魯丁強，龐廣昌

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

大量研究和綜述發(fā)現(xiàn)雌激素不僅在女性，也在男性發(fā)育、分化、成熟、生殖、健康與疾病中發(fā)揮重要作用[1]。外源性雌激素，即所謂的植物雌激素涵蓋了幾乎所有的食物和中草藥有效成分，在健康和疾病中的作用被越來越多的研究所揭示[2]。最早在1926年，發(fā)現(xiàn)植物化學(xué)物在動物中發(fā)揮和內(nèi)源性雌激素平行的生物學(xué)作用[3-4]。1931年報道了富含異黃酮的大豆類食品所具有的健康作用正是由于含有植物雌激素類化合物——大豆異黃酮[5]。1938年，Zondek等[6]報道香精油中的一些化合物具有和內(nèi)源性雌激素相似的結(jié)構(gòu)和功能，并得到了Bennets等[7]的證實。Axelson等[8]發(fā)現(xiàn)澳大利亞綿羊長期啃食三葉草造成不育，主要是因為這種草中含有雌馬酚。1980年代，在尿液中也分離鑒定到了植物雌激素[8]，并通過一系列的流行病學(xué)和生理生化研究證明，異黃酮與內(nèi)源性雌激素受體（estrogen receptor，ER）α和ERβ具有親和作用[9]。此后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物雌激素都可能通過ERα和ERβ這兩種經(jīng)典的內(nèi)源性ERs發(fā)揮作用[10]。Barton等[11]在回顧G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G-protein coupled estrogen receptor，GPER）發(fā)現(xiàn)20 周年時提出：ERα和ERβ作為固醇類受體，其起源和進化可以追溯到5億 年前，而G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）則可以追溯到10億 年前，明顯早于前者。而且，早在1939年，Reynolds等[12]就發(fā)現(xiàn)雌激素對女性的作用存在一條通過神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)的快速途徑，而這兩種經(jīng)典的ERs本質(zhì)上屬于配體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子激活（或抑制），從而改變眾多基因表達，屬于基因組學(xué)途徑。顯然，從邏輯上來推論，這兩種ERs之上一定還存在一條更古老的非基因組學(xué)的、快速的膜結(jié)合受體。最早發(fā)現(xiàn)一種可能具有傳遞雌激素信號的GPCR被命名為GPR30，屬于孤兒受體（尚未確定其功能的GPCR歸類為孤兒受體）；到2000年，積累的證據(jù)表明，GPR30也是雌激素快速“非基因組學(xué)”信號傳遞所必需的，因此GPR30獲得了雌激素研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[12]。2005—2006年，大量實驗發(fā)現(xiàn)，雌激素與在細胞膜上表達的GPR30結(jié)合傳遞非基因組信號，與此同時，激活ERα和ERβ核轉(zhuǎn)錄活性，并鑒定分離了多種GPR30選擇性激活劑或拮抗劑。到2007年，有關(guān)GPR30的論文已經(jīng)達到1 000 篇以上，促使國際藥理學(xué)聯(lián)合會重新命名GPR30為GPER。這是因為GPER的發(fā)現(xiàn)和研究為藥物篩選、內(nèi)源性和外源性雌激素的功能評價、信號途徑及其與糖尿病、肥胖、代謝綜合征、癌癥的發(fā)生、發(fā)展、病情預(yù)測、預(yù)防和治療等領(lǐng)域打開了一扇大門。

有關(guān)GPER的綜述已有很多，但集中在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域，而有關(guān)食品功能評價方面的研究還鮮見報道。目前，所研究的功能性食品以及食品安全檢測與控制領(lǐng)域，絕大多數(shù)都與ER、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）有關(guān)[13]，這些受體主要是通過基因組途徑調(diào)節(jié)基因表達，需要經(jīng)過數(shù)小時，甚至數(shù)天的時間，但需要強調(diào)的是，食品功能性成分或毒素發(fā)揮作用顯然具有快速信號途徑，如食欲、營養(yǎng)吸收、神經(jīng)、代謝、免疫、內(nèi)分泌控制需要GPER的快速控制途徑。可見GPER所控制的非基因組學(xué)快速途徑才是控制雌激素類化合物發(fā)揮生理功能的主體途徑，同時也是控制基因組學(xué)途徑的樞紐，本文將就這些問題進行綜合分析。

1 胃腸道是植物化學(xué)物發(fā)揮作用的主要部位

越來越多的研究結(jié)果顯示，無論是中草藥還是植物化學(xué)物，都不大可能直接進入體內(nèi)發(fā)揮作用，即使極少量化合物進入血液循環(huán)系統(tǒng)也必將很快被代謝分解或經(jīng)肝臟解毒酶分解后經(jīng)尿液排出，不可能發(fā)揮主體生理作用?？梢姡粋€不可回避的問題是，作為中草藥和植物化學(xué)物到底是如何發(fā)揮生理、病理、甚至毒性作用的？Pang Guangchang等[14]認為，食品和中草藥主要是通過服用到胃、腸道中發(fā)揮作用，而不是通過吸收到循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮作用；其具體機制為：胃腸系統(tǒng)，特別是腸黏膜系統(tǒng)極其豐富多樣的受體構(gòu)成機體對食入的所有外來化合物分子結(jié)構(gòu)的識別系統(tǒng)，隨時隨地向機體傳遞神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝、免疫等電化學(xué)信號。這個系統(tǒng)不僅可以傳感機體所必需的營養(yǎng)（即宏營養(yǎng)）信號，而且可以識別微營養(yǎng)、抗營養(yǎng)、毒素、植物化學(xué)物、中草藥等化學(xué)成分，從而控制營養(yǎng)吸收、合成與分解代謝、能量儲存與利用、免疫防御以及生理與內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

1.1 胃腸道不僅是重要的營養(yǎng)消化和吸收系統(tǒng)，也是重要的分子結(jié)構(gòu)識別系統(tǒng)

人類從嗅覺到味覺，再到胃腸道和整個機體的生理生化作用、能量利用、代謝內(nèi)分泌和免疫防御系統(tǒng)必須依賴于化學(xué)結(jié)構(gòu)的識別與信號傳遞。這個化學(xué)結(jié)構(gòu)識別和信號傳遞系統(tǒng)依賴于多個受體家族。其中最為著名的便是GPCRs超家族，它不僅有多達上千個家族成員，而且跨越光、聲、電、觸覺等物理信號及嗅/味覺、細胞趨化、免疫、代謝、激素和內(nèi)分泌信號傳遞等多種化合物結(jié)構(gòu)的識別與信號傳遞。味覺受體主要與營養(yǎng)、抗營養(yǎng)、腐敗和毒性化合物識別相關(guān)聯(lián)，是入“口”的第一關(guān)。由于嗅/味覺信號必須在盡可能短的時間內(nèi)通過大腦作出判斷，所以需通過神經(jīng)電信號進行傳遞。已知這些信號是由GPCRs傳感識別后引發(fā)胞內(nèi)信號放大，迅速打開/關(guān)閉相應(yīng)的離子通道，從而引發(fā)膜電位的變化（去極化），通過神經(jīng)末梢收集這些電化學(xué)信號再以神經(jīng)脈沖信號的形式傳遞到大腦。如圖1所示，這種傳遞信號的方式也被稱為非基因組學(xué)信號途徑或快速信號發(fā)生與傳遞途徑。與此同時，包括GPCRs在內(nèi)的受體對分子結(jié)構(gòu)的識別與傳遞還有一種所謂的慢速細胞信號傳遞途徑，亦即基因組學(xué)信號途徑。這條信號傳遞途徑往往需要引發(fā)細胞內(nèi)多種信號分子、接頭分子的交互作用，激活（或抑制）轉(zhuǎn)錄因子，從而將信號傳遞到細胞核內(nèi)，產(chǎn)生基因組和轉(zhuǎn)錄組調(diào)控作用，所以命名為基因組學(xué)信號途徑。這條信號途徑能夠產(chǎn)生表觀遺傳修飾、細胞記憶和遺傳，即在DNA和核小體上“寫入（write）”“讀取（read）”或“擦除（erase）”，從而改變細胞遺傳記憶，而且讀、寫、擦方面的錯誤是造成疾病，特別是癌癥的重要原因[15]。顯然，味覺受體識別配體后可以依據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)引發(fā)細胞內(nèi)的信號傳遞，打開/關(guān)閉離子通道，引起細胞瞬時膜電位的變化，轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)信號傳遞到大腦，從而決定是否進食。但是奇怪的是，嗅/味覺受體也出現(xiàn)在其他組織和細胞，特別是腸黏膜組織上分布著幾乎所有的味覺受體。這些受體顯然不是用于向大腦傳遞味覺神經(jīng)信號。近年來，大量研究證明，這些受體傳遞的是代謝、免疫和內(nèi)分泌信號[16]。換言之，味蕾主要傳感對食品營養(yǎng)和安全的信號，而腸道則主要傳感植物神經(jīng)和內(nèi)分泌信號到大腦、腦垂體、下丘腦、胰腺、內(nèi)分泌和免疫防御系統(tǒng)，從而控制營養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運、代謝、儲存和食欲，以保證在達到其消化和吸收能力上限時停止進食?？梢姡瑺I養(yǎng)傳感、吸收與控制不僅是動物的基本屬性，植物和微生物也不例外，只有在細胞需要營養(yǎng)時才會吸收營養(yǎng)，失去對營養(yǎng)吸收的控制也就失去了細胞生存的基礎(chǔ)?；诖?，表明這些受體是通過離子通道和耗能反應(yīng)實現(xiàn)對營養(yǎng)攝入和吸收的定量化控制。以脂肪酸受體GPR120為例，饑餓時，GPR120識別脂肪酸向大腦傳感“香味”，但是當腸道中傳感到游離脂肪酸時，說明飲食的脂肪酸已經(jīng)超過腸道的吸收能力，它轉(zhuǎn)而向大腦傳遞“油膩”的味道，停止進食，失去這種受體會導(dǎo)致肥胖[17]。

圖1 非基因組學(xué)和基因組學(xué)雌激素信號途徑Fig.1 Nongenomic and genomic estrogen signaling pathways

植物化學(xué)物、中草藥等首選口服給藥方式，說明它們大多數(shù)都與腸道受體系統(tǒng)互作，即使可以吸收到循環(huán)系統(tǒng)中也必須能夠很快降解并排出體外。到目前為止，超過40%的臨床藥物都是以GPCRs為靶標篩選得到。然而遺憾的是，腸道中到底有多少受體，這些受體的功能是什么，尚缺少系統(tǒng)研究，更多的食品功能評價依賴于實驗動物和體外細胞實驗[14]。

內(nèi)源性雌激素中的17β-雌二醇（estradiol，E2）是已知3 種受體ERs（Erα、ERβ和GPER）的非選擇性激活因子。17β-E2激活ERs，使之二聚體化并結(jié)合到靶基因的啟動子上。另一條途徑則是激活的ERs和一系列轉(zhuǎn)錄因子互作，形成互作網(wǎng)絡(luò)。質(zhì)膜上的ERs亞類由E2與接頭蛋白（adaptor）和c-類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，Src）等信號分子互作，通過磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3 kinases-protein kinase B，PI3K-Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）途徑介導(dǎo)非基因組學(xué)快速途徑。選擇性激活劑E2（如G-1）或選擇性ERs下調(diào)物（如氟維司群）或選擇性ERs調(diào)節(jié)物（如三氧苯胺），也可以激活定位于細胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的GPER。GPER激活腺苷環(huán)化酶合成環(huán)化腺苷一磷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），激活鈣的動員和c-Src，進一步激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）。MMPs切割肝素結(jié)合表皮生長因子前體（pro heparin-binding-epidermal growth factor，proHB-EGF），釋放游離的HB-EGF，從而反式激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），進一步激活MAPK和PI3K-Akt誘導(dǎo)外加的非基因組學(xué)快速途徑，或基因組效應(yīng)調(diào)節(jié)基因表達。E2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)涉及ERs或轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，也可以直接作用于ERs，或間接結(jié)合于ERs的靶基因上。

1.2 GPER在機體通訊系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用

雖然GPCRs的一個典型特征是七跨膜結(jié)構(gòu)，但GPCRs的根本特征是和G蛋白相偶聯(lián)，利用G蛋白上的鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）將其水解為鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）所釋放的能量發(fā)揮胞內(nèi)信號放大和傳遞作用。典型的G蛋白是由3 個亞基（α、β和γ）組成的異源三聚體蛋白。沒有活性的三聚體可以通過GTP水解為GDP所提供的能量激活并解聚，分別激活下游的信號放大系統(tǒng)。用于激活G蛋白的能量提供者GTP一旦水解為GDP便失去再激活G蛋白的能力，需要由GTP-GDP交換蛋白（酶）換上GTP才能進行下一輪激活過程。但若要保持G蛋白的GTP供能，還需要不斷把GDP再磷酸轉(zhuǎn)化為GTP。由于氧化磷酸化依賴于腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）合成酶復(fù)合物，只能提供ATP，所以GTP的合成主要依賴于α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，KGDH），KGDH對線粒體氧化還原狀態(tài)敏感，是三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶，能夠催化合成琥珀酰輔酶A和ATP與GTP之間的轉(zhuǎn)換。Jesinkey等[18]報道，線粒體GTP（mitochondrial GTP，mtGTP）具有綜合傳感營養(yǎng)狀態(tài)的作用，且mtGTP可以據(jù)此調(diào)節(jié)胰島β細胞及其分泌胰島素的功能；其經(jīng)過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)：1）mtGTP可以提高鈣濃度，而且不依賴于氧化磷酸化促進胰島素分泌；2）mtGTP循環(huán)賦予的胰島素分泌、營養(yǎng)傳感和線粒體增大，不僅有益于健康、增加胰島素儲量，而且不會造成胰島β細胞的“過度疲勞”；3）mtGTP配合胰島β細胞分泌胰島素及其代謝機制實際上構(gòu)成了葡萄糖和氨基酸體內(nèi)代謝平衡的關(guān)鍵；4）胰島β細胞應(yīng)用mtGTP傳感營養(yǎng)的關(guān)鍵機制是線粒體GTP循環(huán)。在此循環(huán)中，mtGTP由琥珀酰輔酶A合成酶形成琥珀酰輔酶A，然后再在琥珀酸硫激酶的作用下，將高能硫酯鍵轉(zhuǎn)移至GDP生成GTP和琥珀酸。這是線粒體TCA循環(huán)中唯一一個不依賴于氧化磷酸化的底物水平磷酸化。與胞漿中底物水平磷酸化不同的是，胞漿中底物水平磷酸化形成的是ATP，完全依賴于糖代謝；而TCA循環(huán)則不僅依賴于糖酵解所產(chǎn)生的丙酮酸經(jīng)脫氫、脫羧和轉(zhuǎn)乙?；纬梢阴］o酶A，也依賴于脂肪酸β-氧化所產(chǎn)生的乙酰輔酶A，還依賴于回補途徑所產(chǎn)生的丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸，因此與糖代謝、脂肪酸代謝和氨基酸、核苷酸代謝途徑構(gòu)成連接和調(diào)控。mtGTP產(chǎn)生于TCA循環(huán)，連接并控制幾乎所有宏營養(yǎng)代謝途徑（中心代謝途徑），mtGTP必須進入胞漿，通過控制G蛋白及其偶聯(lián)受體發(fā)揮營養(yǎng)傳感和吸收控制作用。mtGTP轉(zhuǎn)出線粒體進入胞漿是通過線粒體磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，將mtGTP的高能鍵轉(zhuǎn)移并生成磷酸烯醇式丙酮酸鹽（一種高能代謝物）進入胞漿，從而整合TCA循環(huán)和回補途徑信息控制葡萄糖刺激的胰島素分泌。這一過程中的一系列調(diào)節(jié)，包括異源三聚體G蛋白、小G蛋白、線粒體GTP/GDP交換器、ATP和GTP特異性琥珀酰輔酶A合成酶異構(gòu)體，都依賴于mtGTP循環(huán)。Jesinkey等[18]研究還證明，mtGTP在體外和體內(nèi)誘發(fā)并放大葡萄糖刺激的胰島素分泌，增加mtGTP的合成，增加鈣離子在葡萄糖刺激下的胰島素分泌幅度；mtGTP還可以增加線粒體質(zhì)量、胰島素顆粒體數(shù)量和不引發(fā)脫分化的膜接近尺度或代謝脆性，強調(diào)了mtGTP信號在營養(yǎng)或激素傳感、胰島素分泌、線粒體維護和胰島β細胞健康等方面的重要作用。線粒體中的草酰乙酸鹽、琥珀酸鹽、線粒體磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶通量都會增加mtGTP循環(huán)?；匮a的丙酸鹽可以通過丙酰輔酶Aβ變構(gòu)機制激活丙酮酸羧化酶，在高濃度下抑制胰島素分泌[19-20]，其原因是丙酸鹽減少基礎(chǔ)琥珀酰輔酶A合成GTP。總之，雖然GTP/GDP和ATP/ADP之間可以互相轉(zhuǎn)化，但是它們只在核苷酸合成，特別是DNA復(fù)制原料準備時發(fā)揮作用，而在營養(yǎng)、激素和氧等傳感中發(fā)揮關(guān)鍵作用時存在明顯而嚴格的分工，因此，只有GTP才可以作為G蛋白信號放大的直接驅(qū)動力，而ATP則只能通過磷酸化靶蛋白或化合物發(fā)揮激活作用。

細胞對環(huán)境變化，特別是環(huán)境中營養(yǎng)的傳感與應(yīng)答都必須通過快、慢兩條信號途徑，前者是通過非基因組學(xué)途徑控制離子通道開/關(guān)；而后者則依賴于基因組學(xué)信號途徑傳入細胞核。這兩條途徑都依賴于異三聚體G蛋白或小G蛋白，也就是依賴于GTP循環(huán)。而ATP則主要通過各種激酶激活胞內(nèi)信號途徑。GTP不僅為異三聚體G蛋白提供動力，也為小G蛋白提供動力，蛋白質(zhì)和RNA的核內(nèi)、外轉(zhuǎn)運，蛋白質(zhì)生物合成的起始、延伸等都依賴于GTP，特別是當細胞（包括原核細胞）在碳源和氮源饑餓時，更要依賴于GTP和ATP合成警告素（alarmone）傳遞預(yù)警信號，如通過空載的tRNA進入核糖體A位所傳遞的氨基酸缺乏信號（guanosine 5’-diphosphate 3’-diphosphate，(p)ppGpp），也就是通過激活Relaxed A（RelA）和Spotless T（SpoT）或RelA/SpoT同源蛋白RSH合成。RelA是一種核糖體相關(guān)(p)ppGpp合成酶，負責將ATP的焦磷酸轉(zhuǎn)移到GTP的3’-羥基上，從而合成(p)ppGpp，之后直接以GTP為底物合成ppGpp[21]。SpoT是一種ppGpp合成/水解雙功能酶，在生理上與?；d體蛋白合作，所以它也是一種脂肪酸代謝輔助因子[22]。顯然，這種互作也是脂肪酸饑餓促進合成ppGpp所必需的。SpoT也合成ppGpp，對環(huán)境作出響應(yīng)，包括磷、碳源饑餓。RelA/SpoT同源蛋白幾乎在所有細菌中都可以檢測到，說明ppGpp依賴性嚴謹反應(yīng)是一個通用的通過調(diào)節(jié)自身代謝途徑、細胞分裂、轉(zhuǎn)錄和翻譯控制適應(yīng)營養(yǎng)源和環(huán)境條件的應(yīng)激系統(tǒng)[23]。大量研究表明，ppGpp不僅是氨基酸類氮饑餓傳感和應(yīng)激系統(tǒng)，而且是磷饑餓[24]、碳饑餓、脂肪酸饑餓、各種毒素[25]、抗生素及其耐受[26-27]、干旱、高滲和低滲、高溫、低溫[28]、氧化[29]等惡劣環(huán)境的應(yīng)激響應(yīng)系統(tǒng)[30]。值得注意的是，近年來發(fā)現(xiàn)廣泛分布于所有原核細胞的這一應(yīng)激系統(tǒng)也存在于真核細胞和高等動、植物中。

Sun Dawei等[31]在后生動物中鑒定到SpoT同源序列并命名為Mesh1，人類由HDDC3基因編碼，果蠅則由Q9VAM9基因編碼。他們詳細研究了這些蛋白的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)現(xiàn)，像細菌的此類酶一樣，Mesh1蛋白含有一個水解ppGpp的活性位點和一個保守的His-Asp-box鎂離子結(jié)合基序。與這些結(jié)構(gòu)相一致，Mesh1可以在體內(nèi)、外有效地水解ppGpp的3’-和5’-磷酸。Mesh1也可以抑制SpoT缺陷型致死和RelA誘導(dǎo)的細菌細胞生長延遲。果蠅Mesh1（Q9VAM9）基因缺陷也可以造成生長遲緩和抗饑餓能力受損。微陣列芯片分析表明，在氨基酸饑餓時，Mesh1基因缺失突變將強烈下調(diào)DNA和蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因表達，并上調(diào)應(yīng)激響應(yīng)基因表達。證明后生動物SpoT同源序列具有饑餓響應(yīng)的保守功能[32]。換言之，除有些內(nèi)源性激素可以通過受體酪氨酸激酶向細胞內(nèi)傳遞信號外，幾乎所有外源信號和趨化因子等內(nèi)源信號都需要通過受體和G蛋白偶聯(lián)向細胞內(nèi)傳遞和放大信號。

2 GPER-ER-AHR-EGFR信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

核受體作為經(jīng)典的配體激活轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)需要較長時間的基因組學(xué)信號途徑?，F(xiàn)在已經(jīng)基本確定固醇類配體也可以通過GPCRs介導(dǎo)的快速響應(yīng)途徑，也就是非基因組學(xué)途徑[32]。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的固醇類配體能夠直接激活經(jīng)典固醇受體傳遞快速信號，但是越來越多的證據(jù)表明，這些作用是因為轉(zhuǎn)膜受體的存在。其中最重要的受體就是GPER，它作為一種GPCR，介導(dǎo)雌激素依賴激酶激活，從而發(fā)揮快速響應(yīng)和轉(zhuǎn)錄應(yīng)答作用。這些響應(yīng)通常分為兩類：1）基因組學(xué)響應(yīng)，其特點是需經(jīng)過改變轉(zhuǎn)錄的信號傳遞過程，往往需要數(shù)小時甚至數(shù)天的時間；2）快速信號途徑，即刺激后即刻作出響應(yīng)，只需幾分或幾秒的時間。前者通常與配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活相聯(lián)系，而后者則與生長因子受體和GPCRs相聯(lián)系，通過打開或關(guān)閉離子通道，如鈣離子通道，傳遞信號。GPCRs激活方式也涉及到激酶的激活和NO等第二信使的信號傳遞過程。這些快速信號傳遞屬于非基因組學(xué)應(yīng)答途徑，有別于經(jīng)過轉(zhuǎn)錄控制的信號途徑。然而，這些區(qū)別仍然依據(jù)人為標準評判，因為所有激素（固醇類或其他）似乎都是通過受體協(xié)同控制引發(fā)快速和慢速兩個信號途徑。慢速途徑，即經(jīng)典途徑，往往涉及轉(zhuǎn)錄應(yīng)答過程。而且，非基因組學(xué)途徑同時也引發(fā)慢速的基因組學(xué)途徑，這兩個途徑之間通過復(fù)雜的機制互相協(xié)同，進行快速和慢速兩個水平上的協(xié)調(diào)與控制。

2.1 經(jīng)典固醇受體

固醇類激素家族包括：黃體酮、睪丸酮、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素，其中雌激素是研究最為透徹的成員。固醇類配體的高疏水性使它們可以通過被動擴散進入細胞膜[33]，但是這同時也使得它們更可能聚集在細胞膜上[34]。此外，關(guān)于雌激素基于固醇基團E2、雌激素酮和雌激素酮硫酸鹽的生物調(diào)節(jié)功能的研究已有很多[35]。雌激素活性物質(zhì)包括天然和人工合成的多種化合物。天然雌激素類化合物多發(fā)現(xiàn)于植物，即植物化學(xué)物或植物雌激素。典型的植物雌激素類化合物是黃酮類，如香豆雌酚、異戊二烯化黃酮類或異黃酮[36]。人工合成的雌激素類化合物，即外源性雌激素、環(huán)境雌激素和內(nèi)分泌干擾物，包括各種殺蟲劑、多氯聯(lián)苯二酚、增塑劑以及無處不在的現(xiàn)代社會所暴露的各種低濃度污染物[37]。這些植物和外源性雌激素的主要生理作用是通過經(jīng)典的ERs途徑[38]發(fā)揮類似雌激素的作用。雖然稱之為雌激素，但是也在正常的男（雄）性生殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。至少有兩種典型ERs在人類和嚙齒類動物睪丸中都有表達，但是這些受體在不同細胞中的表達模式和產(chǎn)物有所不同[39]。無論芳香酶或ERα基因刪除都會導(dǎo)致精子發(fā)生混亂和不孕。但是兩種激素的動物模型表現(xiàn)出明顯的生理、細胞和內(nèi)分泌水平上的不同[40-41]。在雌性動物中，刪除ERs基因?qū)ゴ萍に匾蕾囆孕盘柾緩?。芳香酶缺陷和ERα缺陷小鼠相互交叉的表型本質(zhì)揭示了可能還有其他ERs也發(fā)揮重要作用。雌激素依賴信號途徑也在很多非生殖系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵性保護作用，包括心腦血管、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)。有研究表明，雌激素在多個水平上對心腦血管疾病具有保護作用，包括心臟肥大、收縮力減弱、血管柔韌性和膽固醇代謝等[42]。強有力的證據(jù)顯示，多種ERs參與了基因組學(xué)和非基因組學(xué)信號傳遞過程。與此相似，雌激素對骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的保護功能相當復(fù)雜，涉及多種受體和信號途徑[43]。所有這些作用都涉及到ERα和ERβ，而且還涉及到GPER，它們可能通過調(diào)控基因組學(xué)和非基因組學(xué)兩條信號途徑[44]發(fā)揮作用。最早描述的ERs（先定名ER，后定名ERα）是1973年在大鼠的子宮/陰道中提取得到的[45]，其DNA序列測定于1986年[46]，其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)則報道于1997年[47]。第2個ERs，ERβ鑒定于1996年[48]，其受體-配體作用及其核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)機制是識別激素相關(guān)基因啟動子的順式激活激素應(yīng)答元件。雖然ERβ和ERα在DNA序列上具有高度同源性，但是在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活作用結(jié)構(gòu)域的同源性卻相對缺少[49]，這表明它們屬于功能上相互區(qū)別的兩個不同亞類，這也從小鼠敲除ERα和ERβ的研究中得到了進一步證明[50]。ERs先是存在于細胞核中，在細胞核內(nèi)和伴侶蛋白（chaperones）形成復(fù)合物。當配體結(jié)合時，其構(gòu)象改變，導(dǎo)致伴侶蛋白解離，受體二聚體化，然后在相應(yīng)的啟動子位點和DNA結(jié)合，招募輔助因子和/或輔助抑制因子，導(dǎo)致基因表達速率的改變。

2.2 固醇類激素通過GPER受體傳遞信號

已知雌激素和其他固醇類物質(zhì)都傳遞長時間的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號，但是所有這些信號都是以快速信號傳遞作為起點[51]。對于快速信號傳遞，早在1967年有關(guān)固醇類激素發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性的問題一直存有爭議[52]，因為從邏輯上分析，轉(zhuǎn)錄活性不可能在沒有信號傳遞的情況下發(fā)生。例如，經(jīng)典的固醇類受體可以在配體的直接刺激下結(jié)合到DNA上發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，也可以在沒有配體存在的情況下發(fā)揮激活作用[53]，因為它們可以直接結(jié)合到DNA上并不依賴于骨架轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）[54]。而且，經(jīng)典的固醇受體也可以介導(dǎo)激酶的激活作用，如MAPKs、PI3Ks和Src，從而通過磷酸化作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1[55]和血清反應(yīng)因子（serum response factor，SRF）的激活[56]。由固醇類或其他受體類型所產(chǎn)生的激酶的激活作用也可以產(chǎn)生固醇類受體的磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活[57]。因此，快速激活作用可能是經(jīng)典固醇類激素受體細胞信號傳遞的重要效應(yīng)。盡管經(jīng)典的固醇類受體細胞應(yīng)答和激活作用的很多機制都得到了闡述，但是固醇所介導(dǎo)的生理效應(yīng)在很多系統(tǒng)，包括神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、胰腺和骨骼系統(tǒng)的作用機制尚未完全明確[58]。盡管在很多情況下，這些效應(yīng)被描述為經(jīng)典ERs的膜相關(guān)形式所介導(dǎo)[59]，但是一系列經(jīng)典的ERs（特別是ERα）敲除小鼠實驗研究證明，可能還有其他受體發(fā)揮作用[60]。例如，應(yīng)用不能透過細胞膜的雌激素，同樣可以激活雌激素膜受體[61]，應(yīng)用ER拮抗劑也可以得出同樣的結(jié)果，而且該受體需要G蛋白的參與[62]。另外，ERα敲除小鼠仍然表達ERβ，即使ERα/ERβ雙敲除小鼠仍然可以表達選擇性剪切的ER形式[63]，或者通過補償?shù)陌l(fā)育途徑使不存在此途徑的鼠科動物生存。Filardo等[64]于2000年首先鑒定到這樣的受體，并證明該受體為GPR30/GPER，涉及缺少經(jīng)典核受體ERs的雌激素介導(dǎo)的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2-MAPK激活作用[64]。在MCF-7細胞系中，雌激素介導(dǎo)快速增加ERK1/2的磷酸化，表達ERα、ERβ和GPER，但是在MDA-MB-231細胞系中，則表達ERβ，但不表達ERα或GPER，這種應(yīng)答缺失說明ERα[65]或GPER發(fā)揮重要作用。將GPER轉(zhuǎn)染到MDAMB-231細胞系即可恢復(fù)對雌激素的應(yīng)答。這一信號傳遞應(yīng)答也存在于KBr3細胞系，該細胞系表達GPER但缺少ERα和ERβ?？傊?，這些結(jié)果進一步強調(diào)GPER的確參與了雌激素的信號傳遞。進一步的研究還表明，GPER的激活作用還涉及EGFRs的反式激活機制。GPCRs對EGFR的反式激活途徑相對來說還是一個新的概念，涉及Shc蛋白、生長因子結(jié)合蛋白和金屬蛋白酶對proHB-EGF的切割作用[66]。Filardo等[67]描述了GPER介導(dǎo)的cAMP升高可以通過表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）激活ERK1/2使雌激素恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，其作用機制依賴于蛋白激酶A-Raf-1的激活或抑制[67]。因此，這些核受體顯然受各種磷酸肌醇磷酸鹽的激活，通過GPER和經(jīng)典的ERs接受雌激素刺激，從而提供了一種精致的固醇類激素介導(dǎo)的不依賴于傳統(tǒng)的固醇應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄控制機制。對經(jīng)典ERs拮抗劑、激活劑的廣泛研究和鑒定，進一步促進了GPER生物學(xué)作用的闡明。應(yīng)用虛擬/分子生物學(xué)篩選方法鑒定和GPER的選擇性，Bologa等[68]的研究結(jié)果表明，G-1可以抑制E2-Alexa結(jié)合是通過在表達GPER細胞中競爭性結(jié)合雌激素到E2-Alexa，其抑制常數(shù)Ki為5.7 nmol/L，而G-1的Ki僅為11 nmol/L。對ERα和ERβ表達細胞系的類似操作所得到的雌激素Ki分別為0.30 nmol/L和0.38 nmol/L，即當G-1濃度達到1 μmol/L時，沒有顯著性結(jié)合。GPER轉(zhuǎn)染COS7細胞系的結(jié)果顯示，G-1是一種激活劑。為了證明G-1對GPER的選擇性作用，與ERs相比，COS7細胞系不管表達ERα還是ERβ都對G-1沒有響應(yīng)，但是對ERα和ERβ產(chǎn)生了快速響應(yīng)。G-1也可以激活內(nèi)源性GPER，并導(dǎo)致PI3K的激活。

雌激素可以獲準自由進入細胞，從而與胞內(nèi)ERs（包括ERα、ERβ和GPER）結(jié)合。在細胞中，GPER或ER表達在細胞表面，所以雌激素并不需要跨過細胞質(zhì)膜。雌激素結(jié)合到經(jīng)典的ERs上，導(dǎo)致直接的轉(zhuǎn)錄激活和信號傳遞。當激活劑結(jié)合到GPER時，可以激活異源三聚體G蛋白，然后通過G蛋白激活多種效應(yīng)因子，包括腺苷環(huán)化酶催化cAMP的合成、Src和鞘氨醇激酶。之后涉及2 條途徑：激活MMPs切割proHB-EGF，釋放游離HB-EGF；或反式激活EGFR。EGFR的激活導(dǎo)致多種下游事件的發(fā)生，包括磷酸酯酶C（phospholipase C，PLC）、MAPKs和PI3Ks的激活。PLC的激活再通過肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）控制胞內(nèi)鈣儲藏和鈣離子通道開關(guān)。與此同時，MAPKs和PI3Ks的激活導(dǎo)致一系列胞漿途徑的激活，包括核蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用。因此，雌激素刺激可以升高其啟動子不含固醇應(yīng)答元件的靶基因表達。這種聯(lián)合效應(yīng)是通過胞漿信號和核轉(zhuǎn)錄事件共同作用于細胞增殖的結(jié)果。

圖2 雌激素介導(dǎo)的GPR30信號傳遞機制[32]Fig.2 Estrogen mediated GPR30 signaling mechanism[32]

雌激素通過經(jīng)典的ERs和GPER共同介導(dǎo)快速和基因組學(xué)信號傳遞及其交談，如圖2所示。雌激素可以直接激活經(jīng)典的ERs，從而經(jīng)輔助激活因子和輔助抑制因子直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。ERs和GPER兩種受體可以選擇性激活多種激酶途徑，導(dǎo)致ERs的磷酸化；或者通過選擇輔助調(diào)控因子與ERs互作。MAPKs和PI3K也會產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化激活作用，如Elk-1和SRF。由PI3K催化所產(chǎn)生的磷脂酰肌醇三磷酸也可以導(dǎo)致其他核受體家族成員的激活，如固醇合成因子1、肝受體類似物1和cAMP都可以升高并激活轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)cAMP應(yīng)答元件（cyclic AMP response element，CRE）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄活性。ER和GPER似乎也受到調(diào)節(jié)過程的控制，當配體結(jié)合到ER時，同時也啟動了最終的蛋白降解；而多數(shù)GPCRs也都服從脫敏機制。幾乎所有信號途徑都顯示出潛在的互作特性，無論正的還是負的，導(dǎo)致信號傳遞和調(diào)節(jié)的極大復(fù)雜性；而多種表型輸出又都依賴于細胞中各種信號分子之間復(fù)雜的相互作用。雌激素、其他固醇類受體、配體、生長因子和GPCRs都可能反饋信號到信號途徑，在受體和靶基因（CRE、雌激素應(yīng)答原件（estrogen response element，ERE）和血清應(yīng)答原件）表達調(diào)控之間形成一個更加復(fù)雜的細胞活動“交響曲”。

EGF受體受GPCR的反式激活作用，并需要金屬蛋白酶切割proHB-EGF。Prenzel等[69]等研究發(fā)現(xiàn)，proHB-EGF和金屬蛋白酶活性是GPCR信號傳遞和EGFR激活的關(guān)鍵。GPCR誘導(dǎo)的EGFR反式激活機制代表了一種新的認知，因為這需要3 個膜信號傳遞事件，即配體和GPCR互作激活異源三聚體G蛋白，導(dǎo)致一個細胞內(nèi)的信號產(chǎn)生，這個信號進一步誘導(dǎo)跨膜金屬蛋白酶激活，從而誘導(dǎo)膜生長因子前體的胞外加工，從而釋放成熟的因子，然后直接或通過基質(zhì)蛋白聚糖和EGFR胞外結(jié)構(gòu)域互作，最后激活胞內(nèi)信號傳遞，如圖2所示。這種新機制為前列腺癌細胞病理生理學(xué)提供了一個合理的解釋，因此他們假設(shè)[64]，EGFR通過G蛋白介導(dǎo)的生長因子前體酶解激活，代表了一個廣泛的反式激活新機制。并且，一系列具有多樣性生物活性多肽，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、FAS-配體或L-選擇素，都是膜蛋白前體28的加工產(chǎn)物，它們與多種生理紊亂相關(guān)，所以這些膜相關(guān)蛋白酶的加工和成熟可能成為疾病治療的重要靶標。

3 核受體超家族及其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

核受體超家族由500多個成員構(gòu)成，該家族依據(jù)其主要特點，如二聚體化、DNA結(jié)合基序、特異性以及配體結(jié)合情況進一步分為4 類：固醇類受體為第1類、視黃醇X受體異二聚體為第2類、同型二聚體孤兒受體為第3類、單體孤兒受體為第4類[70]。雖然有一些重要的結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)在兩類之間，但部分關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是保守的，可以預(yù)測功能，仍然維持著4 類的分類系統(tǒng)[71]。所有核受體超家族成員都含有一個可變的N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）、一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）、一個鉸鏈區(qū)、一個保守的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ligand-binding domain，LBD）和1 個可變的C-末端結(jié)構(gòu)域（圖3）。2 個最為保守的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成核受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有2 個鋅指基序，用其鉤住，并結(jié)合到細胞核中的染色質(zhì)上[72]。每一類核受體都具有2 個DNA結(jié)合識別序列，分布于兩邊的可變位點，帶有反向重復(fù)、直接重復(fù)或不重復(fù)的DNA序列[70]。核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域保持功能上的高度保守性、雙向特異性和特異性配體的親和性[73]。除孤兒受體外，所有受體都由配體激活。配體結(jié)合到配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)變構(gòu)作用，繼而激活受體[73]。每一類核受體的配體都具有相似的結(jié)構(gòu)，并且配體的分類決定了核受體的類屬[73]。例如，內(nèi)源性表達配體所作用的受體往往都是激素、酶催化配體或尚未確定的配體相關(guān)受體[73]。

圖3 激素家族核受體示意圖[70]Fig.3 Schematic diagram of the hormone nuclear receptor family[70]

雌激素-受體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄在乳腺癌細胞中涉及蛋白輔因子對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控。這個過程包括輔因子對組蛋白的修飾，如乙酰化和甲基化，因此改變靶基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。已經(jīng)有大量特異性輔因子與ERs互作并招募到特異性啟動子區(qū)域的研究，Green等[74]對這些作用進行了綜述，系統(tǒng)分析了這些雌激素-受體互作，招募輔因子對染色質(zhì)進行修飾，改變靶基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用。

3.1 ERs的結(jié)構(gòu)

和其他激素應(yīng)答核受體相似，ERα和ERβ也包含幾個保守的功能結(jié)構(gòu)域。一個N-末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AF-1位于A區(qū)和B區(qū)，該區(qū)在ERα和ERβ之間存在明顯變異；一個DBD定位于C區(qū)內(nèi)，由66 個氨基酸殘基構(gòu)成，包含2 個非等價的富含半胱氨酸的鋅指[75-77]。N-末端的鋅指結(jié)構(gòu)域負責識別ERE，序列為GGTCANNNTGACC[78]，第2個鋅指結(jié)構(gòu)負責穩(wěn)定非特異性蛋白和DNA的互作。鋅指結(jié)構(gòu)還具有約束ER，防止與非經(jīng)典或不完美的ERE DNA基序相結(jié)合的作用[79]。D區(qū)是鉸鏈區(qū)，E區(qū)作為配體結(jié)合區(qū)，屬于LBD，并作為第2個激活結(jié)構(gòu)域AF-2的基礎(chǔ)。與之相鄰的是F區(qū)，是一個可變結(jié)構(gòu)域。整個ER的很多不同結(jié)構(gòu)域都可以通過與特異性輔因子互作發(fā)揮不同功能，但很清楚的一點是，ER的AF-1和AF-2結(jié)構(gòu)域是染色質(zhì)模板激活發(fā)揮有效活性所必需的[80]。ERs的LBD三維結(jié)構(gòu)相似于核受體超家族[81]，雌激素和三苯氧胺（他莫西芬）都是結(jié)合在ER的同一個LBD螺旋形口袋中[47,82]。ER的螺旋3、5和12定位于AF-2結(jié)構(gòu)域，負責識別并連接蛋白組分，組裝轉(zhuǎn)錄裝置，這些螺旋的變異會特異性消除AF-2的活性，導(dǎo)致配體依賴性激活作用。當ER結(jié)合雌激素時，在AF-2結(jié)構(gòu)域與輔因子p160蛋白家族基序LxxLL互作。p160蛋白家族由3 個成員：SRC1、谷氨酸受體相互作用蛋白1（glutamate receptor interacting proteins 1，GRIP1）和乳腺癌擴增性抗原1（amplified in breast cancer 1，AIB1）構(gòu)成，是ER輔因子中最有特色的成員。SRC1的LxxLL基序與ER的AF-2結(jié)構(gòu)域之間的互作發(fā)生在短的兩親性螺旋和ER表面螺旋3、4、5和12所形成的互補大溝之間[83]。這種構(gòu)型上的變化使ER蛋白和其他輔因子之間能夠正確互作并定位，從而促進靶基因轉(zhuǎn)錄。當三苯氧胺的活性代謝物4-羥基三苯氧胺結(jié)合到ER的LBD時，就會誘導(dǎo)其螺旋LxxLL基序模擬輔助激活因子螺旋產(chǎn)生螺旋12結(jié)構(gòu)重排，并因此阻遏p160輔助激活因子的結(jié)合。然而，三苯氧胺的存在不僅可以通過防止輔助激活因子結(jié)合到ER上從而抑制轉(zhuǎn)錄，而且可以改變ER的結(jié)構(gòu)，從而優(yōu)先與第二類輔因子，輔助抑制因子（包括核受體共抑制因子1（nuclear receptor corepressor 1，NCOR1）和核受體共抑制因子2（silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptors，SMRT））[84-86]互作。雌激素和三苯氧胺兩者結(jié)合則具有改變ER三維結(jié)構(gòu)形成、打開或關(guān)閉嵌入位點狀態(tài)的作用，形成一個“閘刀”開關(guān)。

3.2 ERα與輔因子互作

Kos等[63]用染色質(zhì)免疫沉淀法研究ERα與輔因子互作，結(jié)果顯示，在體內(nèi)ER和p160輔因子可以進、出組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）和三葉因子1（trefoil factor family 1，TFF1）啟動子（Box2）循環(huán)，并可以預(yù)計其轉(zhuǎn)錄方式[87-88]。ER和p160控制相關(guān)基因啟動子循環(huán)的生物學(xué)意義尚不完全清楚，但理論上是控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的疏松和開放，以保持多次轉(zhuǎn)錄與循環(huán)。當然這似乎是一個過分簡單的理解，也許這種多次轉(zhuǎn)錄循環(huán)還需要持續(xù)的染色質(zhì)調(diào)控，以便保持常染色質(zhì)條件下有足夠的時間組裝轉(zhuǎn)錄裝置，保證其后的多次基因表達循環(huán)。因此，輔因子的作用可以直接調(diào)控染色質(zhì)，招募蛋白因子，調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)屬性才是最關(guān)鍵的。用三苯氧胺處理的結(jié)果顯示，伴隨雌激素-ER互作，ERα被招募到TFF1啟動子上，控制TFF1啟動子出、入循環(huán)動力學(xué)狀態(tài)。然而，取代p160輔助激活因子的招募，輔助抑制因子NCOR1和SMRT則參與了抑制過程，表明輔助抑制因子調(diào)控染色質(zhì)可能是通過基因表達抑制中的重要控制元件。一系列的證據(jù)支持輔因子在化學(xué)計量學(xué)水平上的波動控制了ERα轉(zhuǎn)錄活性以及平衡和循環(huán)變更機制。AIB1的水平在腫瘤中增加50%以上，在乳腺癌中約放大10%[89]，這表明AIB1的確在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。最近的體外研究結(jié)果也證實，NCOR1和SMRT可以直接發(fā)揮抑制作用，負調(diào)控三苯氧胺的抗腫瘤細胞增殖的治療作用[90]。上述這些研究都強化了不同ER輔因子在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和治療中具有不同的基因表達和調(diào)控作用。

3.3 ER的轉(zhuǎn)錄輔因子與酶活性

近來，最有意義的貢獻就是對轉(zhuǎn)錄控制機制的深入研究，而這些研究是對組蛋白的修飾和鑒定所帶來的。因為組蛋白的修飾控制著染色質(zhì)是否處于轉(zhuǎn)錄因子易接近狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄機制。靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用需要染色質(zhì)在轉(zhuǎn)錄起始位點解凝聚，才能促進轉(zhuǎn)錄起始過程。組蛋白N-末端加上乙?；峭ㄟ^組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（histone acetyl transferases，HATs），而脫掉乙?；鶆t通過組蛋白脫乙?；福╤istone deactylases，HDACs）催化[91]。乙?；饔迷谫嚢彼釟埢咸禺愋园l(fā)生，從而導(dǎo)致賴氨酸正電荷被中和，弱化了組蛋白上賴氨酸側(cè)鏈與DNA互作[92]，增加了轉(zhuǎn)錄裝置對染色質(zhì)的易接近性[93]。如上所述，雌激素結(jié)合ERα即可招募p160蛋白SRC1、GRIP1和AIB1，所有被招募的蛋白都有一個基本的螺旋-環(huán)-螺旋基序，用來介導(dǎo)蛋白-蛋白互作[94]。p160蛋白家族已顯示出在雌激素存在時招募HATs到ER-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的作用。所有p160蛋白都可以和CREB結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein binding protein，CBP）以及p300輔助激活因子互作[95]，具有內(nèi)在的HAT和激活組蛋白亞基3的14位賴氨酸（H3K14）、H4K5、H4K8乙酰化活性，拮抗H2A和2B激活[96]，以及組蛋白H3的14位賴氨酸激活[97]。除和p160輔助激活因子互作之外，p300也可以直接與ER的AF-2結(jié)構(gòu)域互作[98]，并通過與AF-1和AF-2互作增強其協(xié)同作用，促進TATA結(jié)合蛋白（TATA binding protein，TBP）結(jié)合[99-100]。盡管如此，p300和CBP在生物活性方面很多重合，例如，兩者對雌激素靶基因啟動子都有周期性，但是又有所不同。一個可能的解釋是，p300和CBP兩者都是TFF1啟動子染色質(zhì)初期解凝聚所必需的[101]，在染色質(zhì)還沒有完全再凝聚時，又開始了新一輪的轉(zhuǎn)錄，但是新一輪轉(zhuǎn)錄依賴于CBP保留在常染色區(qū)。在前列腺癌細胞系中，p300可以直接調(diào)節(jié)雄激素受體的乙?；癄顟B(tài)[102]，并可作為靶基因染色質(zhì)上的雄激素受體輔因子[103]，這表明HATs對激素抵抗具有調(diào)節(jié)作用。另一個具有HAT活性的ER相關(guān)因子是p300/CBP相關(guān)因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）[104]，這也是酵母菌輔激活因子GCN5的同源蛋白[105]。PCAF與ER互作是間接的，PCAF可以自乙酰化或被p300乙?；?，從而提供反饋調(diào)節(jié)回路[106]。PCAF對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化也有作用，通過乙酰化H3K9和H3K14增加基因轉(zhuǎn)錄。大多數(shù)相關(guān)研究工作集中在感興趣的1～2 個啟動子區(qū)，但是后來的研究表明，啟動子的乙?；话愣及l(fā)生在ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄期間[107]。生長因子和ERα之間的互作已經(jīng)得到了較充分的研究，并且與非基因組學(xué)途徑緊密相連。但是，ERα更復(fù)雜的情況可能與激酶有關(guān)。雌激素還可以誘導(dǎo)ERα和核因子κB激酶、核因子κB抑制因子激酶（inhibitory nuclear factor κB kinase α，IKKα），在CCND1啟動子上互作，其結(jié)果導(dǎo)致IKKα介導(dǎo)的組蛋白H3[108]誘導(dǎo)CCND1轉(zhuǎn)錄及其磷酸化。周期蛋白D1單獨足以誘導(dǎo)乳腺癌細胞起始DNA的合成[109]，IKKα可以調(diào)節(jié)周期蛋白D1，證明它們也在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮非常重要的作用。

3.4 三苯氧胺-ER輔阻遏因子

很多基因，特別是控制營養(yǎng)吸收和生理代謝過程的基因在不需要繼續(xù)轉(zhuǎn)錄時，就會關(guān)閉。而抑制（關(guān)閉）這些基因的轉(zhuǎn)錄需要將乙酰基團從組蛋白尾巴上去除，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚。三苯氧胺結(jié)合ER，可以進一步招募輔阻遏因子NCOR1和SMRT1，這一功能主要用作接頭分子，進一步招募并控制HDAC的激活作用。ER-三苯氧胺復(fù)合物通過被稱為CoRNR框（CoRNR boxes）的基序與ERα的螺旋3和5互作，這些都是構(gòu)成招募ERα轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵。NCOR1和SMRT與ER-三苯氧胺復(fù)合物互作，進一步導(dǎo)致與HDAC3、HDAC1和核小體重組裝以及組蛋白脫乙酰化復(fù)合物Nu-RD在TFF1啟動子上的互作[110]。三苯氧胺結(jié)合NCOR1-HDAC3和Nu-RD-ER-復(fù)合物是有區(qū)別的，雖然兩者都可以結(jié)合在相同的啟動子區(qū)域，但是它們并不是同時出現(xiàn)，表明可能是一個快速交換不同輔阻遏因子復(fù)合物的過程[110]，以保證處于異染色質(zhì)的環(huán)境。

ERα開啟和關(guān)閉形成約45 min的染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄循環(huán)。這些循環(huán)由以下系列事件組成：先驅(qū)因子FOXA1結(jié)合到異染色質(zhì)上（圖4中I部分所示）決定ERα結(jié)合的基因組，然后進行雌激素刺激，ERα與TFF1啟動子聯(lián)合，然后HATs被招募進行局部乙?；▓D4中II部分所示）。與此同時，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferases，HMTs）結(jié)合，p160輔助激活因子也在TFF1啟動子上聚集。RNA聚合酶II（RNA polymerase II，PolII）和轉(zhuǎn)錄裝置在ERα后面加載并伴隨組蛋白甲基化增加（圖4中III部分所示）。當染色質(zhì)上ERα蛋白減少時，剩下的ERα與SWI/SNF復(fù)合物的各組分聯(lián)合，HATs和AIB1以及轉(zhuǎn)錄裝置處于低水平（圖4中IV部分所示）。當ERα水平又開始增加時，下一輪循環(huán)伴隨著HMTs、轉(zhuǎn)錄因子、HATs（不是p300）、適配體蛋白和p160輔因子的增加而開始（圖4中V部分所示）。當ERα水平在染色質(zhì)上達到最大值時，HMTs和p160蛋白又開始減少，只留下HATs、適配體蛋白和轉(zhuǎn)錄裝置（圖4中VI部分所示）[110]。

圖4 染色質(zhì)免疫沉淀法測定ER和輔因子在TFF1啟動子所啟動的循環(huán)動力學(xué)Fig.4 Cycling kinetics of ER, and co-factors at the TFF1 promoter as determined by chromatin immunoprecipitation assay

如圖4所示，輔阻遏物水平變化提示其在調(diào)節(jié)乳腺癌進程中發(fā)揮作用。在乳腺癌中，NCOR1水平下降，表明癌癥開始擴散[111]。在模型鼠中NCOR1水平下降意味著三苯氧胺抵抗[112]。同樣，在乳腺癌患者中直接抑制NCOR1或SMRT可以逆轉(zhuǎn)三苯氧胺對腫瘤生長的抑制作用[113]。雌激素可以抑制NCOR蛋白水平，并不改變其mRNA水平[114]，這可能是由蛋白酶體降解NCOR所造成的[115]。此外，還發(fā)現(xiàn)雌激素降低NCOR1水平的證據(jù)有，低水平的NCOR1往往對應(yīng)于晚期乳腺癌或乳腺癌對三苯氧胺反應(yīng)遲鈍，這可能是由輔阻遏物化學(xué)計量學(xué)改變影響了ERα的轉(zhuǎn)錄輸出引起，當然這還需要進一步的臨床證據(jù)。最近的研究已經(jīng)獲得了ERα介導(dǎo)抑制作用的直接證據(jù)，證明周期素G2（cyclin G2，CCNG2）基因是雌激素抑制靶基因，ERα的確可以直接招募HDAC1和NCOR1到CCNG2啟動子上[116]。

3.5 核受體通過輔助因子所形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[117]

核受體-輔助調(diào)節(jié)因子之間的互作研究開始是基于細胞為基礎(chǔ)的實驗方法[118-121]以及輔助調(diào)節(jié)因子-核受體互作微陣列實時檢測技術(shù)（microarray assay for realtime coregulator-nuclear receptor interaction technology，MARCoNI），用這些方法可以比較配體與受體，包括核受體-突變體之間的互作[122-123]、核受體翻譯后的修飾及其對核受體-輔助調(diào)節(jié)因子互作的影響等[124]。

在無配體的條件下，輔阻遏物通過LxxxIxxxL基序（L代表亮氨酸、I代表異亮氨酸、x代表任何氨基酸）互作?？康紸F2結(jié)構(gòu)域的表面（螺旋3/4/5/12界面）[125]。當配體結(jié)合后，LBD經(jīng)歷一個構(gòu)象上的變構(gòu)作用，涉及重新定位和螺旋12的穩(wěn)定化，導(dǎo)致輔阻遏物結(jié)合與釋放，以及輔激活物（亦即輔調(diào)節(jié)開關(guān)）的招募，最后激活靶基因的過程。輔激活物通過LxxLL基序結(jié)合核受體[126]。配體的本質(zhì)決定了螺旋12的精確位置以及隨后與輔激活物的互作[127]。一些輔阻遏物，包括配體依賴性輔阻遏物通過LxxLL基序結(jié)合到核受體上[128]。輔阻遏物基序和輔激活物基序形成一個兩親性α-螺旋，其疏水性殘基?？吭诤耸荏w的LBD界面上。核受體的LBD互作可能并不能認作所謂兩相開關(guān)（“on/off” switch）模型，更應(yīng)該把核受體的LBD看作“可變電阻”，調(diào)控不同核受體結(jié)構(gòu)域和輔助調(diào)節(jié)因子變構(gòu)之間的微調(diào)變構(gòu)機制，從而產(chǎn)生一個分級信號輸出[129]。

至少已有350 種核受體輔助調(diào)節(jié)因子得到鑒定[130]。核受體輔助調(diào)節(jié)因子形成一個結(jié)構(gòu)多樣的蛋白質(zhì)族群，并常常表現(xiàn)出遍在的表達模式。輔助調(diào)節(jié)因子在對核受體特異性和親和性上往往表現(xiàn)出相互重疊。這些互作常常是短暫的，含有很多輔助調(diào)節(jié)因子和多個互作基序，因而產(chǎn)生一個龐大的，具有不同潛力、不同程度的互作，導(dǎo)致核受體介導(dǎo)的基因表達輸出[131]。核受體-輔助調(diào)控因子之間的互作體現(xiàn)在由核受體-輔助調(diào)節(jié)因子信號傳遞所引起的各種特異性疾病上。至少有160 種輔助調(diào)節(jié)因子與病理學(xué)狀態(tài)有關(guān)，包括各種類型的癌癥[132]。關(guān)于核受體-輔助調(diào)節(jié)因子互作，包含應(yīng)用各種肽類為基礎(chǔ)的方法、時間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移[133]、噬菌體展示技術(shù)[134]和基于多路復(fù)用微球方法配合流式細胞術(shù)[135]等所做的研究。高通量谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶下拉實驗[136]、基于雙雜交的方法[137]和蛋白微陣列[138]都提供了一系列深入調(diào)查經(jīng)純化的全長輔助調(diào)節(jié)因子和核受體蛋白互作研究工具。但是在這些研究中，并不能為核受體的完整特性、互作的具體機制以及為核受體家族成員提供更多具體信息[139]。除一般結(jié)合作用（例如，α-螺旋的完整性在輔助調(diào)節(jié)因子基序上的完整性）外，核受體-輔助調(diào)節(jié)因子互作的特異性、選擇性等仍知之甚少。

高通量核受體-輔助調(diào)節(jié)因子分析預(yù)期可以改善對核受體-輔助調(diào)節(jié)因子互作組學(xué)的了解。應(yīng)用MARCoNI技術(shù)[140]，Broekema等[117]系統(tǒng)分析了24 種核受體和154 種輔助調(diào)節(jié)因子基序之間的結(jié)合，獲得了3 696 個核受體-輔助調(diào)節(jié)因子互作數(shù)據(jù)，建立了每一種核受體-輔助調(diào)節(jié)因子獨特的互作數(shù)據(jù)。對核受體-輔助調(diào)節(jié)因子數(shù)據(jù)依據(jù)核受體氨基酸序列進行層次和核受體-輔助調(diào)節(jié)因子精細互作聚類分析，結(jié)果表明，該核受體-輔助調(diào)節(jié)因子肽互作組學(xué)數(shù)據(jù)分析可以為營養(yǎng)、臨床、藥物篩選、設(shè)計與應(yīng)用的研究提供一個開放的數(shù)據(jù)資源。核受體和輔助調(diào)節(jié)因子之間的互作動力學(xué)在核受體介導(dǎo)的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。通過細胞獨立因果分析和基于肽的微陣列分析，Broekema等[117]還系統(tǒng)生成了3 696 個核受體-輔助調(diào)節(jié)因子互作整體圖譜。雖然核受體亞家族表現(xiàn)出相似的輔助調(diào)節(jié)因子互作輪廓，但是每一種核受體都有其獨特的輔助調(diào)節(jié)因子互作特性，反之亦然。輔助調(diào)節(jié)蛋白的LxxLL和LxxxIxxxL基序具有不同的核受體特異性、基序選擇性，甚至混合特性。這些數(shù)據(jù)還表明，核受體的LBD和輔助調(diào)節(jié)因子基序兩者的氨基酸序列都在決定輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合中發(fā)揮重要作用。

核受體是脊椎動物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，幾乎調(diào)節(jié)著所有生理活動[141]，包括細胞生長與分化、代謝進程、生殖、發(fā)育和體內(nèi)平衡[142]。核受體的轉(zhuǎn)錄激活作用受內(nèi)源親脂性化合物和輔助激活因子或阻遏物的控制[143]。人類基因組含有48 個核受體成員[71]，序列比對和系統(tǒng)樹構(gòu)建結(jié)果表明，人類核受體（human nuclear receptor，hNR）家族分為7 個進化上相同的亞家族[144]。劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)-先天性腎上腺發(fā)育不良蛋白1（dosagesensitive sex reversal- adrenal hypoplasia critical region on chromosome X protein 1，DAX1，又稱NR0B1）及其緊密相關(guān)的Src同源區(qū)2蛋白酪氨酸磷酸酶（Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase，SHP，又稱NR0B2）是兩種非典型孤兒受體，屬于hNR家族的NR0B亞家族，它們?nèi)鄙俚湫偷匿\指DBD和其他hNR成員的輔阻遏物活性[145]。這兩種蛋白質(zhì)在哺乳動物代謝、生殖、營養(yǎng)和甾醇類合成中發(fā)揮重要作用，它們的突變體往往產(chǎn)生多種疾病，如癌癥、腎上腺發(fā)育不良、罕見的男性遺傳病，并且伴隨低促性腺素性功能減退癥等疾病[146]。DAX1具有一個獨特的N-末端結(jié)構(gòu)域三重復(fù)區(qū)，三重復(fù)的每一個結(jié)構(gòu)域又擁有一個保守的富含亮氨酸受體結(jié)合基序，即LxxLL基序，該基序通常發(fā)現(xiàn)于hNR輔助激活因子[147]。SHP也含有兩個LxxLL基序，一個位于N-末端結(jié)構(gòu)域，另一個位于C-末端結(jié)構(gòu)域[148]。LxxLL基序通過特異性識別并與AF-2結(jié)構(gòu)域互作介導(dǎo)DAX1/SHP的同或異二聚體與各種hNR成員互作[149]。最近，在人類基因組中鑒定了一系列DAX1/SHP缺陷癥，包括NUR77、組成型雄烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）、SF1和LRH1；它們涉及多種生理功能和病理進程，例如，異生物質(zhì)代謝、亞細胞定位、原發(fā)無精癥和先天性腎上腺發(fā)育不全[150]。于是，Wu Tao等[151]成功設(shè)計了一系列可以驅(qū)使構(gòu)象改變，瓦解癌基因轉(zhuǎn)錄輔阻遏物與NaC1及其伙伴POZ蛋白形成二聚體的構(gòu)象。Walensky等[152]同時還設(shè)計了一種碳氫化合物裝訂技術(shù)，改進完整hNR基于LxxLL的親和作用，但是并不改變裝訂的Src相互作用蛋白（Src-interacting proteins，SIPs）特異性結(jié)合框架。這種技術(shù)與傳統(tǒng)的殘基突變及化學(xué)修飾相比，既可以改變肽類配體的親和性，又可以改變特異性。這就意味著碳氫化合物裝訂后，親和性增加的SIPs可以特異性地與它們的親本LxxLL基序競爭hNR陣列，因為它們具有和親本完全相同的靶向特異性。

非典型孤兒受體DAX1和SHP組成hNR家族的NR0B亞家族。這兩種受體缺少典型的DBD，并作為其他hNRs的輔阻遏物。DAX1和SHP結(jié)構(gòu)域分別含有3 個和2 個保守的LxxLL基序，可以被hNR蛋白的AF-2結(jié)構(gòu)域以激活構(gòu)象的形式識別并結(jié)合。Broekema等[117]為探討5 種DAX1/SHP LxxLL基序和人類基因組中發(fā)現(xiàn)的所有48 種hNR的AF-2結(jié)構(gòu)域之間的系統(tǒng)性互作規(guī)律，分析這些基序靶向完整結(jié)構(gòu)域排列的特異性和親和性，設(shè)計出基于LxxLL的碳氫裝訂肽，可以利用該肽靶向特異性互作的每一個基序?；诮Y(jié)構(gòu)域-基序復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型和結(jié)合力計算，獲得每一個基序和完整hNR陣列的特異性互作，然后通過定量化測定這些基序之間結(jié)合力、相似性和相關(guān)性，構(gòu)建了一個從基序到結(jié)構(gòu)域的加權(quán)-靶向網(wǎng)絡(luò)。

動力學(xué)模擬揭示基于LxxLL肽在非結(jié)合狀態(tài)具有高度靈活性，因此，不利于被AF-2結(jié)構(gòu)域識別與結(jié)合。碳氫化合物裝訂技術(shù)則可以用來幫助這些松散的肽活化螺旋構(gòu)象，因此大大改善它們與hNR系列的親和性結(jié)合。碳氫化合物橋設(shè)計用于標記活化的口袋結(jié)構(gòu)域，并不破壞結(jié)構(gòu)域和肽之間的直接互作。雙重作用授予該裝訂對結(jié)構(gòu)域和肽之間互作焓和脫溶僅具有中度影響，但可以分離和回收結(jié)合熵。對肽配體，其熵減可以大致看作一個常數(shù)，用以改良肽與完整結(jié)構(gòu)域系列之間的絕對結(jié)合與親和力，但是并不改變肽結(jié)合不同特異性結(jié)構(gòu)域的相對親和力。總之，裝訂肽可以被看作潛在的競爭對手，選擇性靶向它們在DAX1和SHP蛋白中的親本LxxLL基序，從而介導(dǎo)圖5所示的特異性、復(fù)雜性互作網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)眾多靶基因表達。

圖5 基于結(jié)構(gòu)域-基序復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型和結(jié)合力計算所構(gòu)建的有向加權(quán)網(wǎng)絡(luò)[117]Fig.5 Weighted source target network from 5 peptides to 48 domains[117]

3.6 AHR與核受體之間的復(fù)雜關(guān)系

AHR作為一種高度保守的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，可以被多種進入細胞內(nèi)的外源和內(nèi)生固有配體激活[153]。除可以進一步激活異源物質(zhì)代謝酶之外，還參與造血系統(tǒng)、肝和免疫系統(tǒng)的發(fā)育與分化。越來越多的研究證明，它在免疫應(yīng)答和誘發(fā)炎癥并保持炎癥狀態(tài)等方面發(fā)揮重要作用。公認的觀點是，AHR作為炎癥分子的下游靶標，其轉(zhuǎn)錄受到炎癥級聯(lián)放大系統(tǒng)的控制。白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）已被公認為早期炎癥的標志，并直接影響AHR的表達。重要的是，該受體控制信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）激活，并和其他炎癥介質(zhì)互相配合。在選擇性炎癥環(huán)境下，一旦激活，AHR便與包括IL-6在內(nèi)的靶標互作，發(fā)起一輪自發(fā)性炎癥循環(huán)。這些證據(jù)表明，AHR是炎癥的擴大和持續(xù)放大系統(tǒng)。就很多炎癥介導(dǎo)者而論，它們以AHR作為至關(guān)重要的傳感器和異源物代謝激活劑。AHR的敏感性環(huán)境配體可以解釋某些芳香烴類化合物往往會引發(fā)某些個體的過敏和持續(xù)的炎癥狀態(tài)。因此，AHR可以被看作一個放大器，結(jié)合內(nèi)源和外源配體與環(huán)境刺激并作出免疫應(yīng)答。AHR的螺旋-環(huán)-螺旋基序是一個進化上非常保守的、遍在表達的生物傳感受體。AHR具有多種配體，僅植物的吲哚和二苯乙烯苷以及動物源如前列腺素G2兩類配體就有110 種以上。來自環(huán)境和化學(xué)合成的多環(huán)化合物有114 種，都可以激活A(yù)HR[154]。AHR連接內(nèi)生和外源配體，調(diào)節(jié)一系列基因表達，包括相I細胞色素P450酶（cytochrome P450 proteins，CYP）系統(tǒng)（如CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1）和相II酶系統(tǒng)（如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）[155]。AHR還和一系列相關(guān)細胞途徑和基因互作，包括某些控制細胞周期的基因，如生長、分化、增殖和凋亡基因[156]。在無配體存在時，有熱休克蛋白90、AHR互作蛋白、輔伴侶蛋白p23和一種蛋白酪氨酸激酶pp60src在胞漿中與AHR結(jié)合，使之保持靜息狀態(tài)。一旦有配體結(jié)合，該伴娘復(fù)合物便轉(zhuǎn)位進入細胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，亦即無活性的復(fù)合物裂解，AHR結(jié)合到AHR核轉(zhuǎn)運蛋白（AHR nuclear translocator，ARNT）/缺氧誘導(dǎo)因子1β上，最終形成新AHR/ARNT復(fù)合物與靶基因的異源物質(zhì)響應(yīng)元件互作[157]。

敗血癥是由感染造成的系統(tǒng)性炎癥綜合征。敗血癥免疫應(yīng)答的特點是同時激活促炎和抗炎兩條途徑。當敗血癥發(fā)生時，很多發(fā)炎細胞因子表達和激活是其顯著特征。異源化合物受體作為化合物傳感轉(zhuǎn)錄因子在藥物代謝酶（drug-metabolizing enzymes，DMEs）的表達調(diào)控中發(fā)揮特殊作用。異源化合物受體介導(dǎo)敗血癥和藥物代謝之間的功能調(diào)控。因為炎癥細胞因子在敗血癥期間分泌并作用于異源化合物受體的表達和激活，從而影響DMEs的表達和激活。異源化合物受體也可以反過來作用于敗血癥的臨床癥狀。Lü Chuanzhu等[158]對這類受體和敗血癥之間的聯(lián)系進行了詳細綜述。異源化合物受體（如孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）、AHR、糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）和CAR）、藥物代謝酶（如CYP1A、CYP2B6、CYP2C9和CYP3A4）以及藥物運載體（如p-糖蛋白和多重耐藥蛋白）都作用于敗血癥。AHR也是一種生理節(jié)奏性蛋白，也稱為ARNT、專一蛋白結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子和典型異源化合物受體。雖然AHR并不屬于核受體超家族，但是通過AHR傳感化合物和調(diào)節(jié)DMEs的模式卻非常相似于異源化合物核受體。除異源化合物傳感功能之外，AHR在保持體內(nèi)生理平衡，參與細胞增殖與分化、免疫應(yīng)答、基因表達調(diào)控、激素代謝、炎癥、免疫自識別及其對外部刺激的響應(yīng)等方面發(fā)揮重要功能。AHR是炎癥反應(yīng)，特別是脂多糖誘導(dǎo)的炎癥信號級聯(lián)放大不可缺少的，與炎癥因子的分泌密切相關(guān)[159-160]。值得注意的是，上調(diào)或激活A(yù)HR表達也可以調(diào)節(jié)抗炎癥細胞因子IL-10的表達，下調(diào)促炎細胞因子IL-6和IL-8的表達，由此抑制炎癥反應(yīng)，保持免疫平衡，改善敗血癥的發(fā)生和預(yù)后。IL-10在敗血癥早期感染過程中通過多種免疫細胞抑制炎癥反應(yīng)，限制組織損傷和免疫病理作用[161]。IL-10受多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)節(jié)。不斷積累的研究揭示，AHR是IL-10表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。Src酪氨酸激酶，作為9 種非受體酪氨酸激酶之一，是一種已知的細胞內(nèi)靶蛋白，介導(dǎo)酪氨酸磷酸化。Src酪氨酸激酶可以誘導(dǎo)IL-10合成與分泌，下調(diào)促炎因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的表達[162]。已知STAT3是脂多糖誘導(dǎo)炎癥因子表達的信號傳遞和激活因子。STAT3通過結(jié)合到內(nèi)含子4調(diào)節(jié)IL-10的表達，STAT3也是IL-10的下游調(diào)節(jié)因子。IL-10還可以以自分泌的形式激活STAT3[163]。Lü Chuanzhu等[158]報道了Src酪氨酸激酶和STAT3兩者磷酸化以及IL-10表達可以減少AHR敲除小鼠的炎癥性巨噬細胞的衍生。這些結(jié)果都證明AHR對IL-10表達的非基因組學(xué)途徑的正調(diào)控作用，而這一調(diào)控作用依賴于酪氨酸磷酸化介導(dǎo)的Src酪氨酸激酶和STAT3激活作用[164]。Zhu Junyu等[164]的研究證明，AHR對IL-10的正調(diào)控作用可以通過特異性Src酪氨酸激酶抑制劑降低，而且Src酪氨酸激酶抑制劑可以降低STAT3的磷酸化，說明Src酪氨酸激酶可以誘導(dǎo)IL-10上游的STAT3的激活。這些結(jié)果證明，AHR的激活可以增強Src酪氨酸激酶的磷酸化，然后，磷酸化的Src酪氨酸激酶（p-Src酪氨酸激酶）上調(diào)STAT3的磷酸化，磷酸化的STAT3（p-STAT3）接著正調(diào)控巨噬細胞合成與分泌IL-10?？梢?，AHR激活的炎癥抑制作用可以改善機體對脂多糖的耐受性、調(diào)節(jié)免疫功能、降低敗血癥引起的死亡率。異源化合物引發(fā)炎癥主要是通過炎癥因子的釋放，如IL-1β、IL-6和TNF-α，與此同時，異源化合物受體（如PXR、AHR和GR）接受相應(yīng)配體刺激后也會靶向DMEs，從而啟動代謝和排毒程序-藥代動力學(xué)進程。越來越多的證據(jù)表明，異源化合物受體是藥物代謝的重要介導(dǎo)者。顯然，這完全證明了中國祖先“相生-相克”的哲學(xué)思想。DMEs主要用于藥物代謝，將PXR和AHR用作炎癥性疾病的治療藥物篩選靶點值得研究。

核受體可以針對環(huán)境變化快速激活/抑制免疫應(yīng)答和適應(yīng)環(huán)境變化的基因表達。然而，核受體對免疫系統(tǒng)的作用卻缺少可靠的實驗動物模型，以探討核受體在體內(nèi)和免疫系統(tǒng)的復(fù)雜互作。Diaz等[165]應(yīng)用斑馬魚作為動物模型，考察了維甲酸受體（retinoic acid receptor，RAR）、肝X受體（liver X receptor，LXR）和負責胞漿傳感AHR的免疫學(xué)作用。雖然同步激活作用并不能影響真實的靶基因表達，但是RAR誘導(dǎo)的il17a/f3可以由LXR和AHR發(fā)揮拮抗作用，反之，il22就會受到AHR，但不是LXR的拮抗作用。而且，維甲酸可以減少il10基因表達，這一表達進一步由于LXR激活作用而降低。因此可以用斑馬魚幼體進行組合性核受體激活作用研究。他們的研究還證明，LXR可以拮抗維甲酸誘導(dǎo)的細胞因子表達，從而為研究LXR和AHR調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答機制提供了一個實驗動物操作平臺[165]。

化學(xué)致癌物3-三甲膽蒽（3-methylcholanthrene，3MC）結(jié)合到AHR上，調(diào)控CYP1B1家族的CYP酶的表達，該酶參與環(huán)境污染所造成的致癌基因的激活作用以及雌激素的合成與代謝。3MC顯示出誘導(dǎo)雌激素應(yīng)答并結(jié)合到ERα上，刺激AHR和ERα互作功能。近來，已經(jīng)報道GPER介導(dǎo)了某些內(nèi)源性雌激素和環(huán)境化合物引起的雌激素樣活性。Cirillo等[166]首先將3MC與GPER互作，確定其嵌入GPER，然后在SkBr3細胞和CAFs細胞建立了3MC激活EGFR/ERK/c-Fos信號，并通過AHR和GPER對兩者的細胞信號傳遞的途徑進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些受體參與了CYP1B1和周期蛋白D1的上調(diào)表達，并在3MC的誘導(dǎo)下產(chǎn)生生長刺激作用。這說明3MC可能引發(fā)了AHR和GPER之間的生理和功能性互作，導(dǎo)致SkBr3乳腺癌細胞和CAFs細胞兩者之間的互作和信號傳遞，從而誘發(fā)了GPER和AHR的細胞信號傳導(dǎo)，推進了乳腺癌的進程。

4 GPER及其與配體互作

4.1 GPER的分布

最早關(guān)于克隆并表達了GPER的研究是在1996和1997年[32]。GPER的轉(zhuǎn)錄廣泛分布于正常和惡性腫瘤患者的組織，高水平表達于心臟、肺、肝、腸道、卵巢和大腦[167]。一些原發(fā)性乳腺癌[168]和淋巴瘤[169]也有GPER表達。當然，這些早期的研究只限于對細胞系的研究。但是，近年來，GPER抗體的應(yīng)用促進了GPER組織分布的詳細調(diào)查。這些研究為我們提供了一個有關(guān)GPER多種功能的基本框架，其功能主要集中于雌激素依賴性生理響應(yīng)。鼠科動物的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，不僅在各種組織中都發(fā)現(xiàn)GPER不同程度的表達，而且在雌、雄性動物中都有表達，只是表達量明顯不同。總體上，GPER表達更多地集中在上皮細胞和肌肉相關(guān)性間葉細胞/成纖維細胞。Luttrell[170]通過免疫組化技術(shù)分析了成年大鼠，發(fā)現(xiàn)其GPER主要表達于下丘腦垂體-腎上腺軸、海馬體和腦干自主核。這些研究結(jié)果表明，GPER對于生殖、分化、發(fā)育、腸道傳感、吸收、代謝平衡、內(nèi)分泌、神經(jīng)、免疫，特別是各種上皮細胞的信號傳遞等具有重要作用。

4.2 GPER和核受體的結(jié)構(gòu)與功能

雌激素和其他配體通過擴散進入細胞并結(jié)合到細胞核的ERs上，影響基因表達和細胞表現(xiàn)型。這種結(jié)合并激活相應(yīng)受體的二聚體化進一步促進受體二聚體在DNA靶基因啟動子區(qū)的直接互作，從而激活或抑制轉(zhuǎn)錄。ERs的兩種亞型屬于核激素受體超家族，當與各自的配體結(jié)合后具有轉(zhuǎn)錄因子功能[171]。核受體具有通常的結(jié)構(gòu)和功能特點。典型的ER（現(xiàn)稱之為ERα）含有595 個氨基酸殘基和一個DBD、一個C-末端激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（hormonebinding domain，HBD）。另外一種ER亞型，被鑒定為ERβ[172]，這是因為它比ERα稍小一些，有530 個氨基酸殘基[173]。而且兩種ER在DBD結(jié)構(gòu)域具有高度同源性（95%）。但是在A/B、D和E結(jié)構(gòu)域很少保守。兩種ER亞型的生理功能也有區(qū)別，特別是HBD具有相當少的同源性（53%），某些配體，如植物雌激素染料木黃酮就是一種ERβ選擇性激活劑[174-175]。而且，ERβ缺少大部分C-末端F結(jié)構(gòu)域。已知該區(qū)域是某些抗雌激素激活劑，如三苯氧胺的激活部位[176]，由于這些A/B和F序列明顯不同，其功能也有明顯改變，所以ERβ高表達可能在三苯氧胺臨床治療乳腺癌所產(chǎn)生的抵抗效應(yīng)上發(fā)揮作用。

ER介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄至少有兩個不同的反式激活結(jié)構(gòu)域，定位于受體氨基末端的A/B區(qū)（即AF-1）和羧基末端的E區(qū)（即AF-2）[177]。AF-1結(jié)構(gòu)域不依賴于激素，而AF-2結(jié)構(gòu)域則是激素依賴性結(jié)構(gòu)域[178]。AF-1和AF-2兩者都需要最大ER轉(zhuǎn)錄活性。但是，對于某些啟動子，AF-1和AF-2則可以獨立發(fā)揮功能[179]。有研究證明，ERβ的AF-1區(qū)激活作用和ERα相比幾乎可以忽略不計，而AF-2的激活作用則具有可比性[180]。因此，ERα對ERE的激活作用可能超過ERβ，因為ERE控制的基因需要兩個反式激活結(jié)構(gòu)域的存在?？勾萍に兀缛窖醢穼@些基因只發(fā)揮單純的拮抗劑功能，只需要ER的AF-2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。相反，三苯氧胺則只能作為部分激活劑通過AF-1驅(qū)動轉(zhuǎn)錄，并不需要AF-2結(jié)構(gòu)域[181]。激素結(jié)合和二聚化后，ERs以其DBD的高親和性結(jié)合到DNA的特異性位點，也就是ERE上。當然，有些配體也可以通過ER結(jié)合其他靶基因應(yīng)答元件的啟動子區(qū)發(fā)揮功能。ERα和ERβ還可以形成異二聚體，從而改變對基因的反式激活作用。除這種經(jīng)典的直接結(jié)合DNA的機制之外，這兩種ER亞型還可以激活其他途徑[182-183]。例如，AP-1應(yīng)答元件間接受ER和AP-1轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和c-Jun之間的互作調(diào)節(jié)[184]。這些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)的基因參與很多細胞過程，包括細胞增殖、分化、運動和凋亡。因此，ER-AP-1互作可能具有重要的臨床意義。研究顯示，當ERα和ERβ表達時，三苯氧胺可以作為激活劑作用于AP-1應(yīng)答元件所控制的基因。但是，與此形成鮮明的對比，E2在ERβ單獨表達時，并不能激活這些基因[185]。這些發(fā)現(xiàn)說明選擇性ERs調(diào)節(jié)劑往往具有不同的功能。

和其他生長因子信號途徑之間的交談是ER發(fā)揮細胞調(diào)控作用的另一個值得關(guān)注的途徑。例如，酪氨酸激酶受體-EGF家族成員可以通過直接磷酸化關(guān)鍵性氨基酸殘基激活ERs[186]。而且在ERs和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）信號傳遞途徑之間存在相當多的交互作用。ERs具有增加一系列IGF關(guān)鍵性信號分子表達的功能，而且IGFs反過來也可以激活ERs[187]。這種通過信號途徑之間的交互作用-交談可能對雌激素非依賴型發(fā)育和/或激素治療臨床抵抗具有重要意義。ERs的晶體結(jié)構(gòu)揭示，在不同配體的刺激下，經(jīng)歷廣泛和不同的構(gòu)象改變[82,47]。ER配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)作用取決于配體及其結(jié)合的本質(zhì)屬性。在雌激素-受體配體復(fù)合物中，ER配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中螺旋12在配體結(jié)合時發(fā)生定位上的改變，在配體上形成一個保護性蓋子。這種ER的構(gòu)象改變暴露出一系列氨基酸以便與特異性輔激活因子結(jié)合。相反，當選擇性ERs調(diào)節(jié)劑，如三苯氧胺或雷洛昔芬結(jié)合后則可以阻止螺旋12配體-結(jié)合口袋的形成。因此，了解螺旋12的精確定位對于ERs轉(zhuǎn)錄激活作用非常重要。

ERs并不能單獨調(diào)控基因表達，很多組織特異性ERs可能依賴于其他因子影響轉(zhuǎn)錄活性。這些受體輔調(diào)節(jié)因子最早發(fā)現(xiàn)并得到研究的是核受體激活所涉及的調(diào)節(jié)因子，因為核受體激活常常受到其他受體和輔調(diào)控蛋白的干擾。這些輔調(diào)控蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)[188]，其功能主要作為受體及通用轉(zhuǎn)錄機器之間的中間介導(dǎo)者，控制和調(diào)節(jié)ERs轉(zhuǎn)錄活性。輔激活因子或弱化（輔抑制）因子，是多種轉(zhuǎn)錄信號傳遞蛋白的輔助整合因子[189]。有些此類蛋白還具有內(nèi)在的組蛋白乙酰化酶或脫乙?；富钚?。一個過度簡單的輔激活/輔阻遏作用模型被用來解釋如何通過招募輔阻遏因子到受體復(fù)合物，從而使其從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。一般而言，輔阻遏因子擁有組蛋白脫乙?；钚?，使核心組蛋白脫乙?；?，將靶基因的啟動子緊密包裝，從而關(guān)閉靶基因的轉(zhuǎn)錄。當配體結(jié)合以后，從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物釋放輔阻遏因子，使受體招募輔激活因子和具有組蛋白乙?；钚缘妮o介導(dǎo)因子。這些乙?；D(zhuǎn)移酶將乙?；拥浇M蛋白上，從而失去與靶基因啟動子結(jié)合的能力，開放靶基因啟動子，適合于基本轉(zhuǎn)錄機器的結(jié)合、識別與轉(zhuǎn)錄。然而，似乎還有更多的酶活性與很多受體輔調(diào)控蛋白活性有關(guān)，包括蛋白酶、泛素連接酶、ATPase和激酶等活性[190]。

在經(jīng)典的ERα信號途徑，E2結(jié)合并誘導(dǎo)ERα二聚體化，然后結(jié)合ERE[191]，調(diào)節(jié)基因表達[192]。配體結(jié)合ERα后，招募輔調(diào)節(jié)因子復(fù)合物和不同種類的酶一起修飾和重構(gòu)核小體，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置[193]。ERα含有核受體超家族的結(jié)構(gòu)域AF模塊，包括位于N-末端結(jié)構(gòu)域的AF-1、一個DBD和一個C-末端LBD。在LBD還含有一個AF-2表面。重要的是，核受體作為一個支架蛋白和配體一起通過LBD微妙的結(jié)構(gòu)變化控制受體-蛋白和受體-DNA互作。這些微妙的結(jié)構(gòu)變化如何引起細胞信號傳遞和活化功能的細微變化，這一問題到目前為止仍然是一個富于挑戰(zhàn)性的研究課題，因為其結(jié)構(gòu)的細微變化尺度可能小于1 ?。換言之，配體與受體的互作所引起的變化可能在單一原子的變化就足以產(chǎn)生不同的信號輸出，該變化尺度和晶體結(jié)構(gòu)的噪音處于同一個水平。所以Nwachukwu等[191]引入了一種系統(tǒng)生物學(xué)和晶體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的方法解決這一關(guān)鍵性難題。他們測定了聯(lián)系緊密的相關(guān)配體的結(jié)構(gòu)與功能、它們與特異性分子骨架之間的關(guān)系及其在LBD組裝晶體結(jié)構(gòu)中的變化。這些方法相結(jié)合，能夠鑒定配體-特異性結(jié)構(gòu)擾動所造成的不同信號輸出；但缺點是，只能定性分析，而且依賴于結(jié)構(gòu)模式的視覺識別；因此又引入了一個定量化、無偏差方法，這種方法能夠?qū)ε潴w與不同的骨架，而不是緊密相關(guān)的骨架互作所產(chǎn)生的聯(lián)動變構(gòu)作用進行分析。此外，他們還通過ERα的晶體結(jié)構(gòu)與變構(gòu)信號傳遞之間的關(guān)系，解決了ERα-LBD復(fù)合物與環(huán)境化合物（擬雌內(nèi)酯、農(nóng)藥雙對氯苯基三氯乙烷和玉米烯酮毒素）所引起的配體對LBD結(jié)構(gòu)的微妙擾動；更有趣的是，對42 種人工合成配體對ERα的LBD擾動所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性、細胞增殖作用的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，它們之間有很好的相關(guān)性，并且通過分析這種相關(guān)性可以進行結(jié)果預(yù)測。這些作用主要發(fā)生在原子間的擾動，處于亞?（the sub-0.5 ?）尺度和X射線衍射測定化學(xué)結(jié)構(gòu)的噪音范圍，但是卻決定了細胞信號的特異性傳遞和應(yīng)答。推測這些原子間互作之所以能夠決定特異性信號傳遞、輸出和響應(yīng)，主要是由EE/ERα的LBD結(jié)構(gòu)域的原子間擾動所產(chǎn)生的聯(lián)動變構(gòu)，以及之后的基因組學(xué)輔助調(diào)節(jié)因子所決定的。

4.3 GPER結(jié)構(gòu)及其與配體之間的互作

GPER與不同配體之間的互作在藥物篩選、雌激素類化合物結(jié)構(gòu)和功能評價等方面具有重要理論意義和應(yīng)用價值[194]。有趣的是，這些化合物，如G1和G15具有明顯相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)[195]；G1擁有一個附加的乙?；撠熣T導(dǎo)GPER構(gòu)象改變，并通過其氧原子空間和/或極性效應(yīng)產(chǎn)生激活作用。極性效應(yīng)存在于所有GPER的激活劑配體（E2、G1、三苯氧胺、氟維司群等）中，但是所有拮抗性配體（G15和G36）都沒有。G36以甲基取代了G1同一位置上的乙?；鵞196]，E2和氟維司群則擁有一個相似的核心化學(xué)結(jié)構(gòu)[197]，但是氟維司群還具有一個附加的疏水長鏈。在E2和三苯氧胺之間除上述提及的氧原子之外，沒有化學(xué)相似性[198]。盡管如此，兩者都能夠與GPER互作[199]，這無疑強化了GPER可以接受多種化合物刺激的機制有別于ERα/β。因此，深入了解GPER的結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點將有助于新型藥物的設(shè)計、篩選與評價[200]。

最近的分子動力學(xué)模擬和鑲嵌研究使GPER的結(jié)構(gòu)元件及其作用機制得到進一步揭示，蛋白結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)變化及分子運動[201]可以為生殖、神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、心腦血管系統(tǒng)相關(guān)疾病治療提供一個新藥設(shè)計平臺[202]。Méndez-Luna等[194]提供了一個GPER的三維結(jié)構(gòu)模型，然后通過分子對接法探討GPER結(jié)合口袋及其與配體的識別特性，調(diào)查關(guān)于激活和鈍化作用機制。為了實現(xiàn)對有關(guān)結(jié)構(gòu)的了解，應(yīng)用一些已知的激活劑（E2、G1、三苯氧胺和氟維司群）和拮抗劑（G15和G36）進行研究。由于這些蛋白隱藏在細胞質(zhì)膜內(nèi)，用傳統(tǒng)的實驗方法難以得到其三維結(jié)構(gòu)。一般X射線衍射或核磁共振波譜學(xué)研究需要利用其水溶性獲得單晶[203]，而這一般只適用于水溶性蛋白[204]。有些GPCRs可以用激活劑或拮抗劑、抗體、突變等進行處理，以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[205]。因此，Contreras-Romo等[206]參考現(xiàn)有的GPCR實驗數(shù)據(jù)和已經(jīng)建立的其他模型，構(gòu)建7TM 3D計算機模擬模型，通過分子對接計算機模擬并結(jié)合已有相關(guān)結(jié)構(gòu)信息，對有關(guān)配體與GPER識別過程進行研究，結(jié)果表明，所有配體和GPER互作都有不同的自由能變化，分子對接和分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示，E2、三苯氧胺和氟維司群與受體互作的結(jié)果隨時間趨向于負值。G1-GPER復(fù)合物是其中最穩(wěn)定的，通過受體-配體識別的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明，G1和G15之間均方根誤差最小，這是由于G1和G15化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性，補償時間為14 ns，而其他復(fù)合物的補償時間為70 ns。顯然，只有G1和G15保持相同的結(jié)合基序，G1和G15相比只有一個額外的乙酰基，因此這個額外的基團就是負責誘導(dǎo)受體適應(yīng)配體活性的構(gòu)象。除G1、G15和G36以外，其他配體都具有另外的殘基賦予它們更多化學(xué)基團，說明該蛋白具有一個可以適應(yīng)不同配體以及潛在的相鄰結(jié)合位點[207]。應(yīng)用分子對接研究還發(fā)現(xiàn)，配體-蛋白形狀可以通過變化來加以適應(yīng)[208]。在這些結(jié)合位點中，Phe278和Phe208是已建立了配體與芳香環(huán)部分互作的氨基酸殘基[209]，而一系列雜環(huán)氫原子也顯示出形成氫鍵的特性，說明在與大分子互作時，可以與更多的功能基團形成氫鍵。芳香族氨基酸簇（F206、F208、F223和F278）揭示了化合物GPER-L1和GPER-L2的生物活性是由于它們作為激活配體，可以與GPER的不同構(gòu)象和不同氨基酸殘基互作[209]。Cys207與G306互作，可能是涉及開關(guān)或活性狀態(tài)切換的關(guān)鍵性殘基。識別G1和G15的氨基酸殘基還可能參與結(jié)合位點的阻斷，或許是Cys207殘基誘導(dǎo)GPER構(gòu)象的改變后，通過G1的乙?；a(chǎn)生阻斷作用。無論哪種情況，上述假說的確得到了該研究結(jié)果的證實，而Cys207和E275也參與了G1和GPER的互作，其他配體激活劑的測定結(jié)果亦如此?？傊@些研究有助于我們對GPER配體結(jié)合口袋的調(diào)查和了解。應(yīng)用已知的激活劑和拮抗劑可以推測，GPER含有一個較大的配體結(jié)合口袋，并通過構(gòu)象改變適應(yīng)各種不同配體的結(jié)合，但是決定性狀態(tài)開關(guān)或切換位點尚待深入研究。

Cao Linying等[210]也用分子對接方法模擬了30 種多溴聯(lián)苯醚（poly brominated diphenyl ethers，PBDEs）和OHPBDEs與GPER的互作。他們成功建立了受體的同源結(jié)構(gòu)模型，模型中配體結(jié)合口袋被定位于跨膜螺旋2、3、5、6和跨膜螺旋TM7深縫隙之中。首先，3 種已知對GPER具有親和性的配體化合物（E2、G1和G15）以及一種無活性的化合物（α-E2）嵌入GPER中用來驗證該模型并作為感興趣PBDEs/OH-PBD的對照。結(jié)果表明，E2通過其17-β羥基嵌入GPER延伸到跨膜螺旋6，與Asn276形成一個氫鍵；與E2相似，G1也通過與Asn276互作，通過乙?；难踉有纬梢粋€氫鍵；G15和α-E2則不能和任何氨基酸殘基形成氫鍵。然后，分別將PBDEs和OH-PBDEs嵌入GPER配體結(jié)合的口袋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些化合物中，有9 種OH-PBDEs與GPER通過其羥基形成氫鍵。但是，不同于E2與Asn276形成氫鍵，OH-PBDEs是通過Ser134、Gln138、Phe208、Glu218、Glu275、His282依賴于OHPBDE和His307形成氫鍵。雖然OH-PBDEs可能通過多種機制發(fā)揮其雌激素作用，但是以上研究結(jié)果明確顯示，只通過其中的一種直接結(jié)合機制發(fā)揮胞內(nèi)信號途徑的激活作用。該研究結(jié)果強調(diào)，OH-PBDE主要是通過干擾雌激素傳遞信號的發(fā)揮功能。

4.4 受體互作網(wǎng)絡(luò)與表觀遺傳修飾

生物通過營養(yǎng)吸收及合成與分解代謝為其發(fā)育、分化和各種復(fù)雜生理活動提供“建筑材料”和能量。顯然，所有的生命活動都離不開這些最基本的“新陳代謝”活性。正因為如此，幾乎所有以往的教科書都把這些不可或缺的代謝和生理活動控制基因稱為持家基因，否則稱為奢侈基因。因為持家基因大多數(shù)編碼了基礎(chǔ)代謝或中心代謝途徑中的酶，所以這些酶往往屬于組成型（一直表達的）酶，只適應(yīng)于某些條件才表達的酶則屬于誘導(dǎo)酶。然而，這些稱之為組成型酶的基因是否在基因表達水平上不受調(diào)控呢？顯然不是。生物對食物和營養(yǎng)的需求受到環(huán)境、飲食和營養(yǎng)的限制和調(diào)節(jié)。Emmett等[211]綜述認為，基因表達，特別是持家基因表達的精確調(diào)節(jié)對于哺乳動物生長、發(fā)育、生理、內(nèi)平衡及其對環(huán)境的適應(yīng)極其重要。越來越多的研究結(jié)果證明，基因表達調(diào)控首先通過序列特異性轉(zhuǎn)錄因子進行，這些序列主要定位于順式增強元件[212-214]。而這些轉(zhuǎn)錄因子則往往依賴于配體的結(jié)合，例如核受體[215-217]。當核受體與配體結(jié)合后，還需要招募不同的轉(zhuǎn)錄輔因子，組裝成一個復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達。在某種程度上，轉(zhuǎn)錄輔因子的招募進一步調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，包括通過HATs對組蛋白乙?；虷DACs對組蛋白脫乙?；痆218]進行寫入或擦除[219-220]。HAT活性往往是轉(zhuǎn)錄輔因子的固有活性，可以通過將乙酰輔酶A的活性乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白氨基端賴氨酸殘基的ε-氨基上，促進基因表達[221-223]。HDACs和HATs的功能恰好相反，它通過去除組蛋白尾巴上的乙?；?，抑制基因表達。大量研究證明具有相反酶功能的精確控制構(gòu)成發(fā)育和生理活動，是合成與分解代謝、物質(zhì)和能量代謝相關(guān)基因表達的關(guān)鍵。哺乳動物基因組編碼了11 個HDAC亞型，從而構(gòu)成了HDAC超家族，這些酶發(fā)揮特異性和交叉功能兩種作用，分布在細胞核與胞漿中。第1個HDAC分離鑒定并命名為HDAC1[224]，其編碼基因在哺乳動物中很保守，共發(fā)現(xiàn)11 個成員，構(gòu)成了HDAC家族[225]。這些蛋白的編碼基因和HDAC1具有高度同源性，并分類為：第I類HDACs，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8；第II類HDACs，包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10。所有第I和II類HDACs都含有一個保守的脫乙?；附Y(jié)構(gòu)域，而且酶催化功能都需要鋅的參與，雖然第II類HDACs的HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9的酶活性尚難證明[226]。第IV類只有一種，即HDACII，在脫乙酰化酶結(jié)構(gòu)域也存在一個與第I和II類同源的保守序列。但是在結(jié)構(gòu)上有區(qū)別，類似于尼克酰胺腺嘌呤核苷二磷酸依賴型的第III類HDACs（即已知的Sirtuins），但是沒有第I和II類HDACs所具有的一般結(jié)構(gòu)[227]。顯然這些依賴于核小體的多種修飾系統(tǒng)構(gòu)成了人類飲食、生活方式，不斷在染色體上寫入、讀取、修改或刪除，并通過表觀遺傳的形式形成記憶和遺傳進化的分子機制。

5 復(fù)雜多樣的GPER和ERs受體傳感系統(tǒng)

5.1 GPER的毒性和有益雙重作用

GPER接受胞外配體的控制，通過其七跨膜結(jié)構(gòu)控制細胞內(nèi)基因組學(xué)和非基因組學(xué)信號途徑，其中非基因組學(xué)途徑主要用來控制離子通道，從而快速控制神經(jīng)、內(nèi)分泌應(yīng)答；基因組學(xué)途徑則通過核受體網(wǎng)絡(luò)，特別是ERα/β將信號傳遞到細胞核內(nèi)控制眾多基因的轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯、加工和轉(zhuǎn)運。Yang Jiali等[228]綜述了由ERs所引發(fā)的生物學(xué)功能。

5.1.1 ERs的多種生理功能

ERα對于生理發(fā)育和正常代謝具有特殊意義。敲除ERα將導(dǎo)致不孕、泌乳激素降低、乳腺不成熟、骨骼減小、胰島素抵抗和肥胖。然而，敲除ERβ則可能導(dǎo)致生育能力下降、卵母細胞減少、不再肥胖，并伴有血清膽固醇、瘦素和血糖濃度增加[229]。在骨骼和代謝方面則無宏觀異常表現(xiàn)[230]。ERβ作為雌激素信號途徑的顯性負調(diào)節(jié)因子，顯示出對ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用的抑制效應(yīng)，因為雌激素正常的信號途徑是通過ERα信號途徑。高水平的ERβ表達在臨床治療中主要是作為一個良好的預(yù)后標志，可見ERβ可以抑制過度的雌激素作用。ERs在免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用，既可調(diào)節(jié)先天免疫，亦可調(diào)節(jié)獲得性免疫[231]。在E2低于生理水平時，ERs，特別是ERα一般都會促進I型干擾素分泌和促炎細胞因子表達。而在E2水平過高時，就會產(chǎn)生抗炎癥應(yīng)答，ERβ信號傳遞可能偏向于負責對促炎細胞因子的衰減作用[232]。ERs的另一個重要作用是神經(jīng)保護。ERβ在人類主要分布于海馬體[233]。在更年期，內(nèi)生合成的E2在海馬體中足以結(jié)合并激活ERα。當E2處于高水平時，ERβ則展示出正調(diào)控活性以改善記憶。ERα/ERβ的比值對于調(diào)節(jié)行為、成熟和衰老非常重要。ERβ表達于中縫背核的羥色胺能神經(jīng)，調(diào)節(jié)色氨酸羥化酶，參與血清素（5-羥色胺）的合成。選擇性ERβ激活劑可以恢復(fù)更年期所造成的色氨酸羥化酶的丟失，減輕抑郁，防止情緒失控[234]。

5.1.2 植物雌激素的有益和有害作用

植物雌激素類化合物正是由于具有相似于雌激素配體的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮對ERs的調(diào)節(jié)作用。植物雌激素類化合物的安全性已存在較長時間的廣泛爭論，大多數(shù)文獻認為植物雌激素有益健康，而且沒有副作用。然而，也有一些有關(guān)植物雌激素有害作用的報道，例如，有研究表明富含植物雌激素的大豆配方會顯著增加患子宮肌瘤的風(fēng)險[235]。在一個對更年期綜合征臨床治療的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，植物雌激素中度提高了胃腸副作用[236]。過高劑量的植物雌激素可能會阻礙乳腺發(fā)育，而低劑量又會產(chǎn)生相反的作用[237]。年齡、健康狀態(tài)、腸道微環(huán)境和劑量是影響植物雌激素正、負作用的主要因素。

早在2007年，Wuttke等[238]就依據(jù)當時的大量數(shù)據(jù)，對植物雌激素，特別是異黃酮類植物化學(xué)物的正、反兩方面功能進行分析和綜述。首先，它們的抗動脈粥樣硬化作用具有很大爭議，因為尚無精確的研究發(fā)現(xiàn)其對體脂有任何有益作用。更重要的是，關(guān)于來自大豆或紅三葉草的異黃酮對乳腺或子宮內(nèi)膜的有益或有害作用也存在爭論。事實上，只有在童年和青春期持續(xù)食用異黃酮類食品的人群才表現(xiàn)出大豆制品的防癌、抗癌和預(yù)防乳腺疾病有益作用，這一點已經(jīng)得到了科學(xué)證實?；蛟S這也是所謂“日本人現(xiàn)象”的真正原因[239]。因為日本婦女患乳腺癌的比例低于西方人，甚至低于西方出生的日本人，主要原因可能是在童年和青春期持續(xù)食用含高異黃酮的豆制品所致。當毫無飲食異黃酮經(jīng)歷的更年期婦女食用異黃酮時，這些植物雌激素顯然具有服用雌激素類似的作用和副作用，如刺激子宮內(nèi)膜和乳腺組織增生，從而對這些器官或組織帶來病變風(fēng)險。因此當對食品的功能性成分，特別是植物雌激素進行功能評價時，應(yīng)該考慮其生活和飲食經(jīng)歷。

蛋白質(zhì)需求在日本主要是由大豆制品來滿足，但是在西方國家大多數(shù)是靠肉、蛋、奶。因此，科學(xué)家在尋找功能性成分時發(fā)現(xiàn)，大豆在中國、日本和東南亞對乳腺具有潛在性保護作用。很快，許多研究推測，異黃酮、染料木黃酮和黃豆苷元作為黃豆等食品中對乳腺具有保護性作用的有效成分，這些植物雌激素可能就是導(dǎo)致“日本人現(xiàn)象”產(chǎn)生的功能性成分[240-241]。這一推測夸大了豆制品和異黃酮類的治療和保健功能，目前并沒有確切的療效和臨床證據(jù)。由于雌激素缺乏存在骨質(zhì)疏松或動脈硬化的風(fēng)險，絕經(jīng)后婦女被推薦增加異黃酮類植物雌激素服用或添加了異黃酮的功能性食品。然而，來自大豆或紅三葉草的異黃酮是否具有治療作用、有無毒副作用、是否與經(jīng)典雌激素同樣具有雙重作用，Wuttke等[238]對此進行了詳盡的整理和總結(jié)分析，剔除了遠高于食用此類產(chǎn)品后血清中所能達到異黃酮濃度進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明有益作用并不明顯。對于一些具有統(tǒng)計意義的報道進行分析，雖然也證明植物雌激素類化合物存在一定的有益作用，但是其誘導(dǎo)乳腺、子宮內(nèi)膜增生，甚至患乳腺癌的風(fēng)險顯著增加。換言之，植物雌激素類化合物發(fā)揮作用并不明顯，即使能夠發(fā)揮作用，也與經(jīng)典的雌激素相似——具有雙重作用。圖6是從結(jié)構(gòu)上對比E2和染料木黃酮的相似性，揭示出兩者具有相似的OH基團、距離和定位，可見二者完全可能與ERs或GPERs的配體結(jié)構(gòu)域進行識別與互作[238]，說明其發(fā)揮生物學(xué)作用的途徑也是通過體內(nèi)雌激素E2的受體信號途徑，同樣具有有益和有害雙重作用。

圖6 E2-17β和染料木黃酮的結(jié)構(gòu)相似性Fig.6 Structural similarity of estradiol-17β and genistein

5.2 ERs的雙向調(diào)節(jié)作用

所謂“雙向作用”或“雙向調(diào)節(jié)作用”存在多種含義和不同解釋。1）不同劑量發(fā)揮完全相反的調(diào)節(jié)作用。例如，Xiong Xingui等[241]研究表明，傳統(tǒng)中藥枳殼厚樸湯具有誘導(dǎo)胃動力的雙向調(diào)節(jié)作用。枳殼和厚樸同時使用可以在某一劑量協(xié)同提高胃動力，低劑量時表現(xiàn)為增加胃動力，高于某一劑量時則轉(zhuǎn)而抑制胃動力。枳殼厚樸湯改善胃動力主要是作用于毒蕈堿受體，其次作用于α受體。Xu Zhixiang等[242]利用MCF-7細胞系研究槲皮苷的細胞增殖、遷移、浸潤、細胞周期、凋亡和氧化應(yīng)激作用，結(jié)果顯示，槲皮苷可以對細胞的行為產(chǎn)生劑量效應(yīng)，依賴于活性氧-調(diào)節(jié)p53信號途徑。槲皮苷在低濃度時促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，而在高濃度時則相反，誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，槲皮苷在低濃度可以顯著抑制抗雌激素三苯氧胺誘導(dǎo)的MCF-7抗增殖作用，而高濃度時則可以協(xié)同促進細胞凋亡。實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)分析結(jié)果表明，槲皮苷在三苯氧胺誘導(dǎo)的抗細胞增殖作用中，通過調(diào)節(jié)涉及細胞轉(zhuǎn)移、細胞周期和凋亡的ER途徑雙向調(diào)節(jié)靶基因的表達。2）在相反的兩個方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。Liu Haixin等[243]綜述了雌激素對激活固有新血管生成的調(diào)節(jié)作用，但是由于其潛在的致癌作用不能用于治療。植物來源的雌激素則可能提供一個替代性選項，但是其對新血管生成效應(yīng)尚缺少深入分析，甚至互相矛盾?；诂F(xiàn)有文獻進行總結(jié)分析得出如下結(jié)論：促血管生成植物雌激素主要功能是對心血管的保護作用，而抗血管生成植物雌激素則主要在癌癥預(yù)防和治療中發(fā)揮作用。這種雙向調(diào)節(jié)作用展示出靶標選擇性和ERs依賴性。可通過血管生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄檢測植物雌激素對ERα和ERβ的反式激活特性。因為當不同的植物雌激素作用于ERα和ERβ時，對血管生成顯示出相反的信號途徑。作用于ERα的植物雌激素激活或抑制一些血管生成相關(guān)基因，使血管生成作用活化升高，而作用于ERβ的植物雌激素調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果則導(dǎo)致血管生成抑制。因此，植物雌激素對ERα和ERβ的選擇性作用或許可以成為調(diào)節(jié)促進或抑制血管生成過程之間平衡的關(guān)鍵。有趣的是，白藜蘆醇顯示出既可以抑制也可以促進血管生成的雙重作用[244]。3）還有一種雙向調(diào)節(jié)的現(xiàn)象：當自身雌激素分泌過低時，可以通過服用適當?shù)闹参锎萍に厣险{(diào)；而自身雌激素分泌過高時，服用同樣的植物雌激素對其下調(diào)。圖7顯示了這種調(diào)節(jié)可能的體內(nèi)作用機制。假設(shè)固有的雌激素E2對受體作用可以獲得百分百的信號輸出，則植物雌激素對這些受體的作用為固有雌激素信號輸出的60%。在自身雌激素分泌過多時，通過服用植物雌激素，如異黃酮，可以和自身雌激素形成競爭ERs的關(guān)系，使得這些接受植物雌激素刺激的受體所輸出的信號減少40%，總輸出小于100%；但是當固有雌激素低于正常生理水平時，植物雌激素又可以補足到60%，整體上表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)的效果。

圖7 植物雌激素對ERs的雙向調(diào)節(jié)作用Fig.7 Bidirectional regulation of phytoestrogens on estrogen receptors

5.3 華夏民族的飲食智慧

中國具有數(shù)千年的農(nóng)耕飲食文化和中醫(yī)藥理論、經(jīng)驗，按照《靈樞·營衛(wèi)生會》中的理論，用現(xiàn)代生命科學(xué)概念進行總結(jié)，植物性食品和中草藥對機體的免疫作用主要表現(xiàn)為：“陰”即上調(diào)免疫”、“陽”即下調(diào)免疫、“熱、溫”即促進機體分解代謝、“平、涼、寒”即降低分解代謝，并根據(jù)經(jīng)驗將其與“辛、甜、酸、咸、苦”五味相對應(yīng)，從而創(chuàng)造了中醫(yī)、藥、食品的生理、免疫、代謝通過“相生-相克”調(diào)節(jié)，達到陰陽和諧、生理和代謝平衡以及營養(yǎng)均衡的理論與規(guī)則[245]。中國的平衡膳食理論認為，長期食用“偏性”食品就會造成機體免疫和生理代謝失衡，從而導(dǎo)致疾?。恢嗅t(yī)藥和保健食品的作用就是以偏糾偏，通過“寒者熱之”或“熱者寒之”，維持飲食平衡。在植物雌激素類化合物和植物化學(xué)物的研究中，存在對受試群體飲食和身體背景復(fù)雜性估計不足的一個關(guān)鍵性問題，因為飲食營養(yǎng)受環(huán)境、氣候、生活條件、生活方式、飲食文化、營養(yǎng)狀態(tài)和遺傳背景等諸多復(fù)雜因素的影響。表觀遺傳學(xué)證據(jù)表明，幾乎所有細胞的生存和營養(yǎng)環(huán)境都可以通過DNA和組蛋白的多種修飾方式將這些營養(yǎng)代謝過程“寫入”染色質(zhì)中，并可以根據(jù)環(huán)境變化，特別是營養(yǎng)狀態(tài)、生理和代謝需求情況不斷地對染色質(zhì)進行“寫入”、“閱讀”或“擦除”。可見，如果按照西方的“邏輯實證主義”哲學(xué)方法研究植物雌激素的健康作用時，所得出的結(jié)果必然會因為其遺傳學(xué)，特別是飲食和生活方式所積累的表觀遺傳修飾的不同而不同，甚至完全相反。正如上述“日本人現(xiàn)象”所示。事實上，日本乃至東南亞，與中國不僅有非常相似的飲食文化、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式，在中醫(yī)藥和飲食與健康哲學(xué)上也有千絲萬縷的聯(lián)系。“陰、陽”和“熱、溫、平、涼、寒”的“平衡與糾偏”思想已經(jīng)深入到每個人的生活習(xí)慣和方方面面。這就是以中醫(yī)、藥和飲食“平衡與糾偏”理論為基礎(chǔ)的飲食智慧，或許這才是個性化營養(yǎng)的必由之路。

6 GPER研究需要進一步解決的關(guān)鍵科學(xué)問題

盡管雌、雄激素受體可以直接通過核受體網(wǎng)絡(luò)將信息傳遞到細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)染色質(zhì)的修飾、轉(zhuǎn)錄以及剪切、翻譯等基因表達調(diào)控的基因組學(xué)途徑，但是其非基因組學(xué)途徑則必需依賴于GPER的離子通道“開/關(guān)”控制機制。另一方面，雖然激素受體廣泛分布于幾乎所有組織、器官和細胞以及細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等膜系統(tǒng)，從而將細胞內(nèi)外的內(nèi)源性激素信號傳感并傳遞到細胞內(nèi)，但是對于外源性激素信號的傳感和傳遞則需要依賴于GPER。近些年來，雖然GPER得到了廣泛和深入的研究，但是仍有一些期待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。

6.1 GPERs的精細結(jié)構(gòu)有待解析

GPERs作為一種GPCRs超家族成員，它和配體的互作動力學(xué)，特別是精細結(jié)構(gòu)尚未解析；結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系尚需深入研究。作為膜蛋白，要得到單晶并進行X射線衍射分析并不容易，冷凍沉淀電鏡技術(shù)的興起不僅為這些膜受體提供了解析其精確結(jié)構(gòu)的新途徑，而且可以通過與配體共沉淀，研究和推測其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。但是和酶與底物所形成復(fù)合物的情形相似，受體和配體互作、識別、變構(gòu)以及向細胞內(nèi)傳遞信號的過程往往發(fā)生在更短暫的瞬間。因為酶和底物結(jié)合需要把底物變成產(chǎn)物，而受體與配體互作只需要瞬間的變構(gòu)并激活胞內(nèi)信號放大作用即可。將這個過程描述為“結(jié)合（binding）”并不恰當，更應(yīng)該精確地描述為“敲擊鍵盤（tapping the keyboard）”：相當于環(huán)境信號通過“敲擊”細胞膜受體“鍵盤”向細胞內(nèi)輸入信號的過程。筆者認為用“敲擊”來取代結(jié)合非常重要，因為這兩種描述至少有兩個本質(zhì)區(qū)別：1）“敲擊”更短暫，而且可以反復(fù)進行多次，而結(jié)合則需要“結(jié)合力”和 “過程”，對酶來說，需要把底物變成產(chǎn)物這一過程；而且底物一旦變成產(chǎn)物就不會再結(jié)合；2）配體通過受體進行跨膜信號傳遞的過程更相似于酶的活性調(diào)節(jié)，而不是酶的催化過程，前者只需要使受體變構(gòu)的作用，而后者則需要結(jié)合-催化使底物變成產(chǎn)物-釋放產(chǎn)物的過程。之所以要區(qū)分這一概念，是因為到目前為止，能夠得到精確解析的受體，特別是能夠?qū)κ荏w-配體互作進行精確解析的幾乎全部局限于配體和受體可以緊密結(jié)合，并可以一起冷凍沉淀的情況。然而，大多數(shù)受體-配體之間的互作并不是通過緊密（或穩(wěn)定）結(jié)合，而是通過一個微小的和瞬間的結(jié)構(gòu)變化，ERs和GPER便是如此。并且，從傳遞信號效率方面判斷，傳遞信號效率（或靈敏度）越高，受體-配體互作的時間越短，同一配體“敲擊”同一受體的次數(shù)也越多。顯然，受體，特別是GPER的這些特性構(gòu)成了解析配體-受體精細結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的最大挑戰(zhàn)。

6.2 GPER與配體之間的互作參數(shù)與動力學(xué)問題

事實上，配體-受體識別和變構(gòu)，并將此變構(gòu)作用聯(lián)動到細胞內(nèi)和G蛋白相偶聯(lián)，通過GTP高能鍵釋放能量驅(qū)動信號級聯(lián)放大是一系列動力學(xué)變構(gòu)過程。所以，要真正深入探明其細胞的分子生物學(xué)機制，單從受體結(jié)構(gòu)，體外操作是不可能實現(xiàn)的，必需在研究過程中引入受體-配體互作、受體胞外結(jié)構(gòu)域與配體互作、胞外結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間聯(lián)動變構(gòu)、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與G蛋白偶聯(lián)以及激活胞內(nèi)信號放大和傳遞的全過程。從傳感器的角度來考慮，這不僅需要通過構(gòu)建受體傳感器來檢測受體-配體互作動力學(xué)，還需要構(gòu)建細胞或組織傳感器來研究胞外結(jié)構(gòu)域與配體互作通過聯(lián)動變構(gòu)激活胞內(nèi)信號的放大與傳遞，并進一步通過基因組學(xué)途徑傳遞到細胞核內(nèi)從而控制基因表達的過程；以及如何激活非基因組學(xué)途徑，控制細胞相應(yīng)的離子通道開關(guān)，在細胞-組織-器官之間傳遞電化學(xué)信號，或通過電信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用?？上駷橹股形匆娪嘘P(guān)GPERs傳感器及其與配體互作動力學(xué)的研究報道。

6.3 GPER用于食品及其化學(xué)成分的功能性評價

在食品及其化學(xué)成分的功能性評價方面一直充滿爭議。爭議的焦點主要集中在：營養(yǎng)是食品的本質(zhì)功能，所以如果從營養(yǎng)的角度評價食品，只需要考察能量、蛋白和各種維生素是否可以滿足不同人群的營養(yǎng)需求。但是當滿足人類不同群體的營養(yǎng)需求，特別是各種營養(yǎng)配方都已推出以后，人類由于營養(yǎng)過剩所造成的疾病并未得到有效控制，反而與日俱增。不得不直面一個不爭的事實是：食品除可以為機體提供營養(yǎng)功能以外，還有其他功能。但問題是：其他功能是什么？如何對食品營養(yǎng)以外的功能進行評價？大部分研究參照醫(yī)、藥領(lǐng)域的實驗動物模型和細胞系進行評價，但是，藥物和食品的最大區(qū)別是藥物是用于治療疾病，而食品則是提供營養(yǎng)以保證機體健康和生存。所有的藥物都有不同程度的毒性，并且到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種動物的生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)、遺傳背景和人類相同，甚至相近。

6.3.1 食品營養(yǎng)學(xué)的出路

隨著植物化學(xué)物和植物雌激素對人體代謝、生理、老化、免疫和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用的不斷揭示，食品不再僅僅被作為營養(yǎng)為人類生存提供支撐，營養(yǎng)配方也不再能夠為現(xiàn)代人的健康提供可以信賴的保障。隨肥胖病、糖尿病和心腦血管疾病的蔓延，不難發(fā)現(xiàn)，同樣的飲食對不同飲食背景、生存環(huán)境、生活方式、遺傳背景的人群產(chǎn)生的后果不同，而且這些差別存在于人類生活的方方面面，隨時可見。所以有科學(xué)家提出了營養(yǎng)基因組學(xué)的概念?；蚪M學(xué)研究表明，雖然不同民族人群幾乎在基因編碼上不存在任何差別，但是人類個體之間卻存在巨大的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。人類個體之間在營養(yǎng)吸收、需求，特別是植物化學(xué)物或植物雌激素調(diào)節(jié)方面的差別可能正是由基因組學(xué)水平上的這些SNP造成的。然而，很多科學(xué)家開展對營養(yǎng)基因組學(xué)的集中研究時，表觀遺傳學(xué)卻很快以大量的研究結(jié)果證明，人類的飲食結(jié)構(gòu)、生活方式，特別是對營養(yǎng)的攝取、吸收、合成與分解代謝，以及解毒、排毒過程可以通過甲基化修飾DNA和組蛋白，甲基化、乙?；⒘姿峄?、琥珀酰化、棕櫚酰化、巴豆酰化修飾核小體組蛋白“寫入”、“閱讀”或“擦除”這些信息，這些對生活方式和飲食習(xí)慣的染色質(zhì)“記錄”，不僅能夠形成長期的記憶和積累，而且在生存競爭和進化中具有重要的選擇優(yōu)勢，構(gòu)成了表觀遺傳的主體。而這種染色質(zhì)修飾和“記錄”系統(tǒng)正是通過GPERs和包括ERs在內(nèi)的核受體網(wǎng)絡(luò)得以實現(xiàn)的。在這個意義上，食品營養(yǎng)及其功能評價的根本出路可能并非營養(yǎng)基因組學(xué)，而是GPERs和核受體所形成的網(wǎng)絡(luò)。

6.3.2 “中華飲食理論”對食品功能評價的貢獻

中國人評價食品功能的方法是在長期飲食經(jīng)驗的基礎(chǔ)上歸納總結(jié)食品和中藥的基本規(guī)律。所有的食品按照其免疫學(xué)和生理、生化作用，將增強免疫（促進免疫應(yīng)答），具有“滋陰”作用的食品確定為“陰”性食品；將下調(diào)免疫（抗炎性），或具有壯陽作用的食品確定為“陽”性食品；在此基礎(chǔ)上，進一步按照食用后對機體代謝所產(chǎn)生的作用分為“熱、溫、平、涼、寒”5 種屬性，促進分解代謝的為“熱”或“溫”，促進合成代謝的為“寒”或“涼”，不影響代謝平衡的為“平”性。但是，由于這5 種屬性難以定量化，而且并不嚴格、分明，所以納入了很容易品嘗的“苦、咸、酸、甜、辛”五味[14]。

6.3.3 “陰、陽”、“熱、溫、平、涼、寒”屬性、“五味”及其受體

中國人所謂飲食中的“陽”主體上對應(yīng)雄激素受體，“陰”則對應(yīng)于ERs。值得注意的是，人類對周圍的物質(zhì)世界主要是通過嗅/味覺受體傳感和認知；食入胃腸道后則進一步通過胃腸黏膜系統(tǒng)的多種受體進行傳感、識別、免疫調(diào)節(jié)與記憶。腸道中的味覺受體，如T1R1（氮營養(yǎng)傳感受體）、T1R2（碳營養(yǎng)傳感受體）、GPR120（游離脂肪酸傳感受體）等，近年來已經(jīng)得到大量研究，其他受體如免疫相關(guān)受體、CD45、細胞因子和趨化因子受體也積累了不少研究[246-247]。特別是ERs，如ERα/β、GPER等均分布于腸黏膜系統(tǒng)，發(fā)揮免疫、代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能[248]，并構(gòu)成腸-腦[249-250]、腸-肝[251]、腸-肺[252]、腸-腎[253]、腸-骨軸[254]等。

6.3.4 GPER與食品功能評價

顯然，食品除為機體提供各種營養(yǎng)外，還具有多種功能。其中最重要的是為滿足機體營養(yǎng)需求所形成的營養(yǎng)攝入、吸收和控制系統(tǒng)的形成和進化。目前的研究結(jié)果表明，該控制系統(tǒng)主要是通過食欲調(diào)節(jié)。饑餓時，食欲增強，食之有味，鼓勵進食；當飲食超過胃腸道消化和吸收能力時，食欲下降，食之無味，停止進食。這是生物攝取營養(yǎng)的基本法則。所以飲食的基本功能是營養(yǎng)攝取及其控制。但是，對于動物源食品，因其主要成分相對簡單，主要為蛋白質(zhì)、核酸、淀粉（肌肉）和脂肪酸類宏營養(yǎng)，其他如維生素、礦物質(zhì)和微量元素只能滿足人體主要營養(yǎng)需求。但是植物源食品因其化學(xué)成分的巨大多樣性，除可以為機體提供基本營養(yǎng)需求外，還可能發(fā)揮多種復(fù)雜的生物功能。這不僅構(gòu)成中醫(yī)藥治病救人的基礎(chǔ)、現(xiàn)代醫(yī)藥靶向化合物的源泉，同時也成為飲食健康、“不治已病治未病”的基礎(chǔ)。然而，面對多達數(shù)萬種植物化學(xué)物，每一種化合物都具有多種功能，多種化合物之間互相疊加、協(xié)同和拮抗作用；此外，劑量效應(yīng)、人類個體之間的種屬、遺傳、環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)和文化上的差異，會進一步增加其多樣性和復(fù)雜性。徹底闡明這些化合物的功能幾乎是不可能的。然而，基于中醫(yī)的傳統(tǒng)理念提供了一種可行的思路：系統(tǒng)評價這些化合物的混合物，也就是“全食品”對人類營養(yǎng)與健康的功能。作為GPCRs受體超家族成員，GPERs通過傳感胞外雌激素或植物雌激素類化合物向胞內(nèi)傳遞兩種類型的信號：1）通過非基因組學(xué)途徑控制各種離子通道開關(guān)，用來快速傳遞神經(jīng)、代謝、生理和內(nèi)分泌信號，控制食欲、進食行為和生理代謝平衡。2）通過ERα/β等核因子互作網(wǎng)絡(luò)向細胞核內(nèi)傳遞信號，通過NCoR和SMRT復(fù)合物“寫入”或“擦除”核小體修飾，啟動或關(guān)閉相關(guān)基因（包括細胞因子、趨化因子和激素）轉(zhuǎn)錄，由這些機體內(nèi)的通訊分子調(diào)節(jié)和控制整個機體的細胞通訊網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)。GPERs和多種核受體已作為藥物篩選靶標，并取得很多研究成果，但是在食品功能評價方面則尚未得到應(yīng)有的重視。這是因為：1）藥物篩選早期并不需要對每種配體進行定量化評價，而定量化方法目前只能通過細胞系及其信號途徑，多數(shù)只能通過基因組學(xué)途徑中分子標記才能實現(xiàn)；2）GPERs雖然在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛了解，但是食品科學(xué)界則并未熟知；3）在技術(shù)層面上，有關(guān)受體傳感器的研究成果尚十分有限，即使有些成功的報道往往缺少后續(xù)研究，或未能實現(xiàn)可以接受的選擇性和可重復(fù)性，難以推廣和應(yīng)用。筆者所在的實驗室近年來在受體傳感器方面進行了較為系統(tǒng)的研究[255-257]，在受體基因合成、表達、分離、純化、納米受體傳感器、細胞和組織傳感器、受體在不同種屬之間的自組裝、受體傳感定量化和動力學(xué)研究等方面取得了系列進展，這些技術(shù)為人類GPERs受體表達、傳感器研制及其對不同雌激素和植物雌激素類化合物的定量化測定與功能評價奠定了基礎(chǔ)。

7 結(jié) 語

越來越多的研究結(jié)果表明，植物化學(xué)物、植物雌激素和中草藥有效成分具有大量交叉和一致性。這些結(jié)果一再證明了植物化學(xué)物不僅是藥物篩選、中藥配伍、中草藥有效化學(xué)成分鑒定及其定性、定量研究的基礎(chǔ)，同時也為食品功能性化學(xué)成分的定性和定量評價奠定了基礎(chǔ)。另一方面，對植物化學(xué)物的功能評價及健康作用研究所得出的結(jié)果差異很大，同一種植物化學(xué)物對不同的調(diào)查群體、不同的劑量等調(diào)查結(jié)果往往充滿變數(shù)，甚至恰恰相反。這些研究結(jié)果的差異性和復(fù)雜性說明，不同植物化學(xué)物的劑量、配伍、食用途徑可能發(fā)揮不同的作用；更重要的是，同一種植物化學(xué)物可能由于食用者的遺傳背景、飲食習(xí)慣、生存環(huán)境、生活狀態(tài)、年齡結(jié)構(gòu)和性別所形成的表觀遺傳基礎(chǔ)不同而不同。顯然，要真正評價這些食品或植物化學(xué)物的功能，揭示其規(guī)律，需要一個可以定量化、標準化的檢測平臺，而GPERs正好可以提供這樣一個平臺，通過人類GPERs受體傳感器的構(gòu)建、自組裝到各種細胞、組織或器官，研究不同植物化學(xué)物或植物雌激素類化合物的動力學(xué)規(guī)律和重要參數(shù)定將在食品功能評價方面發(fā)揮重要作用。