嚴(yán)提珍 黃鈞 袁德健 唐向榮 韋笑寶 羅世強(qiáng)

作者單位：1 柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 柳州 545001

2 柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 柳州 545001

3 柳州市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 柳州 545001

4 柳州市婦幼保健院耳鼻喉科、聽(tīng)力診斷中心 柳州 545001

5 柳州市婦幼保健院眼科 柳州 545001

Usher綜合征（Usher syndrome，USH）是一組以先天性感音神經(jīng)性耳聾、漸進(jìn)性視網(wǎng)膜色素變性引起視力障礙、視野縮小為主要臨床表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，發(fā)病率約為3.3～16.6/100000[1]。依據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度，可分為I型、II型和III型，其中I型癥狀最為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為先天性重度或極重度感音神經(jīng)性耳聾，前庭功能障礙，在青少年時(shí)期可引發(fā)不同程度的視網(wǎng)膜色素變性[1]。Usher綜合征具有高度臨床表型和遺傳異質(zhì)性，目前明確可與Usher綜合征I型相關(guān)的基因有5個(gè)（MYO7A、CDH23、USH1C、USH1G、PCDH15）[1]，其中MYO7A基因變異發(fā)生率最高[2]；與Usher綜合征II型相關(guān)基因有3個(gè)（USH2A、GPR98和DFNB31）；CLRN1基因與Usher綜合征III型相關(guān)[1]。臨床上Usher綜合征主要通過(guò)聽(tīng)力檢測(cè)、眼科檢查結(jié)合基因檢測(cè)診斷。本研究通過(guò)高通量測(cè)序及Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一個(gè)由MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)復(fù)合雜合變異導(dǎo)致的Usher綜合征I型家系，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為先證者及其家系成員，先證者為一名14歲女性，因耳聾和視力異常來(lái)我院進(jìn)行檢查，家系成員包括父母、姐姐、妹妹和弟弟（圖1）。本研究已獲得了柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。采集先證者及家系成員的病史（包括出生史、耳聾和眼睛病史、用藥史、家族史等），進(jìn)行系統(tǒng)檢查：對(duì)先證者及其弟弟進(jìn)行聲導(dǎo)抗、純音測(cè)聽(tīng)、聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)反應(yīng)（ABR）、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）檢查，對(duì)其他家系成員進(jìn)行聲導(dǎo)抗和純音測(cè)聽(tīng)；眼科檢查包括視力、眼底視野視網(wǎng)膜電圖等。

圖1 Usher綜合征家系系譜圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和DNA提取 采集先證者及家系成員EDTA-Na抗凝的外周血4 mL，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）進(jìn)行基因組DNA提?。ú僮鞑襟E參照試劑盒說(shuō)明書(shū)）。

1.2.2 醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序 用Q800R超聲破碎儀將質(zhì)檢合格的基因組DNA打斷成片段，打斷后DNA片段大小在500 bp以下，峰值約在350 bp。參照NGS文庫(kù)制備試劑盒（美國(guó)Illumina系統(tǒng)）條件及方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，將質(zhì)檢合格的文庫(kù)稀釋至上機(jī)測(cè)序濃度，完成自動(dòng)的簇生成及雙端測(cè)序（美國(guó)Illumina HiSeq4000測(cè)序儀），通過(guò)多種生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)合家系患者的臨床表型，對(duì)于篩查出來(lái)的潛在變異位點(diǎn)，通過(guò)檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)（如HGMD、PubMed、ESP、ClinVar、ExAC庫(kù)和千人數(shù)據(jù)等）來(lái)判斷變異位點(diǎn)的致病性。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（American college of medical genetics，ACMG）遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南[3]，對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估和致病性分類(lèi)。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證變異位點(diǎn) 針對(duì)候選變異位點(diǎn)引物，c.3631-1G＞C變異位點(diǎn)引物序列為F：5’-CTGTGAAGGGGTATGGGGAG-3’和R：5’-TGAGGGTAGGTGTCTGAGGA-3’；c.6049C ＞T 變異位點(diǎn)引物序列為F ：5’-TGACACACAGAAACCCCTTC-3’和R：5’-TACAAGGATCAGGGGTTGGG-3’。對(duì)先證者及其家系成員的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，純化定量后，送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)（美國(guó)ABI 3730xl DNA測(cè)序儀），測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件的SeqMan與野生型進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4 氨基酸保守性分析 通過(guò)在線軟件ClustalW2（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）對(duì)6個(gè)物種目標(biāo)氨基酸序列進(jìn)行保守性比對(duì)分析。氨基酸序列包括：NP_000251.3（Homo sapiens，人）、NP_001243010.1（Mus musculus，小鼠）、XP_006229806.1（Rattus norvegicus，褐家鼠）、XP_038285928.1（Canis lupus familiaris，犬）、XP_011717460.1（Macaca nemestrina，獼猴）、XP_016777155.2（Pan troglodytes，黑猩猩）。

2 結(jié)果

2.1 病史及全身體格檢查結(jié)果

該家系符合常染色體隱性遺傳的特征（圖1），先證者（II-2）聽(tīng)力檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABR＞100 dB HL，而耳聲發(fā)射不能引出（排除聽(tīng)神經(jīng)?。?，雙耳純音聽(tīng)閾均＞100 dB HL，為極重度感音神經(jīng)性耳聾，伴有前庭功能減退（運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，患兒坐立均遲于正常同齡兒，1歲會(huì)坐，2歲5個(gè)月會(huì)走路，缺乏運(yùn)動(dòng)技能，不能跑步騎車(chē)，冷熱水試驗(yàn)無(wú)反應(yīng)）。眼科檢查結(jié)果顯示視網(wǎng)膜電圖無(wú)反應(yīng)，b波消失，提示為視網(wǎng)膜色素變性（圖2），依據(jù)先證者典型的臨床表現(xiàn)，臨床初步診斷為Usher綜合征I型。先證者弟弟（II-4）檢查結(jié)果也表現(xiàn)為極重度感音神經(jīng)性耳聾，但還表現(xiàn)為牙齒發(fā)育不良、兩邊眼球大小不一致（左眼球偏小）、斜視、斗雞眼，無(wú)視網(wǎng)膜變性病變。先證者父母（I-1和I-2）、姐姐（II-1）和妹妹（II-3）未出現(xiàn)與先證者類(lèi)似表型。

2.2 先證者及其他家系成員的測(cè)序結(jié)果

圖2 先證者雙眼視網(wǎng)膜色素變性

高通量測(cè)序檢測(cè)和分析結(jié)果提示，先證者及其弟弟為MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)復(fù)合雜合變異（圖3 II-2和II-4），通過(guò)拷貝數(shù)和SNP分析，沒(méi)有檢測(cè)到與臨床表現(xiàn)可能相關(guān)的拷貝數(shù)變異。經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證顯示這兩個(gè)變異位點(diǎn)分別來(lái)自先證者的父母（圖3 I-1和I-2），先證者姐姐（圖3 II-1）和妹妹（圖3 II-3）均攜帶MYO7A c.3631-1G＞C雜合變異。

2.3 致病性及保守性分析

c.6049C＞T變異位點(diǎn)第2017位氨基酸谷氨酰胺在人、小鼠、褐家鼠、犬、獼猴、黑猩猩多個(gè)物種之間高度保守（見(jiàn)圖4）。

3 討論

圖3 USH綜合征家系Sanger測(cè)序結(jié)果

圖4 保守性分析結(jié)果

MYO7A基因相關(guān)疾病為常顯遺傳性耳聾11型、常隱遺傳性耳2型和Usher綜合征1型[4，5]，是常染色體顯性/隱性遺傳。常顯遺傳性耳聾11型臨床特征主要為語(yǔ)后漸進(jìn)性聽(tīng)力損失；常隱遺傳性耳聾2型臨床特征主要為語(yǔ)前和語(yǔ)后重度聽(tīng)力損失；Usher綜合征I型臨床特征主要為先天性重度或極重度感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，青春期前視網(wǎng)膜色素變性，伴或不伴前庭功能異常[1]。本例先證者及其弟弟有共同的臨床表型，均表現(xiàn)為極重度感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙，但臨床表型存在差異，先證者還表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性，而其弟弟6歲，無(wú)視網(wǎng)膜色素變性病變（可能與年齡有關(guān)，后續(xù)需密切隨訪其視力和眼底檢查情況），同時(shí)具有牙齒發(fā)育不良、兩邊眼球大小不一致（左眼球偏?。?、斜視、斗雞眼等臨床表型，這些額外的臨床癥狀在Usher綜合征病例中未見(jiàn)報(bào)道，提示可能存在其他基因變異或拷貝數(shù)變異。該家系兩個(gè)患者基因型相同，但臨床表型有所不同，提示Usher 綜合征具有高度表型異質(zhì)性。

MYO7A基因位于染色體11q13.5區(qū)域，含49個(gè)外顯子，編碼2215個(gè)氨基酸，編碼蛋白屬于肌球蛋白家族（myosin 7A），該蛋白為馬達(dá)蛋白，具有ATP酶活性，可利用水解ATP產(chǎn)生的動(dòng)能，與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，沿著肌動(dòng)蛋白絲運(yùn)動(dòng)[1，5]。該蛋白結(jié)構(gòu)域有3個(gè)重要區(qū)域：①氨基末端（即馬達(dá)區(qū)域，是肌球蛋白的核心功能區(qū)，可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，主要功能是水解ATP和產(chǎn)生動(dòng)能）；②調(diào)節(jié)區(qū)（即頸部，可與肌球蛋白輕鏈結(jié)合形成異亮氨酸-谷氨酰胺基序）；③羧基末端：（即尾部，分為SH3結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)MyTH4結(jié)構(gòu)域，主要功能是調(diào)節(jié)MYO7A運(yùn)動(dòng)）。目前已報(bào)道超過(guò)500個(gè)MYO7A基因變異位點(diǎn)可導(dǎo)致Usher綜合征I型或遺傳性耳聾，變異類(lèi)型覆蓋無(wú)義變異、錯(cuò)義變異、移碼變異、微缺失變異及剪接變異等[6]，分布于各結(jié)構(gòu)域。王圣然等[7]報(bào)道了一個(gè)由MYO7A基因c.462C＞A和EX46_47 Del復(fù)合雜合變異導(dǎo)致常染色體隱性遺傳非綜合征耳聾的家系，其中c.462C＞A位于氨基末端，無(wú)義變異使得翻譯提前終止，產(chǎn)生截短蛋白；EX46_47 Del變異導(dǎo)致了MYO7A羧基末端MyTH4-FERM結(jié)構(gòu)域缺失。劉夢(mèng)婷等[8]和林長(zhǎng)亮等[9]報(bào)道的家系分別為c.3412C＞T (p.Q1138*)/c.4152G＞C(p.K1384N)和c.2694+2T＞G/c.6028G＞A復(fù)合雜合變異，這些變異可引發(fā)MYO7A基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常，從而導(dǎo)致下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異?；蛑袛啵罱K患者出現(xiàn)Usher綜合征I型臨床癥狀。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序和Sanger測(cè)序基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)先證者及其弟弟均攜帶MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)復(fù)合雜合變異。MYO7A基因c.3631-1G＞C為剪接變異，沒(méi)有在相關(guān)臨床病例中被報(bào)道過(guò)，變異位于mRNA剪接區(qū)域，序列高度保守，多種計(jì)算機(jī)輔助算法預(yù)測(cè)變異可能會(huì)影響蛋白功能。依據(jù)ACMG變異分類(lèi)指南[3]，該變異符合PVS1（當(dāng)一個(gè)疾病的致病機(jī)制為功能喪失的無(wú)功能變異）+PM2（千人數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP數(shù)據(jù)庫(kù)、EXAC數(shù)據(jù)庫(kù)中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異）+PM3（對(duì)于隱性遺傳基因，在患者反式位置檢測(cè)到致病或可能致病變異），可判定為致病。MYO7A基因c.6049C＞T (p.Q2017*)變異在耳聾相關(guān)臨床病例中被報(bào)道過(guò)[10]。該變異為罕見(jiàn)無(wú)義變異，無(wú)義變異使得翻譯提前終止，產(chǎn)生截短蛋白。該變異符合PVS1（同前）+PM2（同前）+PM3（PMID：23767834[10]），可判定為致病。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T復(fù)合雜合變異導(dǎo)致Usher綜合征I型的家系。c.3631-1G＞C新變異豐富了MYO7A基因突變譜。本研究為該家系患者明確了臨床診斷，為后續(xù)的遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前診斷或植入前遺傳學(xué)診斷提供了依據(jù)。