曹學(xué)全，蔡小波，楊朝暉，魏科娜，阮正英，周璐青，盧洪勝

臺(tái)州市中心醫(yī)院（臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院） 病理科，浙江 臺(tái)州 318000

甲狀腺乳頭狀癌（papllary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見(jiàn)的亞型，約占全部甲狀腺癌的80%。大多數(shù)PTC甚至在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況下仍具有相對(duì)較高的生存率[1]。然而15%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例具有侵襲性行為，其特征表現(xiàn)為局部浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、治療耐藥性以及復(fù)發(fā)率和病死率增加[2]。因此，研究PTC侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。前B細(xì)胞白血病同源盒基因3（pre-B-cell leukemia homeobox 3，PBX3）是PBX家族中一個(gè)主要的輔因子，它能提高同源盒蛋白的DNA結(jié)合/轉(zhuǎn)錄活性，其異常高表達(dá)是誘導(dǎo)和維持耐藥急性髓系白血病的必要條件[3-4]。此外，體外研究發(fā)現(xiàn)PBX3的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而減少癌細(xì)胞的凋亡[5]。Twist轉(zhuǎn)錄因子是由TWIST1基因編碼，屬于堿性螺旋環(huán)螺旋（basic helix loop helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在細(xì)胞譜系的確定和分化中起著重要的作用。研究證實(shí)，Twist的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征和化療的耐藥有關(guān)，并可作為較短總生存期的候選生物標(biāo)志物[6-7]。PBX3基因和蛋白在PTC組織中是否存在異常表達(dá)，其與臨床病理特征的關(guān)系及PBX3和Twist的相關(guān)性如何，目前仍不清楚。本研究采用RT-qPCR及免疫組化En vision二步法分別檢測(cè)PTC和相應(yīng)癌旁組織中PBX3和Twist m RNA及蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，擬分析PBX3和Twist基因及蛋白表達(dá)水平變化在PTC發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 選取臺(tái)州市中心醫(yī)院2017年1月至2018年1月住院進(jìn)行手術(shù)切除的PTC標(biāo)本60例，術(shù)后常規(guī)病理診斷結(jié)果為PTC。所有患者均具有完整的臨床病理資料，且術(shù)前未接受放療、化療及生物學(xué)治療。60例PTC患者中，男19例，女41例，年齡21～77（46.1±13.4）歲。甲狀腺癌TNM分期參照2010年第七版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)（UICC）制定的分期標(biāo)準(zhǔn)：I～I(xiàn)I期38例，III～I(xiàn)V期22例。同時(shí)選取同組30例PTC的相應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤≥2 cm）作為對(duì)照，經(jīng)病理診斷為正常甲狀腺組織，患者男12例，女18例，年齡21～72（49.2±14.0）歲。收集癌和癌旁標(biāo)本分為2份，1份在離體后20 min內(nèi)放入-80 ℃低溫冰箱保存用于RT-qPCR檢測(cè)PBX3和Twist基因的表達(dá)量；1份標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行免疫組化標(biāo)記PBX3和Twist蛋白的表達(dá)。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，PIPA裂解液、cDNA試劑盒、SYBR Green熒光染料等均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。PBX3兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Twist兔抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，En Vision通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR檢測(cè)PBX3和Twist mRNA表達(dá)：在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫(kù)中查找目的基因PBX3、Twist和內(nèi)參基因的編碼序列，選取GAPDH為內(nèi)參基因，所有基因PCR引物序列均由溫州長(zhǎng)豐生物科技公司設(shè)計(jì)合成，具體如下：PBX3正向 引物5’-CAAGTCGGAGCCAATGTG-3’，反向引物5’-ATGTA GCTCAGGGAAAAGTG-3’；Twist正向引物5’-GGAGTCCGC AGTCTTACGAG-3’，反向引物5’-TCTGGAGGACCTGGTAGA GG-3’；內(nèi)參GADPH正向引物5’-CTGGGCTACACTGAGCAC C-3’，反向引物5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’，參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取PTC和癌旁組織的總RNA并檢測(cè)濃度及純度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，37 ℃孵育60 min。加入目的基因的上、下游引物和SYBR Green熒光染料，完成40個(gè)PCR循環(huán)，收集熒光信號(hào)進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)PBX3和Twist蛋白表達(dá)：應(yīng)用免疫組化En Vision二步法進(jìn)行檢測(cè)。制作4 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化。3% H2O2室溫孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓水浴抗原修復(fù)，1%山羊血清封閉，滴加一抗（PBX3稀釋濃度為1:200，Twist為1:100）4 ℃冰箱過(guò)夜，次日滴加二抗（En Vision免疫組化檢測(cè)試劑），DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸分化、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察表達(dá)特點(diǎn)和陽(yáng)性定位。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，PBX3用前列腺癌組織作陽(yáng)性對(duì)照，Twist用宮頸癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為淡黃色至棕褐色顆粒，PBX3陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，Twist陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取至少5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分和記錄。每張切片根據(jù)半定量積分法進(jìn)行判定，最終積分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比。染色強(qiáng)度：無(wú)顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比：＜10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分，最終積分≤4分為陰性，＞4分為陽(yáng)性[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以 ±s表示，2組間基因表達(dá)水平的比較采用t檢驗(yàn)，不同組間蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析探討PBX3和Twist蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBX3、Twist mRNA表達(dá)情況

2.1.1 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist mRNA表達(dá)的比較：PTC組織中PBX3、Twist m RNA的表達(dá)量均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.1.2 PBX3、Twist mRNA的表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系：PBX3、Twist mRNA表達(dá)均與PTC的包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤直徑和組織學(xué)分型均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 PBX3、Twist蛋白表達(dá)情況

2.2.1 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist蛋白表達(dá)的比較：多數(shù)PTC中PBX3在細(xì)胞質(zhì)和Twist在細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核呈彌漫強(qiáng)表達(dá)，而在癌旁組織中多為表達(dá)缺失或少數(shù)弱或中等強(qiáng)度表達(dá)。PTC組織中PBX3和Twist蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為73.33%（44/60） 和68.33%（41/60），癌旁組織中PBX3和Twist蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.67%（5/30）和13.33%（4/30），癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.2.2 PBX3、Twist蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系：伴有包膜侵犯、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移和III～I(xiàn)V期PTC組織中PBX3蛋白表達(dá)均高于無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及I～I(xiàn)I期PTC組織（P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤直徑和組織學(xué)分型中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。包膜是否侵犯、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及I～I(xiàn)I期和III～I(xiàn)V期PTC組織中Twist蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤直徑和組織學(xué)分型中的表達(dá)略有差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.2.3 PBX3和Twist蛋白表達(dá)在PTC中的相關(guān)性： Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，PBX3和Twist蛋白表達(dá)共同陽(yáng)性者35例，二者表達(dá)共同陰性者10例，PTC組織中PBX3和Twist蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.400，P=0.002）。

3 討論

PBX3是PBX家族中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的同源結(jié)構(gòu)域。早期的研究證實(shí)，PBX3最顯著的作用是維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，在人類(lèi)心臟發(fā)育和先天性心臟病中有潛在的作用[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PBX3與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在胃癌、前列腺癌等多種實(shí)體腫瘤及白血病中表達(dá)明顯升高，PBX3表達(dá)增加與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖有關(guān)[10-11]。研究表明，PBX3在多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[12]。本研究從基因和蛋白水平探討PTC和相應(yīng)癌旁組織中PBX3和Twist的表達(dá)水平及PTC患者不同臨床病理特征與兩者表達(dá)的關(guān)系。熒光定量PCR結(jié)果顯示，PBX3 mRNA在PTC組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，PBX3蛋白在多數(shù)PTC中呈彌漫強(qiáng)表達(dá)，而在癌旁正常組織中呈弱表達(dá)或不表達(dá)，且癌組織中PBX3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。表明PTC中PBX3基因和蛋白表達(dá)變化一致，提示PBX3基因和蛋白表達(dá)水平升高可能與PTC的發(fā)生密切相關(guān)，在病理診斷中增加PBX3基因和蛋白表達(dá)的檢測(cè)有助于PTC良性病變的鑒別。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，伴有包膜侵犯、淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和III～I(xiàn)V期PTC組織中PBX3 m RNA和蛋白表達(dá)均高于無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及I～I(xiàn)I期PTC組織（P＜0.05）。這表明隨著PBX3基因和蛋白水平升高，PTC的惡性程度和臨床分期越高，越容易侵犯甲狀腺包膜和淋巴結(jié)，PBX3可能參與PTC細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，在PTC的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用。該結(jié)果與LI等[12]在宮頸癌中的研究結(jié)果一致。

表1 PBX3和Twist m RNA表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系

圖2 PTC和癌旁組織中PBX3、Twist蛋白表達(dá)（En Vision染色，×400）

Twist是高度保守的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其特征在于靶向共有E-box序列5’-CANNTG-3’和 HLH區(qū)的堿性DNA結(jié)合區(qū)[13]。生理情況下，Twist是胚胎發(fā)育過(guò)程中，特別是中胚層的形成、發(fā)育和分化過(guò)程中的重要調(diào)控因子。病理情況下，隨著Twist在腫瘤作用中的研究深入，發(fā)現(xiàn)Twist是一種癌基因，通過(guò)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Twist mRNA及蛋白在PTC組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁組織 （P＜0.05），與SUN等[16]在胃食管交界處腺癌及近端胃癌中Twist高表達(dá)的研究結(jié)果一致。Twist在PTC和癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異在腫瘤診斷及鑒別診斷中提供了新的思路。國(guó)內(nèi)學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)，Twist診斷PTC在敏感度、特異度和準(zhǔn)確性方面顯著高于良性對(duì)照組織，推測(cè)Twist可用于甲狀腺良惡性腫瘤的鑒別[17]。本研究免疫組化結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Twist陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，在30%的PTC組織中存在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核同時(shí)表達(dá)，可能與分子進(jìn)入細(xì)胞核及其介導(dǎo)激活的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。分析Twist表達(dá)與PTC臨床病理特征的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及I～I(xiàn)I期PTC組織比較，Twist m RNA和蛋白表達(dá)在發(fā)生包膜侵犯、淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及III～I(xiàn)V期PTC組織中進(jìn)一步升高（P＜0.05）。提示Twist基因和蛋白表達(dá)水平增高可能在在PTC的發(fā)生中起促進(jìn)作用，且與包膜侵犯、淋巴結(jié)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和臨床分期晚期密切相關(guān)，檢測(cè)Twist基因和蛋白表達(dá)水平有助于臨床評(píng)估PTC的進(jìn)展情況。

表2 PBX3、Twist蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系

研究表明，PBX3和Twist過(guò)表達(dá)均可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn) 移[10，14]。有關(guān)PBX3和Twist在PTC中關(guān)系的研究鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究對(duì)PTC中PBX3和Twist表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)PBX3過(guò)表達(dá)，Twist表達(dá)增加，二者的表達(dá)呈正相關(guān)，其異常高表達(dá)與PTC的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明PBX3和Twist的表達(dá)變化可能在PTC的進(jìn)展中起協(xié)同調(diào)控作用。聯(lián)合檢測(cè)PBX3和Twist在PTC中的表達(dá)水平，對(duì)預(yù)測(cè)PTC的侵襲、轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后有一定的臨床價(jià)值。對(duì)于PBX3和Twist在PTC中調(diào)控的具體機(jī)制需要下一步進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)探究其生物學(xué)功能及分子機(jī)制。