萬(wàn) 兵，梁月娟，王 鶴

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，南寧 530021）

宮頸癌（cervical cancer，CC）在全球女性診斷出的惡性腫瘤中居于第4位[1]，嚴(yán)重危害著廣大女性的健康。高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）持續(xù)感染是CC 發(fā)生的最主要危險(xiǎn)因素[2]，但并非都會(huì)發(fā)展成宮頸上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesions，SIL）甚至CC。其他致病機(jī)制是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，為SIL及CC的防治提供新思路。MicroRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼RNA，其可結(jié)合到靶mRNA的3’-UTR，并與其他輔助蛋白降解靶mRNA 轉(zhuǎn)錄本/抑制其翻譯成蛋白質(zhì)[3]。MicroRNA 也可以作為原癌基因或抑癌基因參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]。miR-34家族中有miR-34a、miR-34b和miR-34c，參與p53調(diào)控途徑[5]。miR-34a可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期E2、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4/6、E2F轉(zhuǎn)錄因子、B淋巴細(xì)胞瘤2等蛋白[6]，并在CC[7]等腫瘤上發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤活性，預(yù)測(cè)其可能是癌癥診斷和治療的潛在靶標(biāo)。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-B1，HMGB1）是一種結(jié)合在DNA上高度保守的核蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮不同作用。細(xì)胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）存在于細(xì)胞核中，被公認(rèn)為細(xì)胞增殖的標(biāo)志蛋白。HMGB1 參與組織修復(fù)、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤血管的生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等，還可促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟遷移和Th2 細(xì)胞的極化，引起免疫逃逸[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1 是多種miRNA的直接靶標(biāo)，PCNA和HMGB1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系[9-10]，但miR-34a 在調(diào)控SIL 進(jìn)展及癌變的分子機(jī)制仍不清楚。本研究探討miR-34a、HMGB1 及PCNA基因在SIL組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本和病例的收集

收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2016 年1 月至2019 年12 月收治的158 例SIL、宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma，SCC）及因子宮肌瘤/子宮腺肌癥切除子宮的患者宮頸組織標(biāo)本及臨床病理資料。將研究對(duì)象分為正常宮頸組（n=50）、SIL組（n=65）和SCC 組（n=43）。其中用于檢測(cè)miR-34a 的正常宮頸組31 例、SIL 組織30 例、SCC 組31例，用于檢測(cè)HMGB1、PCNA 的正常宮頸組38 例、SIL組52例、SCC組30例。所有標(biāo)本取前患者均未行化療、放療及免疫治療。本研究獲得廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及其家屬均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SCC 細(xì)胞系SiHa 細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院饋贈(zèng)，STR鑒定匹配值為100%。SiHa細(xì)胞在含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。CC前細(xì)胞系H8細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院，在含有10%胎牛血清+1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基、血清和抗生素均購(gòu)自Gibco 公司。

1.3 RNA的抽提和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

采用Trizol 法提取組織標(biāo)本及細(xì)胞中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qPCR 檢測(cè)各基因表達(dá)，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及qPCR 試劑盒均購(gòu)自Takara 公司。miR-34a 引物序列為5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’；U6上游引物為5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，下游為5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’；HMGB1 上游引物為5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，下游為5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’；PCNA上游引物為5’-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3’，下游為5’-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3’；GAPDH 上游引物為5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游為5’-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。上述引物均由Takara公司合成。每個(gè)樣品均檢測(cè)3次，U6 和GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT計(jì)算各樣本中miR-34a 和細(xì)胞系中各基因的相對(duì)表達(dá)水平。HMGB1 和PCNA 基因在組織中的表達(dá)采用目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選用t’檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（QR）]表示，組間比較使用曼－惠尼特U檢驗(yàn)。多組之間比較采用方差分析，方差不齊的組間比較采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理分析

3 組患者的年齡、孕次、絕經(jīng)、HPV 感染情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。以年齡、絕經(jīng)、孕次、產(chǎn)次、HPV感染為自變量，以診斷為SIL 及SCC 為因變量分別進(jìn)行Logistic 單因素分析，結(jié)果顯示患者年齡、孕次及HPV 感染均與SIL有關(guān)（P＜0.05），年齡、絕經(jīng)、孕次、產(chǎn)次及HPV感染均與SCC有關(guān)（P＜0.05）。同時(shí)，將年齡、絕經(jīng)、孕次、產(chǎn)次、HPV 感染納入多因素分析，結(jié)果顯示，孕次是SIL 和SCC 發(fā)生的保護(hù)因素，而HPV 感染是SIL 和SCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表2、表3。

表1 不同組別患者的臨床病理分析

表2 影響SIL發(fā)生的危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

表3 影響SCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

2.2 各組組織及細(xì)胞系中miR-34a、HMGB1 mRNA及PCNA mRNA的表達(dá)

2.2.1 miR-34a 的表達(dá) miR-34a 在SIL組 和SCC組中的表達(dá)均顯著低于正常宮頸組（均P＜0.001），且在SCC 組顯著低于SIL 組（P=0.024）。在細(xì)胞系水平檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-34a在H8細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于SiHa細(xì)胞（P＜0.001），見(jiàn)表4。

表4 各組織和細(xì)胞中的miR-34a表達(dá)

2.2.2 HMGB1 mRNA 的表達(dá) HMGB1 在正常宮頸組和SIL 組中的mRNA 表達(dá)均顯著低于SCC 組（P=0.001,P=0.038），且在正常宮頸組顯著低于SIL組（P=0.039）。HMGB1在H8細(xì)胞中的mRNA水平顯著低于SiHa細(xì)胞（P=0.005），見(jiàn)表5。

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2.2.3 PCNA mRNA的表達(dá) PCNA在正常宮頸組和SIL組中的表達(dá)均顯著低于SCC組（P=0.033,P=0.004），但在正常組和SIL組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.967）。PCNA 在H8 細(xì)胞中的mRNA 水平顯著低于SiHa細(xì)胞（P=0.045），見(jiàn)表6。

表5 各組織和細(xì)胞中的HMGB1表達(dá)

表6 各組織和細(xì)胞中的PCNA表達(dá)

2.3 不同臨床病理因素的患者miR-34a 表達(dá)的差異 miR-34a在HPV陽(yáng)性的SIL和SCC組織中表達(dá)均較HPV 陰性者顯著下降（P=0.028，P=0.039），同時(shí)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-34a 表達(dá)顯著下調(diào)（P=0.015）。其余臨床病理因素與各組miR-34a 的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)表7、表8。

表7 患者臨床病理特征與miR-34a在正常組及SIL組中表達(dá)情況的關(guān)系M（QR）

表8 患者臨床病理特征與miR-34a在SIL組及SCC組中表達(dá)情況的關(guān)系M（QR）

3 討論

3.1 miR-34a表達(dá)與SIL的關(guān)系

SIL發(fā)展為宮頸原位癌、浸潤(rùn)癌是一個(gè)多基因、多因素參與，經(jīng)歷多階段的過(guò)程，而miRNA 在此過(guò)程中扮演著重要角色。miR-34a上游啟動(dòng)子存在高度保守的p53 蛋白結(jié)合位點(diǎn)，還可通過(guò)靶向下調(diào)E2F3 表達(dá)在p53-miR-34a-E2F3-p53 通路和靶向SIRT1增強(qiáng)p53表達(dá)形成p53-miR-34a-SIRT1-p53正反饋通路增強(qiáng)miR-34a 的表達(dá)[11-12]，抑制細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期G1 期/S 期的轉(zhuǎn)變和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Gocze等[7]發(fā)現(xiàn)miR-34a在CIN II～I(xiàn)II中的表達(dá)水平顯著低于CINⅠ。同時(shí)miR-34a表達(dá)下調(diào)可促使肺癌[13]、乳腺癌[14]、CC[15]、前列腺癌[16]等腫瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a 在SIL 和SCC 組織較正常宮頸組織表達(dá)均顯著下調(diào)（均P＜0.001），且SCC組顯著低于SIL組（P=0.024）。同時(shí)，miR-34a在H8細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于SiHa 細(xì)胞（P＜0.001）。說(shuō)明miR-34a在SIL和SCC組織中、H8和SiHa細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，隨著宮頸病變程度加重，miR-34a表達(dá)逐漸降低。

3.2 HMGB1表達(dá)與SIL的關(guān)系

研究表明，HMGB1 是miR-34a 的直接靶標(biāo)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]。Yu 等[17]發(fā)現(xiàn)HMGB1 在慢性宮頸炎患者與CINs 的陽(yáng)性染色率均顯著低于浸潤(rùn)性SCC，隨著宮頸病變的加重而表達(dá)升高。Pang等[8]發(fā)現(xiàn)HMGB1 的表達(dá)是隨著宮頸病變的進(jìn)展而顯著性上升，與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。本研究結(jié)果與上述一致，HMGB1 在SCC 組中mRNA 水平均顯著高于正常宮頸組和SIL 組（P=0.001，P=0.038），且SCC 組顯著高于SIL 組（P=0.039）。HMGB1 在H8 細(xì)胞中mRNA 水平顯著低于SiHa 細(xì)胞（P=0.005）。說(shuō)明HMGB1 在SIL 和SCC 組織中、H8 和SiHa 細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，隨著宮頸病變程度的加重，HMGB1表達(dá)逐漸升高。

3.3 PCNA表達(dá)與SIL的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，PCNA 在Base excision repair通路中是HMGB1的下游分子，敲低HMGB1可抑制PCNA表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[18-20]。PCNA是細(xì)胞增殖的標(biāo)志蛋白，在腫瘤中可作為反映增殖程度與判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。Wang 等[21]發(fā)現(xiàn)PCNA 在正常宮頸和炎癥性宮頸為陰性表達(dá)，在CIN組（63.2%）和SCC組（100%）中表達(dá)顯著增加，并預(yù)測(cè)PCNA 可能是CC 進(jìn)展的臨床標(biāo)志物。但Branca等[22]在正常宮頸中發(fā)現(xiàn)PCNA 的表達(dá)，認(rèn)為不可將其作為CC 篩選的潛在指標(biāo)，還發(fā)現(xiàn)上調(diào)PCNA 表達(dá)與HR-HPV 和CIN 進(jìn)展密切相關(guān)，但不能預(yù)測(cè)CIN 治療后HR-HPV 的清除。本研究發(fā)現(xiàn)，PCNA在SCC組中的表達(dá)均顯著高于正常宮頸組和SIL組（P=0.033，P=0.004），但正常宮頸組和SIL 組中的PCNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.967）。H8細(xì)胞中的mRNA 水平也顯著低于SiHa 細(xì)胞（P=0.045）。說(shuō)明與HMGB1 的表達(dá)一致，PCNA 在SIL和SCC 組織、H8 和SiHa 細(xì)胞中的表達(dá)也是隨著宮頸病變程度的加重而逐漸升高的。

3.4 miR-34a表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，相比HPV 陰性的SIL 及SCC 組織，HPV 陽(yáng)性的組織中miR-34a 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。Gocze等[7]報(bào)道m(xù)iR-34a在CIN I進(jìn)展為CIN Ⅱ～Ⅲ和CIN Ⅱ～Ⅲ進(jìn)展為CC階段均與HPV16陽(yáng)性顯著相關(guān)。Geng 等[11]發(fā)現(xiàn)HR-HPV 陽(yáng)性的正常宮頸組織、CIN組織及CC組織中miR-34a均顯著下調(diào)，并向Hela 和SiHa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a，細(xì)胞活力和集落形成能力均顯著下降。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-34a 表達(dá)顯著下調(diào)（P=0.015）。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)miR-34a低表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO 分期相關(guān)，miR-34a低表達(dá)的患者預(yù)后較差，并預(yù)測(cè)miR-34a可作為CC診斷和預(yù)后的參考指標(biāo)。

綜上所述，隨著宮頸病變程度的加重，miR-34a的表達(dá)逐漸降低，下調(diào)的miR-34a 調(diào)控HMGB1 表達(dá)的能力下降，HMGB1 表達(dá)的增強(qiáng)促進(jìn)其下游分子PCNA表達(dá)升高，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，抑制P53抑癌通路，促使細(xì)胞發(fā)生癌變和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，H8細(xì)胞和SiHa細(xì)胞上驗(yàn)證miR-34a、HMGB1和PCNA的表達(dá)趨勢(shì)與組織一致。miR-34a、HMGB1 及PCNA有望成為預(yù)警SIL進(jìn)展的新靶標(biāo)。