★羅紅麗 王舒慧 杜清 管詠梅

（1.焦作市中醫(yī)院藥劑科 河南 焦作 454002；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實驗室 南昌 330004）

骨關(guān)節(jié)疼痛是由局部關(guān)節(jié)軟骨勞損和周圍關(guān)節(jié)滑膜持續(xù)性炎癥引起的，與飲食、生活環(huán)境等密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，常見的關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、肩周炎等各類原因引起的骨關(guān)節(jié)疼痛均可歸屬于“痹證”范疇［1］。中醫(yī)在“痹證”的治療上早有先例。在《金匱要略》就出現(xiàn)了對關(guān)節(jié)疼痛的論述，認(rèn)為引起關(guān)節(jié)疼痛的主要病機(jī)病因是風(fēng)寒濕邪侵襲機(jī)體，主要治法為祛風(fēng)、除寒、除濕［2］。中藥復(fù)方對骨關(guān)節(jié)疼痛尤其是慢性疼痛具有獨(dú)特的療效，如湯劑烏頭湯、半夏瀉心湯［3］，中成藥制劑東樂膏［4］等，而中藥外用能使藥物在特定部位透過皮膚直達(dá)關(guān)節(jié)部位，有利于提高局部藥物濃度，與口服給藥比較，外用制劑更安全、能更好的保證療效。

藏藥骨關(guān)節(jié)止痛方為中醫(yī)臨床基本理論為指導(dǎo)臨床常用方，由唐古特烏頭、川芎、乳香、沒藥等組成，具有活血散結(jié)、止痛消腫作用，臨床常現(xiàn)用現(xiàn)配，存在極易污染衣物、使用不便、劑量不準(zhǔn)確、黏附力差、療效不穩(wěn)定等問題。凝膠貼膏劑是以水溶性高分子材料為骨架材料，與中藥或其提取物混勻后涂布于背襯材料上制備而成［5-6］。該劑型不但可以控制藥物進(jìn)入體內(nèi)的速率，維持平穩(wěn)的血藥濃度，起到長效、緩釋作用，還可以降低處方中烏頭的毒副作用，還可以直達(dá)患處發(fā)揮藥效，提高角質(zhì)層水化作用有利于藥物透皮吸收等作用［7］。為此，本研究擬將止痛方制備成凝膠貼膏劑，以期為臨床提供給藥劑量準(zhǔn)確、安全有效、臨床順應(yīng)性好的制劑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CZY-G初黏性測試儀（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司）；CZY-6S持粘性測試儀（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司）；BLD-200N電子剝離試驗機(jī)（濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司）；Anton Paar MCR101流變儀（Anton Paar公司）；攪拌器（德國IKA EUROSTAR digital儀器公司）；Anton Paar MCR101流變儀（Anton Paar公司）；攪拌器（德國IKA EUROSTAR digital儀器公司）；安捷倫7890A GC（Agilent，美國）；Sartorius BS124S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥 Viscomate NP-700（由國際特品ISP上海分公司提供）；甘羥鋁（批號：SG-0344，日本協(xié)和化學(xué)有限公司）；甘油（陜西太白山制藥有限公司）；檸檬酸、無水乙醇（西隴化工股份有限公司）；CMC-Na（上海山浦化工有限公司）；PEG400（西隴化工股份有限公司）；甘羥鋁（批號：SG-0344，日本協(xié)和化學(xué)有限公司）；聚氧乙烯氫化蓖麻油40（德國BASF公司；肉豆蔻酸異丙酯（中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；醋乳香（批號190329，江西江中中藥飲片有限公司）；醋沒藥（批號191227，江西江中中藥飲片有限公司）；蜀椒（批號190314，江西江中中藥飲片有限公司）；川芎飲片（批號190108，江西江中中藥飲片有限公司）；人工麝香（批號：2018VR116，北京聯(lián)鑫藥業(yè)有限公司）；Viscomate NP-700（由國際特品ISP上海分公司提供）；雙蒸水（自制）。

2 實驗及結(jié)果

2.1 提取液的制備 將處方中川芎采用10倍量60 %乙醇提取3次，每次2 h，提取液濃縮至一定體積（相當(dāng)于川芎飲片1 g/mL）；唐古特烏頭采取30倍量的0.1 mol/L的鹽酸水浸漬12 h后，浸漬液濃縮至一定體積（相當(dāng)于生藥材1 g/mL）；乳香、沒藥混合揮發(fā)油則通過水蒸氣蒸餾法提取，適量乙醇溶解，加入相應(yīng)處方量的人工麝香、川芎及唐古特烏頭濃縮液、冰片等，即得。

2.2 凝膠貼膏劑的制備 將甘油、Viscomate NP-700、CMC-Na、PEG400混合，攪拌均勻，將冰片溶解于處方量的的無水乙醇后邊攪拌邊加入，得到A相；稱取甘羥鋁與檸檬酸，將藥材提取液分次邊攪拌邊加入，混勻后，加入揮發(fā)油及少量乙醇溶解的人工麝香，攪拌均勻，得到B相。將A、B兩相混合攪拌均勻，涂布于無紡布背襯上，蓋上保護(hù)膜，密封保存。

2.3 評價方法［8-10］凝膠膏劑的質(zhì)量評價多采用初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度和感官評價作為評價指標(biāo)。本實驗以理化指標(biāo)初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度為主要指標(biāo)，五項評定標(biāo)準(zhǔn)最后得分總和為總分進(jìn)行比較確定最佳參數(shù)。

2.3.1 初黏力試驗按照2020版《中國藥典》(四部)通過初黏性測試儀進(jìn)行評價，使用不同大小鋼球從15°高的鋪有凝膠貼膏劑的斜板上表面滾過，鑒定初粘力的性能需將最大鋼球能否粘住作為標(biāo)準(zhǔn)。以基質(zhì)粘住的最大號鋼球為20分，小一號球的則減1分，按此計分方式計算得分。

2.3.2 持黏性試驗取一片凝膠貼膏劑，將具有黏性的一面膏體粘貼在試驗不銹鋼板表層，沿著凝膠貼膏劑長度的方向，將要求質(zhì)量的砝碼掛在鋼板的一端上，讀取凝膠貼膏劑滑移直到掉落在底部所需要的時間并且記錄。以記錄到最長時間為20分，其它則按比例評分。

2.3.3 剝離強(qiáng)度試驗取凝膠貼膏劑1片，用具有粘性的膠條將背襯固定在試驗板上，將無紡布兩端上、下固定在儀器上，以（300±10）mm/min速度進(jìn)行實驗，讀取并記錄剝離強(qiáng)度（N）。把測定的最大值記為20分，其它則按比例評分。

2.3.4 賦形性試驗取一片置于穩(wěn)定試驗箱中40 min（溫度：40 ℃，濕度：64 %），放置之后取出，放在與水平面呈60°角的平整鋼板上24 h，記錄膏體表面是否有變形、滑落現(xiàn)象。根據(jù)流淌現(xiàn)象評分為20、15、10、5、0分。

2.3.5 綜合感官評分使用盲法評分法對皮膚膜殘留、皮膚追隨性、膏體性狀和透布程度對凝膠貼膏劑進(jìn)行評判。（1）皮膚追隨性：將空白凝膠貼膏劑貼于成人手背表面，均勻用力甩動，進(jìn)行3次平行實驗，一次都都沒有掉落的處方記為滿分；（2）膏體性狀：膏體軟硬適中，光滑且細(xì)膩、不含氣泡者為滿分；（3）皮膚膜殘留：將凝膠貼膏劑從皮膚表面掀開后，皮膚表面無殘留、凝膠貼膏劑膏面不破損者為滿分；（4）透布程度：眼睛觀察無透布現(xiàn)象者為滿分。每個項目滿分5分，分?jǐn)?shù)按照等級依次計5、4、3、2、1分。

2.4 單因素試驗 固定基質(zhì)中其他成分的用量不變，改變1種成分的用量，并按“2.2”項下方法制備貼膏劑。進(jìn)行初、持粘性、剝離強(qiáng)度、賦形性測定，記錄相應(yīng)基質(zhì)的得分，優(yōu)選每個因素的最佳用量范圍。單因素試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。結(jié)果表明，影響成型的主要因素有NP-700、CMC-Na、甘油用量，各基質(zhì)的最佳用量范圍分別為Viscomate NP-7001～5 g， CMC-Na 0.5～1.5 g，甘油 15～25 g，檸檬酸1.5～2.0 g，甘羥鋁0.1～0.5 g。

表1 單因素篩選結(jié)果

2.5 Box-Behnken試驗

2.5.1 考察因素與水平經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)Viscomate NP-700、甘油以及CMC-Na對基質(zhì)有著較大影響?？疾焖皆敿?xì)見表2。

表2 試驗因素與編碼

2.5.2 Box-Behnken中心組合優(yōu)化通過Design-Expert軟件安排試驗（見表3），制備凝膠基質(zhì)，對其進(jìn)行初、持黏性、剝離強(qiáng)度、賦形性測定和綜合感官評分，五項評定標(biāo)準(zhǔn)最后得分總和為總分，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化出最佳基質(zhì)配方。

表3 Box-Behnken中心組合試驗方案與結(jié)果

2.5.3 數(shù)據(jù)處理根據(jù)實驗結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行二次多項式逐步回歸擬合，得到模型為：

Y=-269.74-32.5775A+35.18967B+96.46333C +0.71AB+0.84AC-2.344BC+3.08583A2-0.4897B2-27.87667C2，模型各項方差結(jié)果見表4，試驗?zāi)Ｐ蛽碛酗@著性（P＜0.05）。B對基質(zhì)影響明顯（P＜0.01）；模型BC的P值小于0.05，說明B、C間有著互相關(guān)聯(lián)的作用。R=0.9865，說明該模型可以準(zhǔn)確對響應(yīng)值改變進(jìn)行擬合，且擬合度良好。能夠用此模型來探究和推測處方結(jié)果，各因素的互相關(guān)聯(lián)結(jié)果見圖1。

表4 回歸模型各項方差分析

圖1 AB(A)、AC(B)、BC(C)對基質(zhì)影響的預(yù)測效應(yīng)面圖

2.5.4 優(yōu)化處方驗證各條件因素的交互作用和對得分的影響，均可以通過回歸方程直接客觀地表示出來，其中擬合曲面的最大值就是凝膠貼膏劑基質(zhì)最佳處方，為NP-7003.97 g、CMC-Na 0.9 g、甘油21.68 g?？紤]到實際操作，將理論值修正為：甘油22 g、水65 g、無水乙醇35 g、PEG4004 g、甘羥鋁0.7 g、檸檬酸1.5 g、羧甲基纖維素鈉0.9 g、NP7004 g。按上述處方制備3批樣品，該處方的凝膠貼膏劑膏體表面光滑無氣泡，黏附力各方面良好，沒有膜殘留，均勻性等其他屬性均相對優(yōu)秀，表明該模型建立的方程可靠。

2.6 凝膠貼膏劑的成型研究

2.6.1 提取液與處方輔料的添加順序凝膠貼膏劑基質(zhì)的形成必須經(jīng)過交聯(lián)反應(yīng)才能成型，為了得到均一的基質(zhì)，藥材提取液需在交聯(lián)反應(yīng)完成之前加入，因此將處方量的甘油、Viscomate NP-700、CMCNa、PEG400，攪拌均勻，將冰片溶解于處方量的的無水乙醇后邊攪拌邊加入，得到A相；稱取處方量的甘羥鋁與檸檬酸，將藥材提取液分次邊攪拌邊加入，混勻后，加入揮發(fā)油及少量乙醇溶解的人工麝香，攪拌均勻，得到B相。將A、B兩相混合攪拌直至膏體形成，凝膠貼膏劑基質(zhì)成型時呈棕色均一，具有芳香性且其鋪展性良好，說明藥材與基質(zhì)有著良好的相容性。

2.6.2 基質(zhì)載藥量研究采用流變儀測定不同載藥量基質(zhì)的粘彈性參數(shù)，從微觀的角度研究基質(zhì)載藥量與粘彈性的關(guān)系，從而確定基質(zhì)的最佳載藥量。從圖2-3可知，隨著加入不同量的藥材提取液，凝膠貼膏劑基質(zhì)的G*和η*均比空白基質(zhì)增加，當(dāng)載藥量為36.0 %時(相當(dāng)于載75g藥材量)，G*和η*最高，隨后增加藥材用量，其G*和η*顯著下降，甚至低于載藥量32.0 %(相當(dāng)于載65 g藥材量)，說明藥材提取液的加入在一定程度上增加了基質(zhì)的粘彈性，當(dāng)載藥量為36.0 %時，G*和η*達(dá)到較高值，繼續(xù)增加藥材提取液的用量，基質(zhì)的粘彈性下降，對凝膠貼膏劑的粘附性有較大影響，因此基質(zhì)的載生藥量為36.0 %時較為適宜。

圖2 不同載藥量凝膠貼膏劑的復(fù)數(shù)模量變化圖

圖3 不同載藥量凝膠貼膏劑的復(fù)數(shù)粘度變化圖

3 凝膠膏劑透皮行為研究

3.1 HPLC方法學(xué)研究

3.1.1 色譜條件色譜柱：菲羅門C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇：1 %冰醋酸（64∶36），流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長320 nm。

3.1.2 對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸、藁本內(nèi)酯對照品9.60，7.43 mg置于容量瓶中，加甲醇配成含有阿魏酸、藁本內(nèi)酯7.680，8.916 μg·mL-1的混合對照品溶液。

3.1.3 專屬性考察取24 h接受液、空白接受液、阿魏酸及藁本內(nèi)酯混合對照品溶液按已建立的HPLC色譜條件進(jìn)樣，如圖4。結(jié)果顯示，空白接受液對測定無干擾。

圖4 典型色譜圖

3.1.4 線性關(guān)系考察按“3.1.2”項下方法制備混合對照品溶液，分別進(jìn)樣20，15，10，6，3，1 μL，按本文已建立的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，求得阿魏酸、藁本內(nèi)酯的線性方程，結(jié)果見表4。

表4 線性關(guān)系

3.1.5 精密度考察取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果阿魏酸、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.143 %、1.178 %，結(jié)果表明該色譜儀具有良好的精密度。

3.1.6 穩(wěn)定性試驗取同一接受液分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，計算阿魏酸的峰面積RSD值為0.81 %，藁本內(nèi)酯的RSD值為1.59 %，說明接受液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.7 回收率實驗取已知含量的24 h接受液1 mL，精密加入對照品溶液1 mL，渦旋混合，取適量注入色譜儀，結(jié)果顯示阿魏酸的平均回收率為93.8 %，RSD值為2.149 %，藁本內(nèi)酯的平均回收率為97.4 %，RSD值為6.37 %，說明該方法符合要求。

3.2 離體小鼠皮膚的制備和處理 取適宜小鼠，將其腹部毛剪凈，后脫頸椎處死，用眼科剪將小鼠背部皮膚分離，并將其于干凈的玻璃板上平鋪，便于用棉花蘸取生理鹽水去除皮下脂肪和黏液組織去，后洗凈，用無菌生理鹽水將無破損的完整皮膚沖洗數(shù)次，直至將皮膚洗白為止，用鋁箔紙包裹，于-20 ℃冰箱中保存，備用。實驗前自然恢復(fù)至室溫，并檢查鼠皮的完整性，應(yīng)保證使用的皮膚無任何破損。

3.3 體外透皮實驗 采用改良Franz擴(kuò)散池，剪取處理好的小鼠皮膚放置于擴(kuò)散池與接收池間，夾緊，往接收池中加入接受液（乙醇-生理鹽水，3∶7），排氣泡，使內(nèi)皮層能與接受液充分完全接觸，保持恒溫與150 r·min-1，平衡0.5 h。準(zhǔn)確稱取適量凝膠膏體，使其完全貼于小鼠皮膚表面，更換接收液，保持轉(zhuǎn)速與溫度，分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h取樣1 mL(并補(bǔ)加等體積接受液)，再以0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液進(jìn)樣，以“3.1.1”項下建立的色譜條件測定接受液中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量，并計算單位面積累計釋放量Q（μg/cm2）。實驗平行6份。

3.4 透皮實驗結(jié)果 藥物的累積透皮量Qn的計算公式如下：

其中，A-有效擴(kuò)散面積（cm2），V-接受液總體積（mL），Cn為第n次取樣時接受液中藥物的質(zhì)量濃度（μg/mL），Ci為第i次取樣時接受液中藥物的質(zhì)量濃度（μg/mL），Vi為取樣體積（mL）；以藥物的累積透過量Q（mg·cm-2）為縱坐標(biāo)，時間t（h）為橫坐標(biāo)，并對Q-t進(jìn)行模型擬合，同時對曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率 Js（μg·cm-2·h-1），由結(jié)果可知，凝膠貼膏劑中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的24 h累計透過量分別為75.56 μg/cm2、125.39 μg/cm2，滲透速率分別為3.291 μg·cm-2·h-1、5.394 μg·cm-2·h-1，從表5-6可知，該凝膠貼膏劑釋藥符合零級動力學(xué)擬合方程。

表5 凝膠貼膏劑中二種成分的平均累積經(jīng)皮滲透量Q（，n=6）

表5 凝膠貼膏劑中二種成分的平均累積經(jīng)皮滲透量Q（，n=6）

時間/h 阿魏酸Q/μg·cm-2 藁本內(nèi)酯Q/μg·cm-2 10.98±0.27 1.87±0.9823.87±0.84 9.42±3.0349.73±1.71 22.25±4.58617.15±2.25 35.25±5.12824.67±3.03 48.27±5.7610 32.07±3.77 60.23±6.9712 39.14±5.24 73.11±7.9224 75.56±4.36 125.39±12.90

4 討論

本研究采用Box-Behnken試驗設(shè)計法對空白基質(zhì)進(jìn)行篩選，優(yōu)化出最佳基質(zhì)處方。Box-Behnken實驗設(shè)計法能對3～7個影響因素，在少量的實驗次數(shù)下，優(yōu)化出最佳的實驗方法。以初、持黏性等物理性質(zhì)評價和感官評價為測定項目，通過單因素實驗，選取Viscomate NP-700、CMC-Na、甘油進(jìn)行處方篩選，因為多元線性回歸擬合方程能客觀地反應(yīng)成分間的交互作用和對響應(yīng)值變化預(yù)測，因此凝膠貼膏劑基質(zhì)最佳處方為無水乙醇∶CMC-Na∶甘油：PEG400∶甘羥鋁∶檸檬酸∶NP700∶水（3.5∶0.09:2.2∶ 0.4∶0.07∶0.15∶0.4∶6.5）。該處方的凝膠貼膏劑膏體表面光滑無氣泡，黏附力各方面良好，沒有膜殘留，均勻性等其他屬性均相對優(yōu)秀，能滿足后續(xù)制劑的制備。

表6 凝膠膏劑二種成分的體外滲透線性方程及參數(shù)

制劑的載藥量關(guān)乎著給藥量的多少，在外用貼膏劑中，給藥面積一般是固定不變的，因此在不改變基質(zhì)性能的前提下，需要提高載藥量進(jìn)而增加藥效。凝膠貼膏劑作為一種半固體制劑，其粘彈性是常用來衡量內(nèi)部基質(zhì)性能改變的重要流變學(xué)參數(shù)。本實驗嘗試著采用流變儀測定不同載藥量基質(zhì)的粘彈性參數(shù)，從微觀的角度研究基質(zhì)載藥量與粘彈性的關(guān)系，從而確定基質(zhì)的最佳載藥量。

對藏藥止痛凝膠貼膏劑進(jìn)行離體透皮實驗，結(jié)果顯示凝膠貼膏劑中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的24 h累計透過量分別為75.56 μg/cm2、125.39 μg/cm2，滲透速率分別為3.291 μg·cm-2·h-1、5.394 μg·cm-2·h-1，透皮效果良好，且給藥方便，劑量均勻，能滿足外用制劑的要求，可為臨床提供相應(yīng)制劑奠定基礎(chǔ)。