李林珂 耿佳 申恬 鐘鳴駿 熊文羽 趙海燕 盧宇, 袁慧軍 劉世喜 孫藝

作者單位：1 四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 成都 610041

2 四川大學(xué)華西醫(yī)院罕見病研究院 成都 610041

3 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心 重慶 400038

4 中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 武漢 430070

耳聾是臨床上常見的影響人類身心健康的疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，接近5億的人口患有不同程度的聽力損失。我國現(xiàn)有聽力殘疾患者2780萬人，僅次于肢體殘疾[1]。耳聾病因復(fù)雜，遺傳因素是最主要的致病因素，約占60%[2]。遺傳性耳聾可分為非綜合征型耳聾和綜合征型耳聾。截至2021年，遺傳性耳聾網(wǎng)站（hereditaryhearingloss.org）已收錄遺傳性非綜合征型耳聾基因123個。綜合征型耳聾種類繁雜，目前已報道400余種。綜合征型耳聾除耳聾的臨床表現(xiàn)，還存在其他器官或系統(tǒng)異常。臨床常見的綜合征型耳聾包括Usher綜合征、Waardenburg綜合征、Alport綜合征等。

本文通過對兩個因感音神經(jīng)性耳聾就診的先證者進(jìn)行臨床表現(xiàn)分析，對這兩個家系的樣本進(jìn)行已知耳聾基因二代測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，確定兩個家系的致病基因突變位點分別為GATA3的c.186dup和c.835_836dup雜合變異，從而診斷為甲狀旁腺功能減退-感音神經(jīng)性耳聾-腎發(fā)育不良綜合征（hypoparathyroidism-sensorineural deafnessrenal dysplasia，HDR）。目前這兩個突變尚未有文獻(xiàn)報道。

1 材料與方法

1.1 家系資料的采集

兩家系來自湖北省，編號分別為HL-011154和HL-011258。兩家系病史、臨床信息及樣本均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心采集，并經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)，簽署知情同意書。

1.2 測序及變異位點分析

使用課題組自主設(shè)計的目標(biāo)區(qū)域捕獲試劑盒HHL-158檢測，該試劑盒覆蓋目前已知耳聾基因共158個。目標(biāo)區(qū)域涵蓋158個基因的外顯子，外顯子上下游50 bp及線粒體DNA序列。使用BWA軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)與GRCh37/hg19比對，使用GATK和VEP工具對變異進(jìn)行注釋，最小等位基因頻率以0.5%進(jìn)行變異過濾。使用SIFT、Polyphen-2、LRT、MutationTaster、PhyloP、GERP++等進(jìn)行變異對蛋白功能影響預(yù)測。

1.3 Sanger測序

針對檢出的GATA3基因突變位點設(shè)計驗證引物，對已采集樣本的家系成員進(jìn)行Sanger測序驗證。通過Mutation-Surveyor軟件進(jìn)行序列比對，分析檢出變異是否符合家系表型和基因型共分離。

1.4 致病性分析

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（the American college of medical genetics and genomics，ACMG）遺傳性聽力損失判讀指南[3]，對檢測出的GATA3突變位點進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 HL-011154家系資料和相關(guān)表型描述

HL-011154為一散發(fā)耳聾病例，家庭共3人（圖1A）。先證者父母I-1、I-2否認(rèn)近親結(jié)婚。父母訴先證者II-1在1歲時因發(fā)燒時用藥后出現(xiàn)聽力下降（具體藥物不詳）。8歲時第一次測聽雙耳重度感音神經(jīng)性耳聾，20歲時測聽雙耳中-重度感音神經(jīng)性耳聾，緩降型，高頻損害為主（圖1B），余未見明顯異常。I-1及I-2自訴體健、聽力正常。

2.2 HL-011258家系資料和相關(guān)表型描述

HL-011258為一散發(fā)耳聾病例，家庭共3人（圖1C）。先證者父母I-1、I-2否認(rèn)近親結(jié)婚。父母訴先證者II-1在2歲時雙耳聽力差，1歲時會說話，言語清晰。1歲多因發(fā)燒曾使用慶大霉素治療，具體不詳。4歲時第一次測聽雙耳中度感音神經(jīng)性耳聾，9歲時測聽雙耳中-重度感音神經(jīng)性耳聾，緩降型，高頻損害為主（圖1D），余未訴明顯異常。I-1及I-2自訴體健、聽力正常。

2.3 致病基因鑒定

對兩家系先證者進(jìn)行測序分析，并使用軟件進(jìn)行注釋、過濾后，在已知耳聾基因中均檢出了GATA3基因雜合變異。HL-011154先證者II-1為GATA3基因NM_002051.2：c.186dup（NP_002042.1：p.Tyr63Leufs*240）雜合變異。HL-011258家系先證者II-1為GATA3基因NM_002051.2：c.835_836dup（NP_002042.1：p.Gly280Argfs*15）雜合變異。gnomAD數(shù)據(jù)庫中均未見報道。

圖1 A：HL-011154家系圖；B：HL-011154先證者聽力曲線；C：HL-011258家系圖；D：HL-011258聽力曲線

2.4 Sanger測序結(jié)果

Sanger測序驗證HL-011154家系先證者II-1及HL-011258家系先證者II-1分別為GATA3基因c.186 dup和c.835_836dup雜合突變。通過HL-011258家系父母樣本檢測，結(jié)合先證者聽力表型，c.835_836dup為新發(fā)突變。HL-011154家系父親提供樣本，母親未提供樣本無法進(jìn)行檢測。Sanger測序見圖2。

3 討論

本研究，報道了2個因感音神經(jīng)性耳聾的就診的散發(fā)病例。通過高通量測序在這兩個家系中分別鑒定出GATA3基因兩個新的致病性變異c.186dup和c.835_836dup。根據(jù)ACMG指南進(jìn)行致病性分析，位于2號外顯子的移碼變異（c.186dup，p.Tyr63Leufs*240）致使位于第一個反式激活結(jié)構(gòu)域（transactivating domain 1，TA1）之前高度保守的Tyr63突變?yōu)長eu63，引起240個氨基酸變化，導(dǎo)致多肽鏈的提前終止（PVS1），在HL-011154家系中該變異推測為新發(fā)突變（PS2），該突變位點gnomAD數(shù)據(jù)庫人群頻率未見報道（PM2），故將此變異判定為“致病變異”。位于4號外顯子的移碼變異（c.835_836dup，p.Gly280Argfs*15）致使位于第一個鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger domain 1，ZnF1）上高度保守的Gly280突變?yōu)锳rg280，引起15個氨基酸變化，導(dǎo)致多肽鏈的提前終止（PVS1），在HL-011258家系中該變異推測為新發(fā)突變（PS2），該突變位點gnomAD數(shù)據(jù)庫人群頻率未見報道（PM2），突變與聽力表型在該家系中共分離（PP1），也將此變異判定為“致病變異”。

GATA3基因位于染色體10p14，包括6個外顯子[4]，編碼443個氨基酸（NM_002051.2）。GATA3蛋白屬于參與胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育中的甲狀旁腺、內(nèi)耳和腎臟中表達(dá)，同時在胸腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和T細(xì)胞發(fā)育中起重要作用[5，6]。GATA3蛋白包含N端的2個反式激活結(jié)構(gòu)域（TA1，TA2）和C端的2個鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnF1，ZnF2）。ZnF2可以特異性識別DNA中的N-(A/T)GATA(T/G)-C序列，并與之結(jié)合[7]。ZnF1則穩(wěn)定ZnF2與DNA的結(jié)合，并與多種鋅指蛋白相互作用[8]。GATA3是目前唯一已知與HDR綜合征相關(guān)的基因，其單倍劑量不足被認(rèn)為是導(dǎo)致HDR綜合征的潛在病因[9]，但也有文獻(xiàn)報道GATA3過表達(dá)和顯性負(fù)效應(yīng)可引起HDR綜合征的機(jī)制[10，11]。Ali等[12]基于HDR綜合征將突變引起的功能異常分為三類：第一類是由于涉及ZnF2的突變導(dǎo)致DNA結(jié)合能力缺失，這類突變占GATA3的突變突變的90%以上突變類型；第二類是涉及ZnF1的突變導(dǎo)致DNA結(jié)合位點的親和力下降；第三類是雖然未改變正常的DNA結(jié)合點和親和力，但由于結(jié)合過程中DNA雙螺旋構(gòu)象的變化，最終導(dǎo)致與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合力降低[6]。既往文獻(xiàn)共報道124個家系中93種不同GATA3突變，在這124個家系中，40%為移碼突變，23%為錯義突變，14%為無義突變，6%為剪接位點突變，1%為框內(nèi)突變，15%為全基因組缺失，1%為全基因組重復(fù)[13]。93種突變分散在GATA3基因上，無明顯突變熱點。其中約50%的突變?yōu)榘l(fā)生在日本人群中的新發(fā)變異。本研究中，c.186dup在Tyr63發(fā)生框移，致使GATA3蛋白丟失后續(xù)結(jié)構(gòu)域。c.835_836dup在Gly280（處于ZnF1）上發(fā)生框移，導(dǎo)致部分ZnF1改變，ZnF2丟失。這兩家系中的結(jié)果均為GATA3基因框移突變后發(fā)生提前截短，引起GATA3結(jié)構(gòu)域丟失，從而DNA的結(jié)合能力缺失。

圖2 A：HL-011154先證者Sanger測序圖譜；B：HL-011154父親Sanger測序圖譜；C：HL-011258先證者Sanger測序圖譜；D：HL-011258父親Sanger測序圖譜；E：HL-011258母親Sanger測序圖譜

HDR綜合征主要表現(xiàn)為甲狀旁腺激素分泌不足、感音神經(jīng)性耳聾和腎發(fā)育不良[14]。甲狀旁腺激素分泌不足表現(xiàn)為有癥狀或無癥狀的低鈣血癥，發(fā)病率93.3%。腎發(fā)育不良包括腎發(fā)育缺乏、異型增生等，發(fā)病率約72.2%[15]。感音神經(jīng)性耳聾是最為顯著的特征，占96.7%，表現(xiàn)為雙側(cè)早發(fā)性中-重度聽力下降，高頻損害為主，且隨年齡增長逐漸加重，聽力曲線呈平坦型或緩降型[16，17]。HDR綜合征臨床表現(xiàn)具有明顯異質(zhì)性，囊括HDR綜合征三個代表性特征的病例占64.4%，然而僅表現(xiàn)感音神經(jīng)性耳聾占0.6%。本研究中兩先證者均表現(xiàn)為孤立性感音神經(jīng)性耳聾，耳聾特征與既往文獻(xiàn)報道相似，且未發(fā)現(xiàn)明顯的低甲狀旁腺激素相關(guān)表現(xiàn)及腎臟相關(guān)異常。與c.835_836dup突變類似，Belge等[18]報道一例錯義突變同樣涉及ZnF1的病例（c.856A＞G），該患者也僅表現(xiàn)為孤立性感音神經(jīng)性耳聾，表明在涉及結(jié)構(gòu)域的突變可能會造成實質(zhì)性的病癥。HL-011154和HL-011258家系中患者分別于20歲和9歲時接受HDR綜合征相關(guān)表型檢查，目前暫未發(fā)現(xiàn)低甲狀旁腺激素相關(guān)表現(xiàn)及腎臟相關(guān)異常，可能這與患者發(fā)病年齡相關(guān)，相關(guān)病癥尚未得到外顯。

本研究報道了2個僅表現(xiàn)為感音神經(jīng)性耳聾的HDR綜合征的新發(fā)變異患者。強調(diào)盡管HDR綜合征的表型存在差異，但早期特異性診斷非常重要。對于在有家族史的同一家系中，建議進(jìn)行嚴(yán)密的血鈣檢測和腎臟彩超檢測，并進(jìn)行基因遺傳咨詢。對于同時存在兩個或兩個以上典型特征的患者，HDR綜合征很容易被診斷出。但表現(xiàn)為孤立性感音神經(jīng)性耳聾的患者，易被忽視。常規(guī)的新生兒聽力篩查雖然可以早期檢測，但HDR綜合征耳聾并不一定表現(xiàn)為先天性。因此，在排除獲得性或其他遺傳因素情況下，孤立性感音神經(jīng)性耳聾患者可以考慮進(jìn)行GATA3基因檢測。建議將GATA3基因納入高通量測序基因組篩查中，可以將不完全外顯的病例中早期識別出，從而提高耳聾致病基因檢出率，減少新生聽障兒童的出生率，減輕家庭和社會負(fù)擔(dān)。