郭蕊，宋楠，潘昊，林賢豐，金可可

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 浙江省骨骼肌肉退變與再生修復(fù)轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310000

大面積骨缺損再生是一個(gè)漫長(zhǎng)的修復(fù)過(guò)程，而且面臨不能完全修復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)。自體骨移植是骨缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但會(huì)造成供體部位骨量下降、感染和長(zhǎng)期疼痛等并發(fā)癥[1]。生物材料骨移植是一種有前景的替代治療方法。理想的骨移植材料要有生物相容性、可降解性和低免疫原性的特點(diǎn)，還要有促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管長(zhǎng)入的作用。天然松質(zhì)骨脫細(xì)胞基質(zhì)（cancellous bone decellular matrix，DCBM）具有疏松多孔的結(jié)構(gòu)，含有豐富的I型膠原（collagen I，Col-I）和骨基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子，對(duì)骨缺損部位的修復(fù)填充、血管長(zhǎng)入和成骨細(xì)胞募集遷移具有明顯的調(diào)控作用[2]。不同年齡段干骺端松質(zhì)骨組織在骨小梁排列、膠原分布和生長(zhǎng)因子含量等方面存在差異，因此在促進(jìn)骨修復(fù)方面也有不同的特點(diǎn)。本研究選取幼齡和成年的豬股骨干骺端松質(zhì)骨，用本課題組自主設(shè)計(jì)[2]的脫細(xì)胞方案去除細(xì)胞保留細(xì)胞外基質(zhì)，采用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）分析兩種DCBM的蛋白組成，比較幼年和成年豬DCBM的促骨生長(zhǎng)細(xì)胞因子和誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）成骨分化能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 DCBM的制備：按本課題組的優(yōu)化配方用相同方案制備幼年（3月齡）和成年（6月齡）DCBM，去細(xì)胞效果符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①HE和DAPI染色無(wú)核殘留；②DNA殘留量小于50 ng/mg干重；③殘留DNA片段小于200 bp[3]。實(shí)驗(yàn)分AN組（成年天然松質(zhì) 骨）、AD組（成年脫細(xì)胞松質(zhì)骨）、YN組（幼年天然松質(zhì)骨）和YD組（幼年脫細(xì)胞松質(zhì)骨）。

1.1.2 主要試劑：Masson染色試劑盒和阿利新藍(lán)染色試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱金生物科技有限公司。Blyscans GAGs測(cè)定試劑盒購(gòu)自英國(guó)Carrick Fergus公司。Anti-Col-IA2 antibod y（ab270994）、Anti-BMP2 antibody（ab214821）、Anti-osteocalcin antibody（ab93876）、MMP-13 polyclonal antibody（ab52915）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。兔SP免疫組化試劑盒（SP-9001）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。q PCR SYBR Green Master Mix試劑盒購(gòu)自上海元升生物科技公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8試劑盒，目錄號(hào)GK10001）購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司。C57/B6小鼠MSC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3 主要器材：Scientific Easy-nano LC II納流液相色譜儀、LTQ Orbitrap XLTM組合式質(zhì)譜儀、熱電Multiskan FC酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)），熒光定量PCR儀Lightcycler480（Roche，瑞士），ParK NX10原子力顯微鏡（PARK，韓國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 膠原蛋白含量分析：使用羥脯氨酸（Hyp）測(cè)定試劑盒分析膠原蛋白含量。將4組骨粒分別稱(chēng)重（每組n=5），按照說(shuō)明書(shū)步驟，將所測(cè)吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得Hyp含量，并基于Hyp與膠原蛋白的比率計(jì)算膠原蛋白水平，量化為μg/g濕重。用Masson三色染色評(píng)估膠原分布情況。

1.2.2 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAGs）含量分析：將4組樣品（每組n=5）凍干至恒重，按照說(shuō)明書(shū)步驟，將所測(cè)吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品的GAGs含量，量化為μg/mg干重。用阿利新藍(lán)染色評(píng)估GAG在骨小梁中的分布。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)基質(zhì)生長(zhǎng)因子：將4組組織樣本切片脫蠟后用枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS緩沖液清洗3次。滴加10%山羊血清室溫封閉1 h，將切片分別與抗骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、抗基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase，MMP-13）、抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、抗Col-I以1:200（v/v）的稀釋度4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌5 min×3，滴加二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌5 min×3，DAB顯色后蘇木素復(fù)染核。于光學(xué)顯微鏡下鏡檢拍照。

1.2.4 原子力顯微鏡分析表面微觀結(jié)構(gòu)：利用冰凍切片機(jī)將AD、YD組松質(zhì)骨材料（每組n=5）切10 μm 的薄片，吸附于石英玻片上，并浸于75%乙醇中去除冰凍切片包埋劑。將干燥的組織薄片置于原子力顯微鏡觀察臺(tái)上，校準(zhǔn)精度后，探針以500 nN和1 Hz的頻率敲擊材料表面，隨機(jī)選取5處面積為5 μm× 5 μm的材料表面區(qū)域獲得表面形貌和3D圖，利用Nanoscope Anaysis 1.9分析表面粗糙度。

1.2.5 浸提液檢測(cè)DCBM的細(xì)胞毒性：使用CCK-8試劑盒評(píng)估脫細(xì)胞骨組織的細(xì)胞毒性。制備2 mg/mL浸提液于37 ℃孵育24 h，收集浸提液并用0.22 μm濾網(wǎng)過(guò)濾。將MSC以2 000個(gè)/孔鋪板到96孔板中，孵育24 h后，用200 μL各種濃度（0%、25%、50%和100%）的浸提液置換孔內(nèi)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)1、3、5和7 d后，將10 μL CCK-8溶液添加到平板的每個(gè)孔中，37 ℃溫育1 h后，測(cè)量450 nm處的吸光度。

1.2.6 細(xì)胞復(fù)植與q PCR檢測(cè)成骨誘導(dǎo)性能：①細(xì)胞復(fù)植：將AD組和YD組用完全培養(yǎng)基沖洗3次，無(wú)菌紗布吸干多余培養(yǎng)液。按1×106個(gè)細(xì)胞/DCBM基質(zhì)復(fù)植MSC，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱1 h。然后將含細(xì)胞的DCBM支架移板于24孔板中，添加培養(yǎng)液培養(yǎng)。獲取復(fù)植細(xì)胞1、2、3周后的材料用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。② qPCR：將收集的復(fù)植細(xì)胞的DCBM材料在液氮中充分碾磨成粉末后，純化提取RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green法添加引物于cDNA中，用q PCR分析儀檢測(cè)各基因的Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參，利用2-△△Ct值評(píng)估OCN、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Col-I、BMP-2基因表達(dá)量以評(píng)估細(xì)胞成骨分化情況。

1.2.7 LC-MS/MS分析DCBM蛋白組成：LC-MS/MS分別測(cè)定AD組和YD組的肽序列（每組n=3）。首先，將樣品在4% SDS和100 mmol/L DTT溶液中勻漿，參考酶切制備程序（FASP）進(jìn)行蛋白水解[4]。隨后將肽溶液收集，脫鹽并純化。純化的蛋白在Easy nano液相色譜儀上進(jìn)行分析。用0.1%甲酸洗滌濃縮肽溶液在反相捕集柱上，用梯度濃度的乙腈從分析柱上洗脫。立即在LTQ Orbitrap X質(zhì)譜儀分析洗脫的肽。將兩組所得蛋白LFQ intensity均值用geneontology. org/網(wǎng)站經(jīng)“生物過(guò)程”“細(xì)胞成分”和“分子功能”通道進(jìn)行基因本體論分析，并對(duì)AD組和YD組所特有的蛋白質(zhì)序列分析進(jìn)行富集分析。

圖1 脫細(xì)胞對(duì)DCBM有機(jī)成分的影響

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以 ±s表示，2組比較采用雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞外基質(zhì)重要有機(jī)成分的保留情況 阿利新藍(lán)染色和GAGs定量結(jié)果表明，相比于成年松質(zhì)骨組織，幼年松質(zhì)骨組織在脫細(xì)胞前后GAGs含量高，且去細(xì)胞對(duì)含量影響較?。幻庖呓M化分析顯示，脫細(xì)胞過(guò)程對(duì)Col-I含量影響較小；Masson三色染色顯示，脫細(xì)胞后幼年和成年松質(zhì)骨骨小梁的完整性和連續(xù)性得到很好保留，且幼年松質(zhì)骨存在更多的藍(lán)染未成熟膠原；Col-I免疫組化染色顯示幼年松質(zhì)骨脫細(xì)胞后膠原暴露更充分。見(jiàn)圖1。

2.2 DCBM細(xì)胞因子的保留情況 免疫組化染色顯示，與AN組相比，YN組含有較多的BMP-2、MMP-13、OCN，而且脫細(xì)胞后YD組較AD組有更豐富的細(xì)胞因子保留在基質(zhì)中（見(jiàn)圖2）。

2.3 松質(zhì)骨的細(xì)胞黏附與成骨誘導(dǎo)性能 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)1、3、5、7 d對(duì)照組（0%浸提液組）和其他各組（25%、50%、100%浸提液組）細(xì)胞代謝活性均無(wú)明顯下降（P＞0.05），見(jiàn)圖3。MSC種植后1周固定切片做HE染色，YD組黏附更多細(xì)胞；AFM原子力顯微鏡顯示，AD組微觀表面多突起且不平整，起伏較?。ā?8.8 nm），幼豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨微觀表面平整且有較大的起伏（±221.6 nm），見(jiàn)圖4。AD組和YD組粗糙度的統(tǒng)計(jì)量分別為11.935± 3.76，34.18±2.57（P=0.0001）。細(xì)胞種植培養(yǎng)1、2、4周后，以單層培養(yǎng)細(xì)胞為參照，YD組均可更強(qiáng)地誘導(dǎo)早期（ALP）及晚期(OCN)成骨標(biāo)志物，顯示出更好的早期成骨誘導(dǎo)性能（見(jiàn)圖5）。

圖2 DCBM細(xì)胞因子的保留情況（標(biāo)尺均為200 μm）

2.4 脫細(xì)胞松質(zhì)骨蛋白質(zhì)譜差異 利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)脫細(xì)胞松質(zhì)骨進(jìn)行全譜蛋白鑒定，AD組共鑒定出65種有意義的功能蛋白，YD組鑒定出290種有意義的功能蛋白。通過(guò)基因本體論GO富集分析，生物過(guò)程通道顯示YD組在骨化、細(xì)胞外基質(zhì)組成、骨礦化和生物礦化的-log FDR值（肽段相對(duì)含量）和蛋白含量占比（%）均高于AD組（見(jiàn)圖6A）。細(xì)胞成分通道顯示YD組在細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外基質(zhì)、含膠原細(xì)胞外基質(zhì)和各種纖維膠原多聚體的-log FDR值和含量也高于AD組（見(jiàn)圖6B）。在分子功能通道，雖然YD組在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、膠原連接和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成功能肽段的-logFDR值高于AD組，但是蛋白成分占比顯著低于AD組（見(jiàn)圖6C）。此外，從蛋白質(zhì)譜結(jié)果可得，除兩組相同的蛋白外，YD組會(huì)殘留較多的生長(zhǎng)因子在松質(zhì)骨基質(zhì)中，比如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming grow th factor， TGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor，IGF）等，而AD組蛋白質(zhì)譜未檢測(cè)到相關(guān)肽段（見(jiàn)圖6D）。

圖3 細(xì)胞增殖CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 MSC復(fù)植HE切片染色和AFM原子力顯微鏡掃描AD和YD表面形貌和粗糙度

圖5 誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)qPCR檢測(cè)成骨指標(biāo)

3 討論

骨缺損再生漫長(zhǎng)且易發(fā)生畸形，延遲愈合和畸形愈合會(huì)對(duì)患者造成身心負(fù)擔(dān)和對(duì)醫(yī)師制定治療方案造成挑戰(zhàn)[5-6]。自體骨移植易造成供體部位缺損和感染風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致病程延長(zhǎng)[7]。骨移植物的基本特性是骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)、成骨特性和結(jié)構(gòu)支撐，理想的移植物還應(yīng)滿(mǎn)足生物安全、體內(nèi)可降解性、力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)[8]。

圖6 脫細(xì)胞松質(zhì)骨的蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析

豬和人的基因序列有極高的相似度，天然來(lái)源的豬器官脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)及其制備的水凝膠已批準(zhǔn)用于臨床，如心臟、肌腱、血管、皮膚等[9]。豬來(lái)源的脫細(xì)胞松質(zhì)骨作為異種來(lái)源的天然生物材料已在臨床前研究中有所實(shí)踐[10]。成年豬骨已經(jīng)發(fā)育完全，其基質(zhì)中保留的Col-I以及骨基質(zhì)中沉積的成骨生長(zhǎng)因子也隨年齡的增長(zhǎng)而下降。生長(zhǎng)期的豬松質(zhì)骨的特征是有機(jī)質(zhì)含量高，骨髓中含有豐富的成骨細(xì)胞，能產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子沉積骨基質(zhì)中。本研究選取幼年豬松質(zhì)骨（3月齡）制備細(xì)胞外基質(zhì)，3月齡豬股骨干骺端發(fā)育完整，有利于遠(yuǎn)離骨骺板的松質(zhì)骨取材。優(yōu)化調(diào)整配方使得幼年和成年豬骨在相同條件下完全去除細(xì)胞以及核成分。

骨組織細(xì)胞外基質(zhì)有機(jī)成分主要為Col-I（占90%），其他非膠原蛋白有GAGs和沉積于基質(zhì)中的成骨生長(zhǎng)因子。GAGs帶有負(fù)電荷和有很強(qiáng)的吸水性，有助于保護(hù)生長(zhǎng)因子和保持骨陷窩內(nèi)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)移植部位細(xì)胞的增殖、分化和黏附[11]。BMP-2是重要的成骨和成血管誘導(dǎo)因素，可以通過(guò)VEGF通路誘導(dǎo)局部血管生成[12]。rhBMP-2是唯一獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)的BMP，在腰椎椎體的修復(fù)中使用并取得良好的臨床效果[13]。MMP-13在骨骼生長(zhǎng)和骨折重塑中起關(guān)鍵作用[14]。OCN占骨總蛋白的1%～2%，與羥基磷灰石和鈣有很強(qiáng)的結(jié)合性，具有鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制羥基磷灰石膨脹的作用[15-16]。TGF-β1是骨骼組織中高度豐富的生長(zhǎng)因子，可刺激成骨細(xì)胞中MMP-13 的表達(dá)，在骨折和骨缺損過(guò)程中重塑骨骼，同時(shí)殘留在細(xì)胞外基質(zhì)中的游離MMP-13可在骨修復(fù)過(guò)程中重塑改建的膠原，使膠原避免過(guò)度增加形成骨痂，有利于骨骼恢復(fù)原始結(jié)構(gòu)功能[17-18]。在蛋白質(zhì)譜分析中，由于SDS和Triton-X100等陰離子去污劑的作用，使得成年豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨中相應(yīng)細(xì)胞因子蛋白肽段低于檢出限，成年豬松質(zhì)骨未檢測(cè)出FGF、TGF、IGF等相關(guān)肽段，而生長(zhǎng)期骨組織中會(huì)沉積大量的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，相同條件下會(huì)保留更多的生長(zhǎng)因子于骨基質(zhì)中，在移植部位發(fā)揮更好的骨誘導(dǎo)性作用。

細(xì)胞從基質(zhì)上分離會(huì)在細(xì)胞外基質(zhì)的表面形貌、粗糙度等超微結(jié)構(gòu)形成不同的變化。移植材料的表面粗糙度可以調(diào)節(jié)缺損部位趨化募集的破骨細(xì)胞分化為不同的表型，對(duì)成骨細(xì)胞的成骨分化有不同的誘導(dǎo)作用[19]。表面粗糙度較高的細(xì)胞外基質(zhì)上會(huì)沉積更多的鈣和礦物質(zhì)，誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨表型分化[20]。材料表面粗糙度會(huì)對(duì)材料的黏附性產(chǎn)生影響，粗糙度越高，接觸面的比表面積越大，骨科常用的金屬植入物均有改變粗糙度以增加人體適應(yīng)性的研究[21]。本研究發(fā)現(xiàn)幼年松質(zhì)骨脫細(xì)胞后有更粗糙的表面，在實(shí)驗(yàn)中種植細(xì)胞培養(yǎng)顯示幼年松質(zhì)骨會(huì)在表面黏附更多的細(xì)胞。

本研究最后用生物信息學(xué)對(duì)兩種松質(zhì)骨的差異蛋白進(jìn)行GO富集分析，生物過(guò)程通道的富集分析顯示幼年豬DCBM在細(xì)胞外基質(zhì)組成、骨礦化過(guò)程和生物礦化等含有更高豐度的相關(guān)蛋白，體現(xiàn)其生長(zhǎng)期骨重塑過(guò)程中膠原改建和鈣沉積的過(guò)程。細(xì)胞成分通道的富集分析顯示幼年松質(zhì)骨的細(xì)胞外基質(zhì)組成、含膠原細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和各種纖維膠原多聚體結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著高于成年松質(zhì)骨，體現(xiàn)成骨細(xì)胞活躍沉積細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)果。分子功能通道的分析顯示，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、膠原連接和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成功能肽段豐度成年松質(zhì)骨更占優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)了成年松質(zhì)骨維持正常生理功能的過(guò)程。

綜上，本研究從細(xì)胞因子、材料超微結(jié)構(gòu)和分子蛋白組成等方面分析了幼年和成年DCBM的差異，結(jié)果顯示幼年脫細(xì)胞松質(zhì)骨在細(xì)胞黏附和誘導(dǎo)成骨方面優(yōu)于成年松質(zhì)骨，是優(yōu)良的骨移植替代物。