郭慧靜，陳國剛，趙志永

（1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子 832000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

0 引言

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz） 是一種藥食同源的多年生草本植物，為菊科蒲公英屬，又名華花郎、婆婆丁等[1]。蒲公英是一味傳統(tǒng)的中草藥，其花、葉、根均可入藥，具有清熱解毒、消腫散瘀、排毒利尿等功效[2]。有研究結(jié)果表明，蒲公英全草中含有甾醇類、香豆素類、多酚類、黃酮類及糖類等多種功能成分[3-4]。其中，多糖作為蒲公英功能成分的重要組成之一具有重要的研究價值。已有報道指出，蒲公英多糖具有較強的抗氧化活性[5]和抗菌活性[6]，此外還可以顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和吞噬指數(shù)等，并促進免疫器官的生長發(fā)育，從而增強小鼠的免疫功能[7]。石丹等人[8]研究發(fā)現(xiàn)蒲公英多糖還可以改善林可霉素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群失調(diào)，表明其具有微生態(tài)調(diào)節(jié)的作用。以上研究集中在蒲公英多糖的藥理活性方面，對于其成分及結(jié)構(gòu)方面的報道還相對較少，高金波等人[9]采用柱前衍生化法測定蒲公英多糖中的單糖組成，表明主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成。Chen M 等人[10]經(jīng)陰離子柱和凝膠柱分離純化蒲公英多糖得到一個均一的水溶性多糖組分，該組分的分子量為80 kDa，單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖。

目前，對蒲公英多糖提取方法的研究較多，而有關(guān)醇沉分級純化蒲公英多糖及不同組分的成分、結(jié)構(gòu)和生物活性的報道還相對較少。為了進一步探究蒲公英多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性，試驗利用分級醇沉的方法對超聲輔助提取得到的蒲公英多糖進行純化分級，得到相應(yīng)的多糖組分，測定不同組分的糖含量、蛋白質(zhì)含量及糖醛酸含量等理化指標(biāo)，并采用GC-MS 分析各組分的單糖組成，并比較各組分的體外降血糖和抗氧化活性，篩選出活性較高的組分，為蒲公英多糖的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蒲公英全草，采自新疆哈密地區(qū)，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院韓博教授鑒定為菊科蒲公英屬植物。將原料洗凈，置于50 ℃烘箱中干燥，備用。α - 葡萄糖苷酶、考馬斯亮藍G-250，上海源葉生物技術(shù)有限公司提供；PNPG，上海寶曼生物科技有限公司提供；牛血清蛋白，美國AMRESCO 公司提供；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma 公司提供；濃硫酸、苯酚、吡啶、咔唑、維C、無水乙醇、鄰苯三酚、1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三氟乙酸、醋酸酐等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，榮華儀器制造（江蘇） 有限公司產(chǎn)品；KQ-200VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Multifuge X1R 型高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；DGG-9053AD 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；RE-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FDU-1200 型冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2600 型紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司產(chǎn)品；Nicolet iS10 型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；QP2010 型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒲公英多糖提取工藝流程

蒲公英原料→烘干→粉碎過篩→脫色、脫脂→超聲處理→熱水浸提→抽濾、濃縮→乙醇沉淀→蒲公英粗多糖→分級醇沉→冷凍干燥→蒲公英多糖不同醇沉組分。

1.3.2 蒲公英多糖的分級醇沉

將得到的蒲公英多糖配制成10%的多糖溶液，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，去除不溶性雜質(zhì)。在溶液中加入無水乙醇，使得其體積分?jǐn)?shù)達到20%，于4 ℃冰箱中放置12 h，離心分離收集多糖獲得20%醇沉組分。在上清液中繼續(xù)加入無水乙醇，使得乙醇體積分?jǐn)?shù)達到40%，4 ℃下醇沉過夜，離心分離獲得40%多糖組分。按照上述方法，依次得到20%，40%，60%，80%的多糖醇沉組分。所得沉淀用蒸餾水透析72 h，透析液蒸發(fā)濃縮后進行冷凍干燥，得到不同多糖組分（依次為PD-20，PD-40，PD-60 和PD-80）。

1.3.3 不同組分化學(xué)組成分析

采用苯酚- 硫酸法[11]對不同組分總糖含量進行測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長490 nm 處測定糖含量，以葡萄糖質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.015 5X-0.009 8，R2=0.999 6。采用考馬斯亮藍G-250 法[12]測定蛋白含量。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長595 nm 處測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.006 2X+0.010 9，R2=0.999 2。采用硫酸- 咔唑法[13]測定糖醛酸含量。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，于波長530 nm 處測定糖醛酸含量，以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=4.586 5X-0.029 6，R2=0.999 7。

1.3.4 不同組分單糖組成分析

稱取3 mg 待測多糖樣品溶解于2 mol/L 三氟乙酸中，在溫度120 ℃下水解2 h 后用甲醇反復(fù)蒸發(fā)除去三氟乙酸，殘基溶于蒸餾水中并在室溫下用硼氫化鈉還原3 h，加適量冰醋酸中和過量的硼氫化鈉。中和后蒸發(fā)至干，殘渣用乙酸酐在100 ℃下乙?；? h，冷卻后加入甲苯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的醋酐。乙?；a(chǎn)物用3 mL 氯仿溶解，加入少量蒸餾水充分混合后除去上層水溶液，最后用無水硫酸鈉除去氯仿層的水分，定容至10 mL 后進行GC-MS 檢測。

GC-MS條件如下：RXI-5 SIL MS色譜柱（30 m×0.25 mm×25 μm）；升溫程序：起始溫度為120 ℃，以3 ℃/min 升到250 ℃，保持5min；進樣口和檢測器溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流速為1 mL/min。

1.3.5 光譜分析

參照Wang L 等人[14]方法，用蒸餾水配制2 mg/mL的多糖溶液，于波長200～400 nm 處進行紫外掃描，根據(jù)掃描圖判斷是否存在核酸及蛋白質(zhì)。參照Chen G等人[15]方法，稱取多糖待測組分各2 mg，加入100 mg烘干至恒質(zhì)量的KBr，置研缽中研磨均勻，用電動壓片機壓片，在4 000～400 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.3.6 抑制α - 葡萄糖苷酶活性測定

根據(jù)文獻[16]方法并稍加修改，取濃度為0.2 U/mL α - 葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液2 mL（pH 值6.8），于37 ℃下水浴15 min，加入樣品溶液反應(yīng)10 min 后再加入25 mmol/L PNPG 0.25 mL。水浴30 min 后，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液2 mL 終止反應(yīng)，于波長400 nm 處測定吸光度（A2）；以1 mL 緩沖液替代樣品溶液，測其吸光度值為（A0）；以0.1 mL 緩沖液替代酶液測其吸光值為（A1）。重復(fù)測定3 次，并以阿卡波糖為陽性對照。

此外，酶活力定義為溫度37 ℃，pH 值6.8 條件下，1 min 內(nèi)水解底物（PNPG） 產(chǎn)生1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.7 抗氧化活性測定

（1） 清除DPPH 自由基活性測定。參照Liu Y 等人[17]方法，稍加修改。依次移取質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的多糖溶液2 mL，分別加入0.1 mmoL DPPH - 乙醇溶液2 mL，混合均勻后常溫暗處反應(yīng)30 min。維C 溶液作陽性對照，于波長517 nm 處測定吸光值，并以下式計算清除能力：

式中：A2——DPPH 溶液和樣品混合物的吸光度；

A1——沒有添加DPPH 溶液樣品的吸光度；

A0——沒有添加樣品的DPPH 溶液的吸光度。

（2） 清除超氧陰離子活性測定。參照Bo J 等人[18]方法，略作修改。將50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液4.5 mL（pH 值8.2） 和0.2 mL 不同質(zhì)量濃度的多糖溶液在25 ℃下水浴20 min。加入25 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.2 mL，靜置反應(yīng)5 min 后立即加入0.1 mL HCl 溶液（10 mol/L） 終止反應(yīng)，并于波長320 nm處測定吸光度。以維C 作為陽性對照，并利用以下公式計算清除能力：

式中：A2——鄰苯三酚和樣品混合物的吸光度；

A1——未加鄰苯三酚的樣品吸光度；

A0——未加樣品的鄰苯三酚的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用3 次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用Excel 2010，SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級醇沉樣品化學(xué)組成分析

分級醇沉制備的蒲公英多糖樣品為淡黃色粉末，可溶于水，不溶于無水乙醇、甲醇等有機溶劑。

不同組分蒲公英多糖的化學(xué)組成見表1。

其中，PD-40 和PD-80 的總糖含量較高，且PD-80 最高，總糖含量達到64.41%，而PD-20 含量最低，為32.73%。4 個組分的糖醛酸含量沒有顯著差異，范圍為25%～30%。4 個組分的蛋白質(zhì)含量都較高，為17%～27%，差異不顯著，推測4 種組分多糖均為蛋白結(jié)合的復(fù)合物。由表1 可知，4 個組分中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)三者含量之和均達到90%，純度較高，可以用來進一步分析。

表1 不同組分蒲公英多糖的化學(xué)組成/%

2.2 分級醇沉樣品單糖組成分析

7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜結(jié)果見圖1。

圖1 7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜結(jié)果

由圖1 可知，這7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生物分離程度較好。通過GC-MS 檢測，分級醇沉所得的各組分蒲公英多糖的單糖組成分析結(jié)果。

不同組分蒲公英多糖的單糖組成物質(zhì)的量比見表2。

表2 不同組分蒲公英多糖的單糖組成物質(zhì)的量比/%

由表2 可知，4 種組分樣品所含有的單糖種類相同，均含有除了巖藻糖和木糖之外的其他5 種單糖，但單糖組成比例存在顯著差異。其中，各組分中葡萄糖含量最高，其次是阿拉伯糖，鼠李糖含量最低。

2.3 紫外光譜分析

不同組分多糖紫外掃描圖譜見圖2。

蒲公英多糖分級醇沉得到4 個組分在波長200～400 nm 經(jīng)紫外掃描后的結(jié)果。

圖2 不同組分多糖紫外掃描圖譜

由圖2 可知，這4 種樣品于波長260 nm 處均沒有吸收峰，表明4 種多糖均不含核酸，于波長280 nm處均有吸收峰，其中PD-20 吸收峰最明顯，這表明4 個組分中都含有蛋白質(zhì)，且PD-20 蛋白質(zhì)含量最高，這與2.1 化學(xué)組成分析中蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果基本一致。

2.4 紅外光譜分析

不同組分多糖紅外掃描圖譜見圖3。

圖3 不同組分多糖紅外掃描圖譜

由圖3可知，4 個組分的紅外光譜掃描圖十分相似，這表明4 個組分中的化合物組成及其分子結(jié)構(gòu)基本相同，這與組分的理化性質(zhì)及單糖組成測定結(jié)果基本一致。以PD-20 為例，其中3 423 cm-1左右寬而強的吸收峰是由O-H 伸縮振動引起的；2 924 cm-1左右的吸收峰是甲基或亞甲基C-H 伸縮振動引起的，而1 400～1 200 cm-1的一組吸收峰是C-H 變角振動形成的，以上3 個吸收峰為多糖的特征吸收峰[17]，由此可以初步判定PD-20～80 這4 個組分均為多糖。在1 636 cm-1左右的吸收峰由C=O 伸縮振動形成的，表明糖醛酸的存在；1 035 cm-1和1 077 cm-1左右的吸收峰是由C-N 伸縮振動形成的，由此可以推斷這4 個組分中均含有蛋白質(zhì)，這與化學(xué)組成分析和紫外掃描結(jié)果一致。圖中1 432 cm-1處的吸收峰是表明存在糖醛酸；890～1 200 cm-1的吸收峰是β - 吡喃型糖苷的特征吸收峰。

2.5 蒲公英多糖體外降血糖活性研究

不同組分多糖對α- 葡萄糖苷酶的抑制率見圖4。

圖4 不同組分多糖對α - 葡萄糖苷酶的抑制率

由圖4 可知，4 個組分多糖樣品在試驗濃度范圍內(nèi)均具有一定的α - 葡萄糖苷酶抑制能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制能力逐漸增強。此外，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，IC50值逐漸減小，表明抑制α -葡萄糖苷酶的能力逐漸增大，即PD-80＞PD-60＞PD-40＞PD-20。PD-80 的抑制能力最強，IC50為0.56 mg/mL（表3），多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時，抑制率達到70.05%?？赡苁怯捎诮?jīng)過分級醇沉，小分子物質(zhì)、色素等雜質(zhì)被脫除，對其功能基團影響變小，導(dǎo)致抑制α - 葡萄糖苷酶能力增強[19-20]。

不同組分多糖對自由基和糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50） 見表3。

表3 不同組分多糖對自由基和糖苷酶的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）

2.6 蒲公英多糖抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH 自由基清除能力

不同多糖組分對自由基的清除能力見圖5。

由圖5（a） 可知，4 個蒲公英多糖組分對DPPH的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增強；IC50值越小，表明其抗氧化活性越好。其中，PD-80 的清除活性表現(xiàn)良好，IC50為0.26 mg/mL，清除DPPH 能力優(yōu)于其他3 個組分，多糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時清除率達到84.32%。其次為PD-60，IC50為0.29 mg/mL，與PD-80 無顯著差異。PD-20 和PD-40 清除DPPH活性相對較弱，PD-20 組分IC50為0.42 mg/mL，清除DPPH 能力顯著高于PD-40 組分0.54 mg/mL（p＜0.05）。

2.6.2 超氧陰離子清除能力

圖5 不同多糖組分對自由基的清除能力

由圖5（b） 可知，4 個多糖組分對超氧陰離子清除活性均隨多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強，PD-80 與PD-60 的半抑制質(zhì)量濃度（IC50） 分別為0.25，0.30 mg/mL，抗氧化活性顯著高于其他2 種多糖（p＜0.05）。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達到0.5 mg/mL 時，PD-80 對超氧陰離子的清除率達到86.47%左右；當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度超過0.3 mg/mL 時，PD-20 對超氧陰離子的清除率漸漸高于PD-40；但都顯著低于維C（p＜0.05）。

3 結(jié)論

試驗采用超聲輔助提取和分級醇沉法獲得蒲公英粗多糖。設(shè)置20%，40%，60%和80%共4 個梯度，乙醇分級沉淀得到4 種蒲公英粗多糖，PD-80總糖含量最高，達到64.41%。各樣品均含有一定量的蛋白質(zhì)，PD-20 蛋白質(zhì)含量最高，其余3 組樣品蛋白質(zhì)含量PD-60＞PD-80＞PD-40，可能為結(jié)合態(tài)的蛋白質(zhì)。

研究不同組分的光譜學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)4 個組分結(jié)構(gòu)無明顯變化，多糖結(jié)構(gòu)未受到破壞。4 個組分均含有阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5 種單糖，且葡萄糖含量最高，但單糖組成比例存在差異。4 個組分體外降血糖和抗氧化活性隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強，呈量- 效關(guān)系。此外，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，抑制α - 葡萄糖苷酶和清除自由基的能力也逐漸增強。表明該方法可以快捷高效地得到不同組分蒲公英多糖，篩選出活性較高的組分，為蒲公英多糖的深入研究和開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。