張杏亞，楊 波，李亞蕾,，羅瑞明，阮振甜，撒苗苗，趙珺怡

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

肉色及其穩(wěn)定性代表著肉品的新鮮程度和品質(zhì)，影響消費(fèi)者對(duì)可接受性及鮮肉貨架期的評(píng)判。目前，影響肉色穩(wěn)定性的因素主要為兩種：環(huán)境因素（如溫度、pH值、微生物、氧氣分壓等）和內(nèi)部因素（肌紅蛋白的自氧化速率、高鐵肌紅蛋白還原酶活性、脂肪氧化、線粒體氧消耗率等）[1]。肖蕾等[2]模擬了大目金槍魚(yú)的冷斷鏈流通過(guò)程，分析了流通期間的溫度波動(dòng)對(duì)大目金槍魚(yú)肉色穩(wěn)定性與氧化性能的影響，結(jié)果表明紅度同總酚濃度、鐵離子抗氧化能力、硫代巴比妥酸值，高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量與酶活性等顯著相關(guān)，肉色穩(wěn)定性與氧化性能指標(biāo)隨溫度波動(dòng)而變化顯著。張同剛等[3]研究了冷鮮牛肉貯藏過(guò)程中貯藏時(shí)間對(duì)線粒體功能結(jié)構(gòu)變化的影響，結(jié)果表明線粒體膜電位與線粒體呼吸控制率、ATP含量均呈正相關(guān)，與高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，線粒體結(jié)構(gòu)、功能變化與肉色穩(wěn)定性有密切的關(guān)系。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肉色及肌紅蛋白衍生物轉(zhuǎn)化的研究已逐步從外部因素的影響轉(zhuǎn)向細(xì)胞及分子層面的研究。應(yīng)用組學(xué)技術(shù)分析肌細(xì)胞及線粒體呼吸鏈中物質(zhì)變化對(duì)具有運(yùn)輸和儲(chǔ)存O2功能的肌紅蛋白的影響，可進(jìn)一步揭示肌紅蛋白含量及其衍生物占比變化的分子機(jī)制。

Wu Shuang等[4]應(yīng)用非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)研究了黑切牛肉的顏色和顏色穩(wěn)定性，結(jié)果表明黑切牛肉具有較低的紅度和較高的顏色穩(wěn)定性，這是由于其具有較高的脫氧肌紅蛋白含量、較高的耗氧量、較高的高鐵肌紅蛋白還原性和較低的脂質(zhì)氧化作用。蛋白質(zhì)組學(xué)在肉類(lèi)科學(xué)研究方面的應(yīng)用主要集中在肉品質(zhì)研究上，非標(biāo)記蛋白質(zhì)組定量技術(shù)是一種不依賴于同位素標(biāo)記的新型蛋白質(zhì)定量技術(shù)，在3D蛋白質(zhì)組學(xué)中，質(zhì)譜會(huì)根據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)荷比、離子強(qiáng)度3 個(gè)維度的性質(zhì)對(duì)肽段離子進(jìn)行鑒定和定量。4D蛋白質(zhì)組學(xué)則是在3D分離的基礎(chǔ)之上增加了第四維度，即離子淌度的分離，為復(fù)雜體系樣品的測(cè)定帶來(lái)了更多的可能。

秦川牛是我國(guó)陜甘寧地區(qū)的優(yōu)勢(shì)特色畜種，2015年以來(lái)年均存欄數(shù)約300萬(wàn) 頭，年均出欄數(shù)約100萬(wàn) 頭，年均肉產(chǎn)量約50萬(wàn) t[5]。秦川牛肉質(zhì)細(xì)致、肉味濃郁、瘦肉率高、營(yíng)養(yǎng)全面，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。本實(shí)驗(yàn)以秦川牛背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，利用4D-非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)（4D-label-free proteomics，4D-LFQ）方法，測(cè)定宰后貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量及差異蛋白質(zhì)變化，篩選出與肌紅蛋白及其3 種衍生物占比變化有關(guān)的差異蛋白質(zhì)。利用拉曼光譜法檢測(cè)肌紅蛋白3 種衍生物的含量，測(cè)定貯藏過(guò)程中牛肉肉色變化。從貯藏期間蛋白質(zhì)組學(xué)的變化闡釋冷卻秦川牛肉中肌紅蛋白含量及向其衍生物轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，為理解肉類(lèi)變色的復(fù)雜生化變化，研發(fā)秦川牛肉貯藏加工中肉色變化預(yù)測(cè)及調(diào)控技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秦川黃牛（48 月齡左右，生長(zhǎng)發(fā)育良好、胴體質(zhì)量約400 kg）由中國(guó)甘肅省涇川縣旭康食品有限責(zé)任公司提供。屠宰后進(jìn)行胴體修整，用水沖洗后，取牛背最長(zhǎng)肌作為實(shí)驗(yàn)材料。

乙腈（色譜純） 美國(guó)Fisher Chemical公司；二硫蘇糖醇、尿素、碘代乙酰胺 美國(guó)Sigma公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Fluka公司；胰酶 美國(guó)Promega公司；蛋白酶抑制劑 美國(guó)Calbiochem公司；BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-410便攜式色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Inspector 300拉曼光譜儀 美國(guó)賽普斯公司；NanoElute液相色譜分析儀、timsTOF Pro質(zhì)譜儀 德國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣本取自3 頭秦川黃牛，每頭牛取3 個(gè)平行樣本，各取樣3 次，共27 個(gè)樣品，所有肌肉樣本均切成厚度3 cm的牛排，置于泡沫塑料托盤(pán)中，用聚乙烯薄膜（透氣率：23.5 g/（m2·d））包覆，再貯存于0～5 ℃的冰箱中，將27 個(gè)樣品分為3 組，分別在貯藏0、4、8 d后取出，立即在液氮中冷凍2 h，在-80 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)檢測(cè)分析。

1.3.2 肌紅蛋白及其相關(guān)蛋白表達(dá)量的測(cè)定

此部分分為蛋白質(zhì)提取、胰酶酶解、液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)3 個(gè)步驟，具體實(shí)驗(yàn)委托杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行。

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索：二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant（v1.6.6.0）軟件進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫(kù)為Bos_taurus_9913_PR_20190915.fasta（37 948 條序列），為計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率需要添加反庫(kù)，為消除鑒定結(jié)果中污染蛋白質(zhì)的影響，加入常見(jiàn)的污染庫(kù)；酶切方式設(shè)置為T(mén)rypsin/P；漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2；肽段最小長(zhǎng)度設(shè)置為7 個(gè)氨基酸殘基；肽段最大修飾數(shù)設(shè)為5；First search和Main search的一級(jí)母離子質(zhì)量誤差容忍度均設(shè)為40×10－6，二級(jí)碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為0.04 Da。將半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。蛋白鑒定、PSM鑒定的假陽(yáng)性率都設(shè)置為1%。

1.3.3 拉曼光譜測(cè)定肌紅蛋白相對(duì)含量

參照張同剛等[6]的方法，基于拉曼光譜儀測(cè)定樣品的拉曼光譜，用2D shige軟件對(duì)圖譜進(jìn)行處理后計(jì)算脫氧肌紅蛋白（myoglobin，DeoMb）、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）、高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）的相對(duì)含量。

1.3.4 肉色測(cè)定

用便攜式色差儀測(cè)定L*值（亮度）、a*值（紅度）與b*值（黃度），儀器在測(cè)定前用白盤(pán)進(jìn)行校準(zhǔn)，提供3 個(gè)平行樣（3 cm×3 cm×3 cm），每個(gè)樣品需在肉表面的6 個(gè)位置進(jìn)行測(cè)定，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行處理作圖，采用SPSS軟件進(jìn)行Duncan多重比較檢驗(yàn)差異顯著性，其中P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 秦川牛肉宰后貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量變化

表1 秦川牛肉宰后貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量變化Table 1 Changes in myoglobin expression in meat of Qinchuan cattle during postmortem storage

宰后肌肉貯藏過(guò)程中，肉色主要由肌紅蛋白的含量以及存在狀態(tài)決定的。秦川牛肉宰后0～5 ℃條件下貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量變化結(jié)果如表1所示。在貯藏0～4 d，肌紅蛋白表達(dá)量上調(diào)1.145 倍，肌肉中總肌紅蛋白含量處于較高的水平，可能是因?yàn)榈脱鯒l件下肌紅蛋白在細(xì)胞水平逐漸發(fā)生系統(tǒng)適應(yīng)[7]。在4～8 d的貯藏中，肌紅蛋白表達(dá)量下調(diào)0.815 倍。在0～8 d 貯藏過(guò)程中肌紅蛋白總體基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。Yin Shuang等[8]的研究指出，肌紅蛋白由一條球蛋白鏈和血紅素輔基組成，貯藏期間肌紅蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)改變，導(dǎo)致氧化還原性質(zhì)不穩(wěn)定。部分牛肉肌紅蛋白可能會(huì)因發(fā)生氧化還原等反應(yīng)而結(jié)構(gòu)解體，且解體速率大于表達(dá)速率。

2.2 秦川牛宰后貯藏中與肌紅蛋白及其衍生物相關(guān)蛋白的差異表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜法測(cè)定了秦川黃牛宰后貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)組的變化。使用無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)鑒定了1 149 個(gè)蛋白質(zhì)，以1.2 倍的差異倍數(shù)，鑒定出120 個(gè)差異顯著的蛋白質(zhì)。篩選出與肌紅蛋白及其衍生物相關(guān)的差異蛋白14 種，按其功能可分為代謝酶、氧化還原酶、過(guò)氧化物酶、伴侶蛋白4 類(lèi)。這些蛋白質(zhì)在貯藏期間差異表達(dá)量變化見(jiàn)表2。

表2 秦川牛肉宰后貯藏過(guò)程中與肌紅蛋白及其衍生物相關(guān)的差異蛋白表達(dá)情況Table 2 Differentially expressed proteins related to myoglobin and its derivatives in meat of Qinchuan cattle during postmortem storage

2.2.1 代謝酶

烯醇化酶（enolase，ENO2）是參與糖酵解代謝的重要限速酶，參與糖酵解途徑中的第9步反應(yīng)，催化2-磷酸甘油酸與高能化合物磷酸烯醇丙酮酸相互轉(zhuǎn)化，控制糖分分解速率，是唯一的糖酵解脫水步驟[9]。糖酵解途徑在產(chǎn)生能量和供給生物合成前體中起著主要作用[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ENO2在貯藏0～4 d表達(dá)量下調(diào)0.700 倍，4～8 d上調(diào)1.086 倍，變化不顯著，0～8 d，ENO2表達(dá)量總體呈下調(diào)趨勢(shì)，ENO2表達(dá)量下調(diào)0.761 倍，導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸鹽含量降低，因而抑制了線粒體的代謝速率，影響細(xì)胞進(jìn)行次級(jí)代謝，而羅培等[11]指出畜禽屠宰后線粒體能夠促進(jìn)褐變?nèi)釳etMb的還原，導(dǎo)致牛肉在貯藏過(guò)程中MetMb含量增加。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）傳統(tǒng)上被認(rèn)為是參與能量生成的管家蛋白[12]，主要參與糖酵解的第6步反應(yīng)，催化甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1,3-二磷酸甘油酸和NADH釋放出能量[13]。辛建增[14]研究表明甘油醛-3-磷酸在肉中GAPDH的催化作用下生成的NADH能夠直接被用于還原MetMb，進(jìn)而延緩了MetMb的累積，從而提高肉色穩(wěn)定性。在貯藏0～4 d時(shí)，GAPDH在牛肉中表達(dá)量下調(diào)0.800 倍，4～8 d上調(diào)1.019 倍，0～8 d，GAPDH表達(dá)量總體下調(diào)0.815 倍，GAPDH表達(dá)水平下調(diào)抑制了糖酵解作用，使生成的NADH含量下降，導(dǎo)致MetMb中的三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵的量減少，進(jìn)而導(dǎo)致累積MetMb。

琥珀酸輔酶A合成酶在檸檬酸循環(huán)中起作用，參與催化琥珀酸輔酶A的水解與ATP的合成[15]。琥珀酸輔酶A合成酶亞基（succinyl-CoA synthetase，SUCLA2）在0～8 d表達(dá)量下調(diào)0.762 倍，趙裕君[16]指出SUCLA2的缺乏可以引起神經(jīng)元的線粒體膜電位崩潰，并且SUCLA2表達(dá)量下降可以抑制線粒體融合及分裂蛋白表達(dá)，使線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，從而導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化效率受損。

腺苷酸激酶同工酶1（adenylate kinase isoenzyme 1，AK1）含有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，是最典型的酶分子機(jī)器，腺苷酸激酶的主要功能是在Mg2+的作用下，催化兩分子ADP生成一分子AMP和一分子ATP的可逆反應(yīng)，使ATP保持在適當(dāng)濃度[17-18]，維持機(jī)體能量平衡；在這個(gè)過(guò)程中，Mg2+與ADP進(jìn)行選擇性結(jié)合，與Mg2+結(jié)合的磷酸根氧原子逐漸被水分子取代，表現(xiàn)出配體交換過(guò)程[19]。本實(shí)驗(yàn)中AK1的表達(dá)量在0～8 d貯藏過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，下調(diào)0.671 倍，使活性位點(diǎn)水分子氫鍵網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化，影響糖酵解過(guò)程中底物的脫離過(guò)程和酶催化效率，導(dǎo)致ATP含量下降。

ATP5F1D、ATP5F1C分別表示ATP合酶亞基δ基因和ATP合酶亞基γ基因。線粒體ATP酶利用質(zhì)子電化學(xué)梯度的能量，通過(guò)ADP和Pi合成ATP，這是細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的主要能量來(lái)源[20]。本實(shí)驗(yàn)中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP5F1D、ATP5F1C表達(dá)量一直增加，ATP5F1D、ATP5F1C在第8天時(shí)表達(dá)量比第0天時(shí)分別上調(diào)1.516、1.579 倍，導(dǎo)致關(guān)鍵酶ATP合成酶不能正常發(fā)揮應(yīng)有的功能，細(xì)胞不能正常交換能量，這是宰后細(xì)胞能量代謝紊亂的重要原因。

2.2.2 氧化還原酶

NDUFA6和NDUFB5是線粒體膜呼吸鏈NADH脫氫酶I的副亞基，它們具有將電子從NADH轉(zhuǎn)移到呼吸鏈的功能[21]，共同調(diào)控NADH脫氫酶的活性，而NADH脫氫酶可使穩(wěn)定肉色的甲基血紅蛋白、高鐵肌紅蛋白、高鐵細(xì)胞色素b5和高鐵細(xì)胞色素c含量降低[22]。NDUFA6的表達(dá)量在0～4 d上調(diào)1.476 倍，第8天與第4天相比，表達(dá)量變化不大，NDUFB5在第0天沒(méi)有檢測(cè)到，第4～8天表達(dá)量下調(diào)，不利于維持肉色穩(wěn)定。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDHB）能夠可逆地催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，使NADH脫去電子變?yōu)镹AD+。有研究表明，NADH積累越多，肌紅蛋白的自氧化速率也越高[23]，并且研究發(fā)現(xiàn)LDHB在低溫長(zhǎng)期貯藏中極不穩(wěn)定且容易失去活性[24]，本實(shí)驗(yàn)中4～8 d貯藏過(guò)程中LDHB表達(dá)量下調(diào)，間接影響肉色。

細(xì)胞色素c氧化酶（NDUFA4）具有NADH脫氫酶和氧化還原酶的雙重活性，它在NADH和呼吸鏈間的電子傳遞中起著重要的生理作用，以維持和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)生物氧化的進(jìn)行，并最終推動(dòng)ATP合成以提供生命能量活動(dòng)的需要[25]。NDUFA4是的過(guò)表達(dá)引起細(xì)胞色素c的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體凋亡[26]。實(shí)驗(yàn)中NDUFA4表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)，說(shuō)明宰后貯藏中細(xì)胞能量代謝紊亂。

2.2.3 過(guò)氧化物酶

過(guò)氧化物酶還原酶（peroxiredoxin，PRDX1）是過(guò)氧化物酶家族的成員之一，可以保護(hù)OxyMb免受過(guò)氧化物的攻擊[27]，從而作為抗氧化蛋白來(lái)保護(hù)肉色。本實(shí)驗(yàn)中在貯藏4～8 d時(shí)，PRDX1表達(dá)量上調(diào)1.289 倍，可以看作肌肉對(duì)肉色褐變的‘抵抗’。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）2可以破壞在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并對(duì)生物系統(tǒng)有毒的超氧陰離子自由基，避免對(duì)細(xì)胞有害的過(guò)氧化氫的形成，從而維持了肌紅蛋白氧化還原態(tài)比例的穩(wěn)定[28]。SOD2在0～4 d表達(dá)量基本不變，4～8 d表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，貯藏后期SOD2的低表達(dá)表明，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，肌紅蛋白的氧化態(tài)和還原態(tài)比例不穩(wěn)定。

2.2.4 伴侶蛋白

HSPA6是熱休克蛋白家族A（HSP70）成員6。熱休克蛋白對(duì)于細(xì)胞在應(yīng)對(duì)突變和不利的環(huán)境變化時(shí)的生存具有重要的作用。HSPA6通過(guò)形成鐵螯合物和產(chǎn)生氧化應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化氫的損傷。Hsp90伴侶蛋白CDC37通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)多種靶點(diǎn)蛋白組合成復(fù)合體，協(xié)助靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜，參與蛋白質(zhì)的折疊、伸展及組裝多聚體，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定[29]。Joseph等[30]也發(fā)現(xiàn)了兩種熱休克蛋白（HSP-70 kDa和HSP-27 kDa）在具有顏色穩(wěn)定性的牛腰長(zhǎng)肌肉中含量過(guò)高；而在本實(shí)驗(yàn)中，HSPA6在貯藏8 d時(shí)比貯藏0 d時(shí)表達(dá)量下調(diào)0.804 倍，說(shuō)明顏色穩(wěn)定性可能下降。CDC37在貯藏0～4 d下調(diào)0.834 倍，4～8 d上調(diào)1.216 倍。伴侶蛋白HSPA6、CDC37表達(dá)量的改變可能參與了保護(hù)蛋白質(zhì)不變性，從而起到維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的作用。

2.3 秦川牛肉宰后貯藏過(guò)程中3 種肌紅蛋白相對(duì)含量的變化

為進(jìn)一步驗(yàn)證2.1、2.2節(jié)中蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果，本研究測(cè)定了牛肉貯藏期間3 種肌紅蛋白的實(shí)際相對(duì)含量變化，主要包括使肉呈現(xiàn)不同顏色的OxyMb（鮮紅色）、DeoMb（紫紅色）和MetMb（灰褐色）[31]，不同肌紅蛋白衍生物之間相互轉(zhuǎn)化會(huì)引起肉品色澤的變化[32]。

圖1 秦川牛肉宰后貯藏過(guò)程中3 種肌紅蛋白相對(duì)含量Fig.1 Relative contents of three myoglobin derivatives in meat of Qinchuan cattle during postmortem storage

如圖1所示，在宰后0 d，肉表面以O(shè)xyMb為主時(shí)（相對(duì)含量70.84%），肉呈現(xiàn)鮮紅色。貯藏過(guò)程中，OxyMb相對(duì)含量明顯下降，MetMb、DeoMb逐漸積累，在8 d時(shí)，OxyMb、MetMb、DeoMb相對(duì)含量依次為40.92%、40.22%、18.86%。在貯藏過(guò)程中，氧氣含量逐漸降低，OxyMb轉(zhuǎn)化成DeoMb，然后DeoMb氧化成MetMb，使暗褐色的MetMb相對(duì)含量增加，肉色褐變。Wang Zhaoming等[33]研究發(fā)現(xiàn)血紅素蛋白在貯藏過(guò)程中發(fā)生降解、被破壞或卟啉與球蛋白的分離。張同剛等[34]指出隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋轉(zhuǎn)化成β-折疊或無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，發(fā)生分子重排，造成肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)原始構(gòu)象改變，由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化，分子間的部分二硫鍵受到破壞，從而導(dǎo)致其分子間的作用力減弱，肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，最終導(dǎo)致肌紅蛋白作為色素蛋白的特有功能減弱乃至喪失，肌紅蛋白在牛肉中的相對(duì)含量下降，與本研究貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量下調(diào)的結(jié)果一致。

2.4 秦川牛肉宰后貯藏過(guò)程中的肉色變化

表3 不同宰后貯藏時(shí)間對(duì)秦川牛肉肉色的影響Table 3 Effect of postmortem storage time on Qinchuan cattle meat color

宰后牛肉貯藏過(guò)程中顏色發(fā)生了顯著變化，這與之前的研究結(jié)果[35]一致。L*值越高則肉類(lèi)的顏色越亮，如表3所示，在8 d的貯藏過(guò)程中，L*值呈先上升后緩慢下降趨勢(shì)；a*值顯著降低，到第8天下降至10.27；b*值呈緩慢上升趨勢(shì)，這可能是由于貯藏中與肌紅蛋白相關(guān)的14 種蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生變化，影響了細(xì)胞正常的能量代謝，肌紅蛋白衍生物的占比發(fā)生變化，MetMb的逐漸累積，肉色發(fā)生褐變。這與以上肌紅蛋白及其衍生物的含量變化相一致。

3 討 論

肌肉中肌紅蛋白是紅色素的主要成分，其含量及3 種衍生物占比直接影響肉色變化。肌紅蛋白是水溶性的球蛋白與卟啉環(huán)結(jié)合的中心配體，F(xiàn)e2+存在于血紅素殘基中，鐵原子與O2、H、O、NO分子容易結(jié)合[36]。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，肌紅蛋白可以輸送氧氣，供機(jī)體組織器官產(chǎn)生能量。肌紅蛋白的表達(dá)量變化及蛋白結(jié)構(gòu)的變化影響氧氣運(yùn)輸和能量代謝，進(jìn)而造成肉色的改變。肌紅蛋白絕對(duì)含量一方面取決于肌紅蛋白表達(dá)量；另一方面取決于肌紅蛋白由于結(jié)構(gòu)解體引起的消亡量。實(shí)驗(yàn)中肌紅蛋白表達(dá)量在貯藏0～4 d呈略微上升趨勢(shì)，4～8 d呈下降趨勢(shì)，整體呈下降趨勢(shì)。隨著宰后牛肉貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肉中肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)原始構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)由規(guī)整向松散轉(zhuǎn)化，肌紅蛋白分子間的部分二硫鍵受到破壞，導(dǎo)致其分子間的作用力降低，肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降，最終導(dǎo)致肌紅蛋白作為色素蛋白的特有功能下降乃至自身消亡。本實(shí)驗(yàn)研究的與肌紅蛋白表達(dá)及其衍生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異蛋白中，ENO2、GAPDH、SUCLA2等蛋白質(zhì)調(diào)控糖酵解代謝途徑，AK1、ATP5F1D、ATP5F1C等蛋白質(zhì)共同調(diào)控ATP的生成，NADH脫氫酶、NDUFA4、LDHB等氧化還原酶參與線粒體電子傳遞鏈，由于肌紅蛋白的血紅素殘基中鐵原子是呼吸鏈中的電子受體，這幾種氧化還原酶的表達(dá)量變化影響了肌紅蛋白衍生物之間的相互轉(zhuǎn)化。PRDX1與SOD2可以保護(hù)OxyMb免受過(guò)氧化物的攻擊，維持肌紅蛋白氧化還原物比例的穩(wěn)定，這兩種過(guò)氧化物酶在牛肉貯藏中表達(dá)量下降，可能導(dǎo)致OxyMb相對(duì)含量降低，MetMb相對(duì)含量上升。

4 結(jié) 論

牛肉宰后貯藏過(guò)程中，牛肉顏色發(fā)生了顯著變化。肌紅蛋白基因表達(dá)量在貯藏0～4 d呈略微上升趨勢(shì)，4～8 d呈下降趨勢(shì)，整體呈下降趨勢(shì)。采用4D-LFQ蛋白組學(xué)技術(shù)研究了秦川牛肉在宰后貯藏中的差異蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，以1.2 倍的差異倍數(shù)，鑒定出120 種差異蛋白。分析了與肌紅蛋白及其衍生物相關(guān)的14 種差異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)按其功能可分為代謝酶、氧化還原酶、過(guò)氧化物酶、伴侶蛋白4 類(lèi)，通過(guò)參與糖酵解途徑、能量代謝、脂質(zhì)氧化、結(jié)構(gòu)裂體、蛋白裂解等途徑，影響肌紅蛋白的新生與消亡及其衍生物轉(zhuǎn)化。通過(guò)拉曼光譜法測(cè)定3 種肌紅蛋白衍生物的相對(duì)含量，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，使肉類(lèi)呈現(xiàn)鮮紅色的OxyMb相對(duì)含量明顯降低，MetMb、DeoMb相對(duì)含量緩慢上升，這與蛋白質(zhì)組學(xué)分析吻合。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉的L*值增加，b*值增加，a*值下降，表現(xiàn)為肉色發(fā)生褐變。研究結(jié)果揭示了差異蛋白和肌紅蛋白含量及衍生物占比間存在潛在的相關(guān)性，為理解肉類(lèi)變色的復(fù)雜生化反應(yīng)、預(yù)測(cè)和控制冷卻秦川牛肉貯藏過(guò)程中肉色變化提供理論參考。