陳樹俊，鄭 婕

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

近年來研究發(fā)現(xiàn)由乳酸菌、開菲爾粒發(fā)酵的果蔬汁表現(xiàn)出優(yōu)良的益生功效，受到市場的青睞。發(fā)酵使果蔬汁由富含維生素和礦物質(zhì)元素的一般飲品，成為具有改善乳糖不耐癥、提高機(jī)體免疫力、降低血脂和保護(hù)肝臟等食療作用的功能性飲品[1]。發(fā)酵可有效改善產(chǎn)品的風(fēng)味、提高營養(yǎng)價(jià)值，但需要注意的是，人體胃腸消化液可能會降解或轉(zhuǎn)化部分功能成分，對其化學(xué)結(jié)構(gòu)、功能活性造成影響，降低實(shí)際效力[2]。目前，關(guān)于食物中多酚類物質(zhì)及抗氧化活性的研究多是基于有機(jī)溶劑提取等化學(xué)法，而這與人體胃腸道消化過程有很大區(qū)別，無法真實(shí)反映多酚類物質(zhì)在體內(nèi)生理環(huán)境下的存在形式和抗氧化能力。采用體外模擬消化方法能規(guī)避上述研究缺陷，通過模擬人體的胃腸道消化來研究食物中活性成分在人體的消化情況，可以準(zhǔn)確、快捷地對食品的營養(yǎng)和保健價(jià)值進(jìn)行評估[3]。由此可見，研究果蔬汁胃腸消化特性對準(zhǔn)確評估其益生潛力具有重要意義。

復(fù)合果蔬汁風(fēng)味主要受有機(jī)酸、糖類、氨基酸等成分影響，其中，有機(jī)酸是影響其風(fēng)味的重要指標(biāo)，例如，乳酸、檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸的酸味柔和且濃郁，可以增強(qiáng)產(chǎn)品醇厚感，促進(jìn)芳香酯形成。果蔬發(fā)酵汁制備工藝簡便、易于控制、發(fā)酵周期短，不同原料和發(fā)酵菌株所生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品有機(jī)酸組成差別較大，準(zhǔn)確測定復(fù)合果蔬發(fā)酵汁中有機(jī)酸種類和含量對解析發(fā)酵機(jī)理、把控產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)在體外模擬胃腸消化基礎(chǔ)上分別探索乳酸菌發(fā)酵果蔬汁、開菲爾粒發(fā)酵果蔬汁發(fā)酵前后酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性變化規(guī)律，較有機(jī)溶劑化學(xué)測定法更加接近人體實(shí)際對其消化吸收情況，同時研究果蔬汁在不同發(fā)酵時間段的有機(jī)酸含量變化，分析發(fā)酵過程中有機(jī)酸演變規(guī)律，旨在為開菲爾粒相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品的益生功能、品質(zhì)研究提供參考，并為豐富或替代部分乳酸菌發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹、沙棘、葡萄、胡蘿卜原漿 天津悅梵泰有限公司；開菲爾粒 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；植物乳桿菌、干酪乳桿菌 中國菌種保藏中心；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250）、?；悄懰徕c、2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS）、磷酸二氫鉀、磷酸北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、甲醇（均為色譜純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；SHZ-2水浴恒溫振蕩器 江蘇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；PHS-3C數(shù)顯實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 蘇州華美辰儀器有限公司；SW-CJ-1FD凈化工作臺 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳儀器有限公司；BKQ-B50高壓蒸汽立式滅菌鍋 山東博科科學(xué)儀器有限公司；1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；水相微孔濾膜（0.22 μm） 上海楚定分析儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 青島聚創(chuàng)世紀(jì)環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 果蔬發(fā)酵汁制備

以感官評分和多酚含量為評價(jià)指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定復(fù)合果蔬汁制備工藝為：桑椹汁添加量為15%（以體系總體積計(jì)，下同）、葡萄汁添加量為25%、胡蘿卜汁添加量20%、沙棘汁添加量為11%，其余為純凈水。

以復(fù)合果蔬汁為原料，90 ℃水浴滅菌20 min后接入乳酸菌混菌（植物乳桿菌數(shù)與干酪乳桿菌數(shù)比為2∶1），以酸度和活菌數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定乳酸菌發(fā)酵果蔬汁最優(yōu)工藝參數(shù)：接種量3.5%（以體系總體積計(jì)，下同）、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間34.6 h。

以復(fù)合果蔬汁為原料，90 ℃水浴滅菌20 min后接入開菲爾粒（乳酸菌數(shù)與酵母菌數(shù)比為9∶1），以酸度和活菌數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定開菲爾粒發(fā)酵果蔬汁最優(yōu)工藝參數(shù)：接種量7.3%、發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時間41.7 h。

1.3.2 體外模擬胃腸消化模型

體外模擬消化過程參考Hou Fangli等[4]的方法并稍作改動。

模擬胃消化：移取1 mL復(fù)合果蔬汁于裝有4 mL無菌水的離心管中，加入0.5 mL 1 mol/L HCl溶液（此時混合液pH值為2），再加入160 mg胃蛋白酶（1∶3 000），將果蔬汁置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中厭氧避光培養(yǎng)，消化過程每隔30 min取樣待測。

模擬腸消化：以胃消化2 h的樣品作為腸消化初始時間0 h樣品，向果蔬汁中加適量1 mol/L NaHCO3溶液至pH 7.5，隨后加入18 mL混合液（2 mg/mL胰蛋白酶液與12 mg/mL膽酸鹽體積比為12∶6），37 ℃振蕩避光培養(yǎng)（厭氧條件）。消化過程每隔30 min取樣待測。

1.3.3 功能成分測定

參照Berker等[5]的方法，采用Folin-Ciocalteu法測定總酚質(zhì)量濃度；采用NaNO2-Al(NO3)3分光光度法測定樣品中黃酮的質(zhì)量濃度[6]。

1.3.4 抗氧化效果的測定

DPPH自由基清除率測定參考文獻(xiàn)[7]；ABTS陽離子自由基清除率測定參考文獻(xiàn)[8-9]并稍加改進(jìn)：向2.4 mmol/L過硫酸鉀溶液中加入等體積6 mmol/L的ABTS溶液混勻，暗處儲存15 h后，用無水乙醇稀釋至其在734 nm波長處吸光度為0.70左右。依次取果蔬汁消化液1 mL置于具塞試管中，加入5 mL ABTS溶液，室溫避光反應(yīng)7 min后在734 nm波長處測其吸光度并記為A樣品；以1 mL蒸餾水代替消化液測其吸光度并記為A空白，以上測定時均以蒸餾水調(diào)零。每組樣品平行3 次，按下式計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率；羥自由基（·OH）清除率測定參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.5 有機(jī)酸質(zhì)量濃度的測定

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中，每隔5 h取5 mL果蔬汁以3 000 r/min離心15 min。移取上清液稀釋5 倍體積后過0.22 μm水相濾膜，過濾液進(jìn)行高效液相色譜分析。

色譜柱：Sepax HP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L KH2PO4（體積比3∶97，用磷酸調(diào)至pH 2.5）；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測器波長：210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)平行3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)采用SPSS軟件Duncan多重復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 7.5軟件對圖表進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃腸消化對發(fā)酵果蔬汁抗氧化成分的影響

2.1.1 消化過程中發(fā)酵果蔬汁多酚質(zhì)量濃度的變化

圖1 體外消化過程中發(fā)酵果蔬汁多酚質(zhì)量濃度的變化Fig.1 Changes in polyphenol content of mixed fruit and vegetable juices during in vitro digestion

結(jié)合圖1A、B可以看出，在胃腸消化階段，3 個實(shí)驗(yàn)組多酚質(zhì)量濃度均呈顯著上升趨勢（P＜0.05），可能是因?yàn)樵谀M消化過程中，胃酸和胃蛋白酶會削弱部分酚酸與細(xì)胞壁之間的酯鍵從而釋放酚酸，胰蛋白酶和膽汁也可以作用于多酚與蛋白質(zhì)之間的共價(jià)鍵，使其脫離出更多的自由酚，從而使果蔬汁多酚質(zhì)量濃度在經(jīng)過胃消化后顯著升高，在腸消化過程中進(jìn)一步升高，這與Bouayed等[11]對蘋果進(jìn)行體外模擬消化研究所得結(jié)果相似。同時，開菲爾粒發(fā)酵組多酚質(zhì)量濃度明顯著高于乳酸菌發(fā)酵組、未發(fā)酵組（P＜0.05），且在胃腸消化結(jié)束時（腸消化2.5 h），開菲爾粒發(fā)酵組多酚質(zhì)量濃度比乳酸菌發(fā)酵組高1.07 mg/mL，比未發(fā)酵組高3.16 mg/mL（P＜0.05）。原因可能是由于開菲爾菌為復(fù)雜微生物共生體，相較于植物乳桿菌和干酪乳桿菌能產(chǎn)生更為豐富的酶系，繼而切斷結(jié)合態(tài)多酚纖維素、半纖維素之間的共價(jià)鍵，如植物細(xì)胞壁多糖共價(jià)鍵、木質(zhì)素酯鍵等，從而釋放出更多的可溶性多酚，同時發(fā)酵后形成的酸性環(huán)境亦能減少多酚的破壞降解，導(dǎo)致多酚質(zhì)量濃度顯著高于乳酸菌發(fā)酵組和未發(fā)酵組。

2.1.2 消化過程中發(fā)酵果蔬汁黃酮質(zhì)量濃度的變化

圖2 體外消化過程中發(fā)酵果蔬汁黃酮質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes in flavonoid content of mixed fruit and vegetable juices during in vitro digestion

從圖2A中可以看出，3 組果蔬汁黃酮質(zhì)量濃度在胃消化過程中顯著升高（P＜0.05），此消化階段結(jié)束時（胃消化2.5 h），開菲爾粒發(fā)酵組黃酮質(zhì)量濃度較乳酸菌發(fā)酵組和未發(fā)酵組分別提高了37.33%、66.13%（P＜0.05）。表明在胃消化過程中，開菲爾粒發(fā)酵組的黃酮釋放速率明顯優(yōu)于乳酸菌發(fā)酵組，可能是由于其菌體的代謝產(chǎn)物會轉(zhuǎn)化部分碳源物質(zhì)，生成能發(fā)生顯色反應(yīng)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)。Suo Huayi等[12]的研究也已證明發(fā)酵微生物會引起發(fā)酵基質(zhì)中植物細(xì)胞的破裂，引起不同抗氧化物質(zhì)的釋放與合成。同時胃液較低的pH值環(huán)境可以有效避免黃酮類化合物的降解，胃蛋白酶、胃酸均能促進(jìn)結(jié)合態(tài)黃酮的釋放，導(dǎo)致隨著胃消化時間的延長黃酮質(zhì)量濃度持續(xù)升高；在腸消化階段黃酮質(zhì)量濃度均有所下降（圖2B），可能是因?yàn)閺乃嵝缘奈敢涵h(huán)境過渡到中性或弱堿性的腸液環(huán)境時，黃酮容易降解為酚醛或其他化合物。腸消化結(jié)束時，開菲爾粒發(fā)酵組黃酮質(zhì)量濃度高于其他兩組，比乳酸菌發(fā)酵組高0.016 mg/mL，比未發(fā)酵組高0.022 mg/mL。

2.2 胃消化階段發(fā)酵果蔬汁抗氧化活性分析結(jié)果

胃消化過程中果蔬汁抗氧化活性變化如圖3所示，DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率隨消化時間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。開菲爾粒發(fā)酵組、乳酸菌發(fā)酵組、未發(fā)酵組發(fā)酵結(jié)束時DPPH自由基清除率分別為84.6%、78.7%、69.3%，較消化前（胃消化0 h）分別提高了13.3%、11.7%、8.9%（P＜0.05）；開菲爾粒發(fā)酵組、乳酸菌發(fā)酵組發(fā)酵結(jié)束時ABTS陽離子自由基清除率較未發(fā)酵組分別提高了12.5%、6.4%，較消化前分別提高了8.5%、5.5%（P＜0.05）；由圖3C可知，·OH清除率先上升后略有下降，在胃消化1.5 h時抗氧化能力最強(qiáng)，Tagliazucchi等[13]的研究也表明，葡萄樣品經(jīng)模擬胃液消化后抗氧化活性有所提高。綜合圖3A～C可看出，在胃消化階段，自由基清除率強(qiáng)弱順序?yàn)殚_菲爾粒發(fā)酵組＞乳酸菌發(fā)酵組＞未發(fā)酵組，消化組＞未消化組，說明微生物發(fā)酵和胃消化過程均可以提高復(fù)合果蔬汁的自由基清除能力，且開菲爾粒提高效果優(yōu)于乳酸菌混菌。

圖3 胃消化對發(fā)酵果蔬汁自由基清除率的影響Fig.3 Effect of gastric digestion on free radical scavenging capacity of mixed fruit and vegetable juices

2.3 腸消化階段發(fā)酵果蔬汁抗氧化活性分析結(jié)果

將果蔬汁經(jīng)過胃液處理后再經(jīng)腸液處理，分析其對自由基清除率的影響。由圖4A、B可知，隨著腸消化時間的延長，DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率先上升后趨于平緩，腸消化結(jié)束時，開菲爾粒發(fā)酵組DPPH自由基清除率、ABTS陽離子清除率分別比乳酸菌發(fā)酵組高10.1%、13.3%，分別比未發(fā)酵組高12.8%、14.7%，較消化前（腸消化0 h）分別提高了11.5%、7.6%（P＜0.05），說明經(jīng)開菲爾粒發(fā)酵后果蔬汁具有更高的抗氧化活性，且在腸消化過程中進(jìn)一步增強(qiáng)。由圖4C可知，各組·OH清除率均呈下降趨勢，未發(fā)酵組清除率下降顯著，由未消化時的61.6%下降至56.3%（2.5 h），腸消化結(jié)束時，兩個發(fā)酵組清除率均顯著高于未發(fā)酵組（P＜0.05），雖然·OH清除率整體均呈下降趨勢，但開菲爾粒發(fā)酵組依舊保持著較高的抗氧化能力，腸消化結(jié)束時（2.5 h）比乳酸菌發(fā)酵組高6.5%，比未發(fā)酵組高16.7%。

圖4 腸消化對發(fā)酵果蔬汁自由基清除率的影響Fig.4 Effect of intestinal digestion on free radical scavenging capacity of mixed fruit and vegetable juices

2.4 消化過程中發(fā)酵果蔬汁活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析結(jié)果

表1 胃消化過程中發(fā)酵果蔬汁活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between bioactive ingredients and antioxidant capacity of mixed fruit and vegetable juices during gastric digestion

由表1可知，在模擬胃消化過程中，開菲爾粒發(fā)酵組、乳酸菌發(fā)酵組多酚和黃酮質(zhì)量濃度與DPPH自由基、·OH清除率呈顯著正相關(guān)性，表明在胃消化階段，發(fā)酵果蔬汁中多酚、黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基、·OH清除起主導(dǎo)作用；而ABTS陽離子自由基清除率與開菲爾粒發(fā)酵組和乳酸菌發(fā)酵組多酚質(zhì)量濃度（r＝0.755、r＝0.541）、黃酮質(zhì)量濃度（r＝0.682、r＝0.483）相關(guān)性不顯著，推測其對ABTS陽離子自由基的清除是由多酚、黃酮與發(fā)酵菌株共同作用的結(jié)果[14]，可能是發(fā)酵菌株細(xì)胞產(chǎn)生的多糖和蛋白（如酵母細(xì)胞壁內(nèi)的葡聚糖等[15]）具有很強(qiáng)的抗氧化作用；同時菌株細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還含有很多內(nèi)生的抗氧化劑，均可以促進(jìn)ABTS陽離子自由基清除率提高。

表2 腸消化過程中活性成分與抗氧化能力相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between bioactive ingredients and antioxidant capacity during intestinal digestion

由表2可知，在模擬腸消化過程中，兩組發(fā)酵果蔬汁DPPH自由基清除率與多酚質(zhì)量濃度均呈顯著正相關(guān)（r＝0.897、r＝0.928），而ABTS陽離子自由基、·OH清除率與兩發(fā)酵組多酚、黃酮質(zhì)量濃度相關(guān)性不顯著，說明ABTS陽離子自由基、·OH清除能力是發(fā)酵果蔬汁體系中所有抗氧化物質(zhì)共同作用的結(jié)果，其中，發(fā)酵菌種具有重要作用。已有研究證明益生菌被人體攝入后會在腸道停留一定時間，通過代謝向細(xì)胞壁外分泌胞外多糖、生物活性肽等代謝產(chǎn)物[16-17]，這些產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可抑制自由基連鎖反應(yīng)的發(fā)生。在腸消化過程中，胰酶和膽汁的協(xié)同效應(yīng)也可水解某些物質(zhì)生成抗氧化劑[18-19]，提高發(fā)酵液的抗氧化能力。

2.5 果蔬汁發(fā)酵過程中有機(jī)酸動態(tài)變化

2.5.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和線性關(guān)系

圖5 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.5 HPLC profile of mixed organic acid standards

由圖5可知，7 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離效果較好，且分離時間較短，保留時間在2～8 min，各有機(jī)酸對應(yīng)的保留時間分別為草酸3.029 min、酒石酸3.184 min、蘋果酸3.747 min、乳酸4.470 min、乙酸4.716 min、檸檬酸5.751 min、琥珀酸6.801 min。

表3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析Table 3 Calibration curves for organic acid standards

由表3可知，定量檢測波長下，決定系數(shù)均大于0.997 5，說明各有機(jī)酸質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系，采用峰面積定量法對各有機(jī)酸進(jìn)行定量分析可行。7 種有機(jī)酸的檢出限在0.18～4.89 mg/mL之間，定量限在0.63～19.17 mg/mL之間，能滿足檢測要求。

2.5.2 發(fā)酵果蔬汁蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸質(zhì)量濃度動態(tài)變化

表4 果蔬汁發(fā)酵過程中蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸質(zhì)量濃度動態(tài)變化Table 4 Dynamic changes of malic acid, succinic acid, citric acid and oxalic acid of mixed fruit and vegetable juices during fermentation

復(fù)合果蔬汁有機(jī)酸含量豐富，在發(fā)酵過程中呈動態(tài)變化趨勢，準(zhǔn)確測定有機(jī)酸的種類和含量對評估果蔬汁發(fā)酵品質(zhì)、功能特性具有重要意義。由表4可知，與發(fā)酵前相比，果蔬汁經(jīng)乳酸菌、開菲爾粒發(fā)酵后，蘋果酸、琥珀酸和草酸質(zhì)量濃度均呈極顯著下降趨勢（P＜0.01），檸檬酸質(zhì)量濃度變化不顯著（P＞0.05）。在發(fā)酵過程中，果蔬汁進(jìn)行三羧酸循環(huán)，作為循環(huán)中間體的蘋果酸參與多種生化反應(yīng)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蘋果酸（（3 818.90±22.26）mg/L）被分解為乳酸等物質(zhì)而導(dǎo)致質(zhì)量濃度分別下降至（1 254.77±14.10）mg/L（乳酸菌發(fā)酵組）、（1 436.12±10.9）mg/L（開菲爾粒發(fā)酵組）。Tsuji等[20]研究表明琥珀酸、檸檬酸及草酸是碳代謝的中間產(chǎn)物。琥珀酸在碳代謝途徑中，可通過部分丙酮酸氧化為氫離子和醋酸，也可產(chǎn)生少量乳酸，其中間代謝物也能為合成雙乙酰、乙偶姻等物質(zhì)提供前體分子[21-22]，這可以解釋發(fā)酵結(jié)束時琥珀酸質(zhì)量濃度僅為（74.48±4.54）mg/L（乳酸菌發(fā)酵組）、（98.03±15.73）mg/L（開菲爾粒發(fā)酵組）。草酸在果蔬汁中初始質(zhì)量濃度較低，僅為（87.62±2.34）mg/L，在微生物代謝發(fā)酵過程中發(fā)生合成或分解，生成其他物質(zhì)，發(fā)酵結(jié)束時其質(zhì)量濃度僅為（39.64±3.55）mg/L（乳酸菌發(fā)酵組）、（42.88±1.56）mg/L（開菲爾粒發(fā)酵組），較發(fā)酵前明顯降低。檸檬酸在發(fā)酵階段質(zhì)量濃度處于動態(tài)變化中，發(fā)酵至20 h左右達(dá)最大值，之后又逐漸下降，可能是乳酸菌將部分檸檬酸分解成醋酸和丙酮酸，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時檸檬酸質(zhì)量濃度較發(fā)酵前無顯著差異，與鄭欣[23]、Mousavi[24]等分別應(yīng)用乳酸混合菌發(fā)酵荔枝汁、石榴汁后發(fā)現(xiàn)檸檬酸質(zhì)量濃度無顯著變化的結(jié)論相一致。

2.5.3 發(fā)酵果蔬汁乳酸、酒石酸、乙酸質(zhì)量濃度動態(tài)變化

表5 果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸、酒石酸、乙酸質(zhì)量濃度動態(tài)變化Table 5 Dynamic changes of lactic acid, tartaric acid and acetic acid of mixed fruit and vegetable juices during fermentation

由表5可知，與發(fā)酵前相比，果蔬汁經(jīng)過乳酸菌混菌、開菲爾粒發(fā)酵后，乳酸、酒石酸和乙酸質(zhì)量濃度極顯著上升（P＜0.01）。原因可能是除了益生菌發(fā)酵使部分蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸外，果蔬汁中葡萄糖也能在乳酸脫氫酶作用下，通過糖代謝途徑還原為乳酸，導(dǎo)致乳酸質(zhì)量濃度持續(xù)增加，由初始的（1 361.27±25.40）mg/L分別提高到（5 629.87±37.06）mg/L（乳酸菌發(fā)酵組）、（5 078.39±16.93）mg/L（開菲爾粒發(fā)酵組），這與de Souza Neves Ellendersen等[25]研究蘋果漿發(fā)酵期間乳酸質(zhì)量濃度的動態(tài)規(guī)律相一致。發(fā)酵結(jié)束時，乳酸菌發(fā)酵組乳酸質(zhì)量濃度高于開菲爾粒發(fā)酵組，原因可能與兩種發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量及代謝產(chǎn)物酶有關(guān)。酒石酸在果蔬汁中的初始質(zhì)量濃度為（565.89±10.17）mg/L，隨著發(fā)酵時間的延長，果蔬汁pH值降低，酒石酸鹽溶解性增大，使酒石酸含量增加[26-27]，發(fā)酵至45 h時，兩組果蔬汁酒石酸質(zhì)量濃度分別為（1 611.28±12.95）mg/L（乳酸菌發(fā)酵組）、（1 329.34±19.07）mg/L（開菲爾粒發(fā)酵組），較發(fā)酵前極顯著升高（P＜0.01）。果蔬原汁中乙酸質(zhì)量濃度較低，初始質(zhì)量濃度為（50.52±0.64）mg/L，發(fā)酵后乙酸為果蔬汁中揮發(fā)性有機(jī)酸的主體成分，會使產(chǎn)品帶有愉悅的醋香味[28]，Driehuis等[29]發(fā)現(xiàn)乳酸菌在厭氧條件下具有降解乳酸并將其轉(zhuǎn)化為乙酸的能力。發(fā)酵結(jié)束時，開菲爾粒發(fā)酵組乙酸質(zhì)量濃度明顯高于乳酸菌發(fā)酵組，原因可能是除開菲爾粒中的乳酸菌能代謝丙酮酸產(chǎn)生乙酸外[30]，其含有的少量醋酸菌也參與代謝產(chǎn)酸[31]，綜合作用使得乙酸質(zhì)量濃度明顯增加。

3 討 論

模擬人體消化技術(shù)日漸成熟并得到廣泛應(yīng)用，已成為研究食物在人體胃腸道消化變化的重要途徑。Hu Yidong等[32]研究了消化過程對發(fā)酵芒果汁黃酮、多酚含量及抗氧化活性的影響，結(jié)果表明，與未發(fā)酵組相比，發(fā)酵芒果汁經(jīng)胃腸消化后抗氧化組分含量顯著升高，其中發(fā)酵菌株具有重要作用。在本研究中，以不同發(fā)酵組果蔬汁的多酚、黃酮質(zhì)量濃度以及DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率為指標(biāo)，進(jìn)行模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明消化過程有利于抗氧化成分及自由基清除率的升高且開菲爾粒發(fā)酵樣品益生效果顯著優(yōu)于乳酸菌混菌，相關(guān)性分析結(jié)果表明發(fā)酵菌株是影響發(fā)酵果蔬汁抗氧化能力的重要因素，與上述研究結(jié)果相似。

在對果蔬汁有機(jī)酸研究方面，Herrero等[33]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵蘋果汁時，蘋果酸在發(fā)酵過程中被完全代謝，且蘋果酸完全分解后乳酸含量也開始降低，而醋酸大量產(chǎn)生。本研究中，蘋果酸經(jīng)發(fā)酵后含量顯著下降，乳酸、酒石酸和乙酸含量顯著升高，與上述結(jié)果一致。發(fā)酵過程中果蔬汁進(jìn)行蘋果酸-乳酸菌發(fā)酵，不僅能夠產(chǎn)生諸多風(fēng)味物質(zhì)，而且對發(fā)酵產(chǎn)品抗氧化等功能性作用具有重要影響，發(fā)酵產(chǎn)品能調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)，提高營養(yǎng)元素的吸收利用率，增強(qiáng)人體免疫力[34]。

與乳酸菌發(fā)酵所得果蔬汁相比，開菲爾粒發(fā)酵果蔬汁具有更好的益生功能。這歸功于開菲爾粒的組成菌種類多樣，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種生物活性肽[35]，這些活性肽對維持腸道菌群平衡、保護(hù)人體健康具有重要作用。目前，市場上發(fā)酵果蔬汁飲料所采用的發(fā)酵菌種多局限為乳酸菌，導(dǎo)致發(fā)酵果蔬汁類型較為單一，嚴(yán)重影響我國果蔬飲料的出口與內(nèi)銷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明開菲爾粒可豐富或替代部分乳酸菌發(fā)酵劑，開發(fā)功能性果蔬和天然抗氧化產(chǎn)品。但有關(guān)發(fā)酵果蔬汁產(chǎn)品的多酚和黃酮組分結(jié)構(gòu)、益生菌數(shù)量在消化過程中的變化趨勢以及主導(dǎo)有機(jī)酸變化的核心菌群均有待于在今后的工作中進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過模擬胃腸消化，分別對乳酸菌發(fā)酵組、開菲爾粒發(fā)酵組果蔬汁發(fā)酵前后多酚、黃酮質(zhì)量濃度和抗氧化活性進(jìn)行動態(tài)評價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在消化環(huán)境中，與未發(fā)酵樣品相比，發(fā)酵果蔬汁多酚、黃酮質(zhì)量濃度顯著升高，對DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基清除能力較消化前進(jìn)一步提高，且在模擬胃消化過程中升高最顯著。腸消化結(jié)束時，開菲爾粒發(fā)酵組DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率分別比乳酸菌發(fā)酵組高10.1%、13.3%、6.5%，比未發(fā)酵組高12.8%、14.7%、16.7%；多酚、黃酮質(zhì)量濃度分別比乳酸菌發(fā)酵組高1.07、0.016 mg/mL，分別比未發(fā)酵組高3.16、0.022 mg/mL，說明開菲爾粒發(fā)酵果蔬汁益生效果顯著優(yōu)于乳酸菌混菌，更加適應(yīng)人體消化環(huán)境，可為豐富或替代部分乳酸菌發(fā)酵劑提供參考。采用高效液相色譜法分別對乳酸菌發(fā)酵組、開菲爾粒發(fā)酵組果蔬汁中7 種有機(jī)酸進(jìn)行動態(tài)分析，結(jié)果表明：兩組果蔬汁在整個發(fā)酵過程中有機(jī)酸變化規(guī)律較為一致：蘋果酸、琥珀酸和草酸經(jīng)發(fā)酵后質(zhì)量濃度極顯著下降，乳酸、酒石酸和乙酸質(zhì)量濃度顯著極升高，檸檬酸質(zhì)量濃度變化不顯著。