甘玉飛，薛正蓮,2,3,，周 杰，王 芳，王 洲,2,3，劉 艷,2,3

（1.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000；3.微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000）

磷脂酶A1是一類專一水解磷脂sn-1位?；乃饷竅1]，目前磷脂酶A1在食品、醫(yī)療、紡織等行業(yè)用途十分廣泛，如被應(yīng)用在油脂脫膠[2-6]、生產(chǎn)溶血磷脂[7]、加工卵黃等[8]中。磷脂酶A1在微生物中主要由沙雷氏菌屬、假單胞菌、曲霉屬和埃希氏桿菌屬等產(chǎn)生。

Song[9]和Fu Jianhong[10]等將來源于沙雷氏菌MK1和沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌磷脂酶A1基因下游有一段基因與磷脂酶A1在大腸桿菌中高活性的表達(dá)密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一株來源于黏質(zhì)沙雷菌的磷脂酶A1基因下游有一段編碼序列，該基因序列的存在也能提高磷脂酶A1在大腸桿菌中的表達(dá)活性，并將該基因編碼蛋白命名為磷脂酶A1輔助蛋白S（phospholipase A1 accessory protein S，PlaS）。但無論是磷脂酶A1與PlaS共表達(dá)，還是PlaS單獨(dú)表達(dá)，都表現(xiàn)出對宿主大腸桿菌生長的抑制作用[11-12]。目前國內(nèi)外對于PlaS的相關(guān)研究鮮有報道。

PlaS能提高磷脂酶A1的表達(dá)活性，但抑制宿主菌生長的作用又限制了磷脂酶A1酶活力的進(jìn)一步提高。所以研究PlaS抑制宿主菌的生長機(jī)理具有重要意義。N端截短技術(shù)被廣泛用于菌株分子改造和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究中[13-15]。朱昊等[15]將PlaS的N端區(qū)域的前35 個氨基酸截掉之后，發(fā)現(xiàn)PlaS對宿主細(xì)胞生長的抑制作用消失。同時也有研究表明Sr35蛋白過表達(dá)導(dǎo)致了煙草細(xì)胞死亡，而Sr35的截短突變體不會觸發(fā)細(xì)胞死亡[16]。因此本研究將從PlaS的N端進(jìn)行分析，進(jìn)行N端截短菌株構(gòu)建。掃描電子顯微鏡常用于細(xì)胞顯微觀察[17]；流式細(xì)胞術(shù)是一門快速對單個細(xì)胞定性定量的技術(shù)，可以檢測細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化[18]，許多學(xué)者將其應(yīng)用到抑菌殺菌實(shí)驗(yàn)研究中[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)通過N端截短來尋找PlaS對宿主菌生長抑制的關(guān)鍵氨基酸序列，同時采用生長曲線檢測對截短結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并用掃描電子顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測大腸桿菌，以探究其抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）、質(zhì)粒pET28a（+）為實(shí)驗(yàn)室保存。P28工程菌是將質(zhì)粒pET28a（+）直接導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中；SP28工程菌是以質(zhì)粒pET28a（+）為載體，插入plaS基因，導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）宿主菌中。

限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、XhoI和T4連接酶美國賽默飛世爾科技公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、TaqDNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒和瓊脂糖上海生工生物技術(shù)有限公司；其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物合成及DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

T100 PCR儀 美國Bio-Rad公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；S4800掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀 美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基及反應(yīng)緩沖液的配制

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，滅菌水溶解后定容至1 L，調(diào)pH值至7.0，高溫高壓滅菌后4 ℃保存。

Kan溶液：0.5 g Kan溶解與8 mL滅菌水中，定容至10 mL。用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌，分裝（每份1 mL）后-20 ℃保存。

IPTG溶液：稱取1.19 g IPTG溶解于40 mL滅菌水中，定容至50 mL。用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌，分裝（每份1 mL）后-20 ℃保存。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）：稱取Na2HPO42.2 g、NaH2PO40.2 g、NaCl 8.5 g，滅菌水定容至1 L。

1.3.2 PlaS氨基酸序列分析

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站對PlaS進(jìn)行信號肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、疏水結(jié)構(gòu)（https://web.expasy.org/protscale/）以及跨膜區(qū)（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析。

1.3.3 PlaS N端截短菌株構(gòu)建

通過生物信息學(xué)網(wǎng)站分析，設(shè)計各個截短菌株（dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28、dS27P28，以dS23P28為例，即表達(dá)PlaS N端截短前23 個氨基酸后的蛋白的菌株，其他菌株以此類推）的上游引物，以及它們共同的下游引物（表1），利用PCR技術(shù)，以SP28質(zhì)粒為模板，對截短輔助蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后選用XhoI和BamH I為限制性內(nèi)切酶，分別對膠回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物和pET28a（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，再用T4連接酶將二者4 ℃過夜連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，經(jīng)過化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)法將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中，恢復(fù)培養(yǎng)后涂布于50 μg/mL Kan篩選平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜，隨后挑取單克隆，接種到含50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后用培養(yǎng)好的菌液提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證條帶準(zhǔn)確的菌株送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

表1 N端截短菌株P(guān)CR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used for polymerase chain reaction for construction of N-terminal truncated mutants

1.3.4 生長曲線測定

將生長至對數(shù)生長期的菌液稀釋至OD600nm為0.2，按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接到100 mL LB+50 μg/mL Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液OD600nm為0.6左右時加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，整個期間每隔2 h取樣一次，用紫外-可見分光光度計測定OD值，以空載菌株P(guān)28為對照，培養(yǎng)條件為37 ℃、200 r/min。構(gòu)建菌株的生長曲線均按照此方法進(jìn)行測定。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

用掃描電子顯微鏡觀察菌株P(guān)28、SP28、dS27P28的顯微形態(tài)，以空載菌株P(guān)28為對照。將各個菌株過夜活化后接種于LB+Kan培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。之后分別取誘導(dǎo)0、4、8、12 h的菌液，用離心法收集菌體沉淀至綠豆大小，用PBS（pH 7.4）洗滌后在4 ℃下與體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛混合6 h進(jìn)行固定。固定后的菌體在PBS中沖洗兩次，每次20 min，再用乙醇（體積分?jǐn)?shù)依次為30%、50%、70%、85%、95%、100%）進(jìn)行梯度脫水，每次20 min。用無水丙酮置換出乙醇后，將細(xì)菌沉淀用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.6 細(xì)胞膜通透性檢測

將菌株過夜活化后接種于LB+Kan培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右，加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)0、4、8、12 h時取1 mL菌液，4 ℃、4 000 r/min下離心10 min。用PBS（pH 7.4）洗3 次。將碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料加入重懸的菌液，4 ℃避光下染色30 min。染色后將菌液過200 目的尼龍篩，放置于流式細(xì)胞儀中檢測。檢測以10 μL/min低速率記錄100 000 個細(xì)胞，用488 nm激發(fā)光檢測紅色熒光轉(zhuǎn)化的數(shù)字信號。

1.3.7 PlaS N端27肽理化性質(zhì)分析

使用在線程序ExPASyp-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）和Heliquest（http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py）對PlaS N端27肽的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、凈電荷、疏水性、疏水力矩進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Origin軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析PlaS氨基酸序列信息

圖1 PlaS氨基酸信息分析Fig.1 Amino acid sequence analysis of PlaS

對PlaS進(jìn)行信號肽分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在信號肽，為前23 個氨基酸（圖1A）。有研究表明，在原核表達(dá)過程中，外源信號肽的存在會影響蛋白質(zhì)的正常表達(dá)[21-23]，如郭磊周等[24]研究發(fā)現(xiàn)耐輻射異常球菌疏水性LEA5C家族蛋白（DrwH）含有信號肽序列，DrwH蛋白過量表達(dá)抑制了大腸桿菌的生長。通過跨膜區(qū)及蛋白疏水性在線分析，發(fā)現(xiàn)蛋白前7～26 個氨基酸為典型的跨膜區(qū)域（圖1B），第10～27個氨基酸為疏水區(qū)（圖1C），有研究表明截去蛋白疏水區(qū)可高效穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白[25-26]。綜上，推測PlaS前23～27 個氨基酸有可能與PlaS在大腸桿菌中的表達(dá)特性及其對大腸桿菌生長抑制現(xiàn)象有關(guān)。

2.2 PlaS N端截短菌株構(gòu)建結(jié)果

對1.3.3節(jié)構(gòu)建的菌株進(jìn)行測序，測序結(jié)果和plaS全長基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28、dS27P28都缺少了它們各自需要截短的氨基酸，且未截短部位突變少，相似度高，這表明PlaS N端截短菌株構(gòu)建成功。圖2為PlaS N端截短菌株的N端序列比對結(jié)果，使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對。

圖2 PlaS N端截短菌株測序比對Fig.2 Sequence comparison of PlaS N-terminal truncated strains

2.3 不同PlaS N端截短突變株異源表達(dá)生長特性變化

圖3 PlaS N端截短菌株生長曲線Fig.3 Growth curves of PlaS N-terminal truncated strains

以菌株SP28和構(gòu)建成功的N端截短系列菌株進(jìn)行了生長曲線測定，結(jié)果如圖3所示。在未加誘導(dǎo)劑IPTG時菌株生長狀況一致，在加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后dS27P28菌株生長情況良好，一直呈現(xiàn)指數(shù)增長狀態(tài)，而表達(dá)PlaS的菌株SP28呈現(xiàn)相反情況，生長最慢，其他截短菌株在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后均出現(xiàn)不同程度的生長抑制，由此可推測前27 個氨基酸的存在對其表達(dá)宿主大腸桿菌的生長有抑制作用。

2.4 PlaS N端截短對大腸桿菌形貌的影響

圖4 PlaS表達(dá)菌株掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM images of PlaS expression strains

細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞能導(dǎo)致細(xì)菌死亡。為了探討PlaS是否通過破壞細(xì)胞膜來抑制大腸桿菌的生長，采用掃描電子顯微鏡對細(xì)胞膜進(jìn)行了觀察。如圖4所示，在細(xì)胞生長過程中，對照組P28菌株有完整、光滑、規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖4A～D）。相反，表達(dá)PlaS的菌株SP28隨時間變化的最顯著特征是細(xì)菌變形、破損。在4 h出現(xiàn)了褶皺、干枯（圖4F），在8 h出現(xiàn)部分細(xì)胞破損、壓縮（圖4G），在12 h出現(xiàn)細(xì)胞大量破損，細(xì)胞形態(tài)變得不完整（圖4H）。而表達(dá)截短N(yùn)端27 個氨基酸的PlaS菌株dS27P28又恢復(fù)了完整、光滑、有規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且隨時間延長未出現(xiàn)破損情況（圖4J～L）。這些現(xiàn)象說明PlaS對大腸桿菌細(xì)胞膜具有嚴(yán)重的損傷作用，也進(jìn)一步說明了PlaS N端前27 個氨基酸的存在對其表達(dá)宿主大腸桿菌的生長有抑制作用。

2.5 PlaS N端截短對大腸桿菌細(xì)胞通透性影響

為了進(jìn)一步探究PlaS對大腸桿菌細(xì)胞膜的破壞情況，采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了定量分析。熒光染料PI能夠進(jìn)入細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞與核酸結(jié)合，而有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞則不會被染色。用PI染料分別對誘導(dǎo)0、4、8 h的SP28和dS27P28菌株染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果可以看出，隨著時間推移，SP28菌株細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞比例在0 h時為9.54%（圖5A），4 h時為48.72%（圖5B），8 h時達(dá)到了66.92%（圖5C）；相比之下，如圖5D～F所示，dS27P28菌株細(xì)胞膜損傷率增長則慢的多，8 h時為13.69%。這說明了PlaS對細(xì)胞膜有損傷影響，而PlaS的N端截短27 個氨基酸后則損傷現(xiàn)象消失，與掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果一致。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞膜完整性Fig.5 Detection of cell membrane integrity by FCM

2.6 PlaS N端27肽的理化性質(zhì)分析結(jié)果

PlaS N端27肽序列為MPEGRRLRRA LAIALLALAAVTGLLMM。ExPASyp-ProtParam tool軟件顯示該蛋白質(zhì)序列分子式為C128H231N39O31S3、分子質(zhì)量為2 908.66 Da、等電點(diǎn)為12。Heliquest軟件分析得到該肽凈電荷為+3、疏水性值為0.621 11、疏水力矩為0.147 12、疏水面為ALLLL，螺旋投影圖由Heliquest軟件得到（圖6）。根據(jù)軟件分析結(jié)果，PlaS N端27肽為帶陽離子正電荷的疏水性肽。Lin Yanlan等[27]通過設(shè)計分析一組新型陽離子抗菌肽，以進(jìn)一步了解抗菌肽與細(xì)胞膜的脂質(zhì)的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疏水性強(qiáng)的抗菌肽與細(xì)胞膜親和性強(qiáng)；Hollmann等[28]選擇了兩種多肽——P5和P6.2進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)它們對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有殺傷活性，同時破壞了兩株菌的細(xì)胞膜的完整性。因此PlaS對大腸桿菌的抑制作用可能是N端前27 個氨基酸陽離子的疏水性導(dǎo)致的。這27 個氨基酸組成肽的具體功能后續(xù)將做進(jìn)一步的研究。

圖6 PlaS N端27肽螺旋投影圖Fig.6 Spiral projection of first 27 N-terminal amino acids of PlaS

3 討 論

本究結(jié)果顯示PlaS在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)后對其生長有較強(qiáng)的抑制作用，同時通過N端截短技術(shù)發(fā)現(xiàn)其抑制作用關(guān)鍵區(qū)域?yàn)镻laS N端前27 個氨基酸，且通過生長曲線測定、掃描電子顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜通透性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。

掃描電子顯微鏡觀察到PlaS表達(dá)菌株在4 h出現(xiàn)了褶皺、干枯，在8 h時出現(xiàn)部分細(xì)胞破損、壓縮，在12 h時相比出現(xiàn)大量破損，結(jié)構(gòu)變得不完整。這初步揭示了PlaS主要通過破壞大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的完整性抑制其生長。很多學(xué)者研究表明細(xì)胞膜的完整性對于細(xì)菌生長至關(guān)重要，細(xì)胞損傷直接抑制了細(xì)菌的生長[29-32]，而一般細(xì)胞破損會引起離子（K+、Na+、Ca2+）的泄漏[33]，這會影響細(xì)胞正常的生命活動，其存活所需的各種生物酶也將不會被合成。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示在SP28菌株誘導(dǎo)表達(dá)8 h時細(xì)胞膜損傷率達(dá)到66.92%，也進(jìn)一步驗(yàn)證了PlaS對大腸桿菌細(xì)胞膜有損傷作用。

對PlaS N端前27 個氨基酸組成的多肽進(jìn)行了理化分析，結(jié)果顯示其為陽離子疏水性多肽。微生物膜通常呈現(xiàn)陰離子表面，富含脂質(zhì)（如磷脂酰甘油），而陽離子與疏水性非常適合與微生物膜作用[34-35]。根據(jù)這個特點(diǎn)此27肽有望開發(fā)成新型抗菌肽。

PlaS對其表達(dá)宿主大腸桿菌生長抑制及細(xì)胞損傷的分子機(jī)理還有待后續(xù)深入研究，可通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)技術(shù)比較SP28菌株和PlaS N端截短菌株之間與細(xì)胞膜合成有關(guān)基因（如oppA、ompA、lpxT、plsB等[36]及與細(xì)胞壁合成有關(guān)基因Pal、MtgA、NagA等[37]）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。