并起抗抑郁作用[31]。P11蛋白在腦、心、胃腸道、腎、肝、肺、脾臟、睪丸、表皮、大動(dòng)脈以及胸腺等[32]組織廣泛表達(dá)。在腦部，P11 蛋白表達(dá)區(qū)域包括大腦皮層、海馬、下丘腦、中縫核以及伏隔核等。在抑郁大鼠和H/Rouen小鼠( 抑郁的基因動(dòng)物模型) 中p11 mRNA和蛋白水平在前扣帶回和腹側(cè)紋狀體(尤其是伏隔核)下調(diào)；在抑郁癥自殺患者的海馬和杏仁核中p11 mRNA水平下降[29]。Cattaneo等[33]2013年在一項(xiàng)抑郁癥藥物治療的基因組研究項(xiàng)目(GENDEP) 中發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞p11 mRNA 在抑郁患者中表達(dá)下降，8周抗抑郁治療后其表達(dá)上調(diào)。P11蛋白發(fā)揮抗抑郁作用一種途徑可能與5-HT相關(guān)，p11蛋白會(huì)與5-HT受體在抑郁相關(guān)多個(gè)腦區(qū)的細(xì)胞表面共定位和相互作用[34-35]，5-HT 可調(diào)節(jié)p11基因的表達(dá)[36-37]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵床飼養(yǎng)組P11蛋白基因mRNA相對(duì)表達(dá)高于水泥地面飼養(yǎng)組，P11蛋白的表達(dá)與5-HT、β-EP等情緒物質(zhì)相一致。由此可見，發(fā)酵床養(yǎng)殖確實(shí)能改善豬群情緒生理，有很好的福利作用，豬群心理健康愉悅，從而能提供更為安全的產(chǎn)品。

4 結(jié) 論

在本次試驗(yàn)中，發(fā)酵床飼養(yǎng)組能顯著提高豬群唾液和血清中5-HT、β-EP、Cortisol，提高育肥前期血清中Ach、Zn的濃度，并能夠提高腦部下丘腦P11蛋白基因mRNA表達(dá)。發(fā)酵床養(yǎng)殖環(huán)境可改善豬群的生理情緒，提高認(rèn)知運(yùn)動(dòng)能力，豬群獲得更好的愉悅感，生產(chǎn)更健康的產(chǎn)品。