吳 軍關 濤田 峰劉學起馬 劍王慶峰趙芬芬

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科,銀川 750021)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是由外力導致的中樞神經系統(tǒng)疾病,會導致運動功能障礙與慢性疼痛綜合征等[1-2]。 近年來WHO 數(shù)據表明脊髓損傷呈現(xiàn)高發(fā)趨勢,全世界每年大約有25000 ～50000 名脊髓損傷患者[3]。 依據脊髓損傷的發(fā)病原因、病理變化過程和特征等特點,可將其分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷。 研究認為,脊髓損傷誘發(fā)的神經功能缺損不僅是由于初始的實質性損傷,而是損傷后的一系列級聯(lián)分子反應,導致神經元受損。 繼發(fā)性脊髓損傷是一種機體在細胞和分子水平的主動調控過程,包括一系列的病理性生理變化,如脊髓組織發(fā)生的自噬、炎癥、氧化損傷、凋亡、壞死和水腫等,都會嚴重影響神經功能、膠質細胞活化與白質恢復等。 多種因素的聯(lián)合作用進而誘發(fā)永久的病理生理性改變,最終導致肢體運動功能和感覺能力喪失等[4-7]。

TRL4/NF-κB 信號通路廣泛參與調控機體多種生理和病理變化過程,與機體免疫調節(jié)和炎癥反應具有密切關系。 當機體脊髓組織受到損傷后誘發(fā)機體炎癥反應,誘導TRL4 激活NF-κB 信號通路,介導下游炎癥因子的釋放和表達。 瑞香素(daphnetin,DAP)是從瑞香科類中草藥中提取的香豆素類活性成分。 既往研究表明,瑞香素具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經保護等多種藥理活性,能夠通過抑制機體炎癥和氧化應激損傷進而改善機體損傷[8-9]。 因此,本研究采用脊髓損傷大鼠模型,以探究瑞香素對脊髓損傷模型大鼠的氧化應激損傷、炎癥水平及TRL4/NF-κB 信號通路的調節(jié)作用,并探究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選擇75 只SPF 級雄性Wistar 大鼠,8 周齡,均購買自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK(寧)2016-0003],動物飼養(yǎng)于寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院動物實驗室[SYXK(寧)2016-0012],體重為(180±20)g,均飼養(yǎng)恒溫(25℃)、恒濕(50±5)%條件下,并保持飼養(yǎng)間長期保持通風、干燥和安靜的環(huán)境,以12 h 的晝夜循環(huán)。 本研究經寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(IACUCNY2018AC04)。 本實驗的所有動物實驗操作均遵循3R 原則,以最大程度保證實驗福利。

1.2 主要試劑與儀器

瑞香素購買自上海吉至生化科技有限公司(純度≥97%,批號:SIG-D5564,上海,中國)；SOD(批號:A001-3-2)、CAT(批號:A007-1-1)、GSH-Px(批號:A005-1-2)、MDA(批號:A003-1-2)均購買自南京建成生物工程研究所(南京,中國)；TNF-α(批號:TNA-H82E3)、IL-1β(批號:IL2-H4256)、IL-6 ( 批 號: CD6-H82E8)、 IL-10 ( 批 號: TRLH5259)均購買自ACRO Biosystems 公司(美國)；Bax(批號:5023S)、Bcl-2(批號:3498S)、Caspase-3(批號:14220S)、Cyt-c(批號:11940S)、BDNF(批號:47808S)、TrkB(批號:4603S)和p-TrkB(批號:4619S)一抗、熒光二抗(批號:5366)均購買自Cell Signaling Technology(US)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(批號:A045-4-2)購買自南京建成生物工程研究所(南京,中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥及分組和實驗大鼠模型的制備

各組實驗用大鼠均需在適應一周后開始進行以下試驗。 脊髓損傷模型的建立:采用電磁力驅動沖擊器(10 g,12.5 mm)進行T10 挫傷性脊髓損傷；而空白組則只接受椎板切除術。 術后各實驗鼠在加熱墊燈下維持體溫在36℃～37℃,直至其完全蘇醒[1-2,5]。 術后給予大鼠相應劑量的鎮(zhèn)痛(50 mg/kg Temgesic,皮下)和生理鹽水(0.5 mL,皮下)以防止疼痛和脫水,然后在飲用水中加入抗生素使其接受抗生素1 周。 創(chuàng)傷后6 h 進行BBB 運動功能評分和CBS 評分測試,并將75 只大鼠隨機均分為5 組(n=15):空白組(Sham),模型組(Model),瑞香素低劑量組(30 mg/kg)、中劑量組(60 mg/kg)和高劑量組(90 mg/kg)；術后第4 天開始連續(xù)給予瑞香素,連續(xù)給藥4 周。

1.3.2 運動功能評價

采用BBB 評分法和CBS 評分法以評價各組試驗大鼠的脊髓功能的恢復情況。 在造模前1 d、造模后第1、8、15、22 和30 天對各組實驗大鼠分別進行BBB 評分和CBS 評分,以評價各組實驗大鼠后肢的運動功能狀況。 在BBB 評分中分為0～21 分:其中,0 分表示后肢完全無運動能力,21 分為后肢能力完全正常；若BBB 評分在5 分以下則表示脊髓損傷大鼠造模成功。 在CBS 評分中分為0 ～100 分:其中,正常為0 分,全癱為100 分。

1.3.3 各組實驗大鼠脊髓組織中氧化應激相關酶與細胞因子的測定

大鼠分組和處理同上。 各組大鼠連續(xù)給藥4 周后,經腹腔注射戊巴比妥鈉(40～60 mg/kg)麻醉后,處死,快速抽取脊髓組織樣本,然后采用冷生理鹽水進行沖洗,以后續(xù)實驗。 在脊髓組織中加入適量的PNS 緩沖液,采用液氮進行研磨、勻漿,在4℃、3500 r/min 條件下離心15 min 后取上清。 所有實驗操作均嚴格按照相應試劑盒說明書進行,檢測SOD、CAT、GSH-Px 酶活性及MDA 含量,以及細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 的表達量。

1.3.4 Western blot 檢測炎癥相關蛋白的表達量

大鼠分組和處理同上。 將實驗大鼠麻醉、處死后迅速抽取各組實驗大鼠的脊髓組織樣本,采用液氮猝滅并在液氮條件下進行研磨成粉末狀,再加入適量的RIPA 裂解液使得蛋白組織充分裂解后,在冰浴條件下放置1h,并且在此期間對樣本溶液進行適當?shù)恼鹗帯u勻；然后在4℃條件下,以12000 r/min 離心15 min 后取上清。 然后使用BCA 試劑盒法測定其上清液中的總蛋白濃度。 在10% SDS-PAGE 上分離提取的蛋白,并轉移到PVDF 膜上,37℃條件下封閉1h。然后加入相應的一抗在4℃條件下孵育過夜,后將其在TBST 中洗滌3 次。 然后加入二抗,在37℃條件下孵育1h 后進行洗膜。 以β-actin 為內參。 凝膠成像系統(tǒng)成像,Image J 軟件計算灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

本實驗中實驗數(shù)據的統(tǒng)計分析采用SPSS 26.0軟件,圖表的制作采用GraphPad 5.0 軟件,計量數(shù)據以平均數(shù)±標準差(±s)表示；實驗數(shù)據中多組間實驗數(shù)據的比較采用單因素方差分析,以P＜0.05 認為具有顯著性統(tǒng)計學差異；BBB 評分和CBS 評分等實驗數(shù)據的分析則采用方差分析進行比較。

注:A:假手術組；B:模型組:C:脊髓損傷+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓損傷+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓損傷+瑞香素90 mg/kg；與假手術(Sham)組相比,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型(SCI)組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖1 給予治療后SCI 大鼠在造模前、造模后的BBB 評分圖Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury +daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05,##P＜0.05.Figure 1 BBB score map of SCI rats before and after treatment

2 結果

2.1 SCI 大鼠BBB 評分

BBB 評分結果如圖1 所示；造模前各組實驗大鼠的BBB 評分無統(tǒng)計學差異,表明各組實驗大鼠的運動功能均無障礙。 然而,當實驗大鼠開始接受脊髓損傷后,各模型大鼠的運動功能均明顯降低,表明造模成功。 假手術組中各實驗大鼠的BBB 評分在術前、術后均無顯著性差異(P＞0.05),表明手術對實驗大鼠的活動并無明顯影響。 當給予瑞香素30 d 后,實驗大鼠的下肢運動功能得到了明顯得到提升,其BBB 評分也得到顯著性升高(P＜0.05),呈現(xiàn)劑量-時間依賴性關系。

2.2 Combine behavioral score (CBS)評分

CBS 評分結果如圖2 所示；造模前各組實驗大鼠的CBS 評分無統(tǒng)計學差異,表明各組實驗大鼠的運動功能均無障礙。 然而,當實驗大鼠開始接受脊髓損傷后,各模型大鼠的運動功能均明顯降低。 當大鼠接受脊髓損傷后1 d,模型組與空白組出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05),表明模型建立成功,當模型大鼠各給藥組給予相應藥物治療后,各給藥組實驗大鼠的CBS 評分較模型組實驗大鼠的CBS 評分均明顯降低(P＜0.05),表明瑞香素對于實驗大鼠的脊髓損傷均具有一定的改善作用,且高劑量治療組效果優(yōu)于低劑量組的治療效果。

注:A:假手術組；B:模型組:C:脊髓損傷+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓損傷+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓損傷+瑞香素90 mg/kg；與假手術(Sham)組相比,*P ＜0.05,**P＜0.01；與模型(SCI)組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖2 給予治療后SCI 大鼠在造模前、造模后的CBS 評分圖Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury +daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E,Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group,*P ＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,# P ＜0.05,##P＜0.05.Figure 2 CBS score map of SCI rats before and after treatment

2.3 瑞香素對SCI 大鼠脊髓組織氧化應激狀態(tài)的影響

機體氧化應激水平嚴重影響脊髓損傷后恢復。本研究結果顯示,與假手術組實驗大鼠相比,模型組實驗大鼠脊髓組織中SOD(圖3A)、GSH-Px(圖3B)與CAT(圖3C)活性較空白實驗大鼠顯著性降低(P＜0.05),MDA(圖3D)含量顯著性升高；然而,當給予實驗大鼠相應劑量的瑞香素治療之后,其脊髓組織中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量均有顯著性回調,表明給予藥物治療后脊髓損傷大鼠的氧化應激狀態(tài)具有顯著的改善作用。 其中,高劑量組的治療效果優(yōu)于低劑量組的療效。

2.4 瑞香素對GM1 對SCI 大鼠脊髓組織中TNFα、IL-1β、IL-6 和IL-10 含量的影響

炎癥在脊髓損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中也具有重要作用。 因此,本研究測定了各組實驗大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 炎癥因子水平的變化,具體如下圖所示。 與假手術組實驗大鼠相比,模型組實驗大鼠脊髓組織中TNF-α(圖4A)、IL-1β(圖4B)、 IL-10(圖4C)和IL-6(圖4D)含量均顯著性升高(P＜0.05),表明機體處于過炎癥狀態(tài)。 當給予藥物治療后,機體內細胞因子水平均有所回調(P＜0.05),表明瑞香素對脊髓損傷誘發(fā)的機體炎癥具有顯著性的調節(jié)作用。

注:A:假手術組；B:模型組:C:脊髓損傷+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓損傷+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓損傷+瑞香素90 mg/kg；與假手術(Sham)組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 與模型(SCI)組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖3 瑞香素對SCI 大鼠脊髓中SOD(A)、GSH-Px(B)、CAT(C)活性和MDA(D)含量的影響Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 3 Effect of daphnetin on the activity of SOD (A), GSH-Px (B), CAT (C) and MDA (D) in spinal cord of rats were affected by treatment

2.5 瑞香素對SCI 大鼠脊髓組織中凋亡信號通路的影響

如圖5 所示,與假手術組相比較,模型組的Bax/Bcl-2(圖5A、5B)、Caspase-3(圖5C、5D)和Cytc(圖5E、5F)含量均顯著性升高,表明脊髓損傷導致了大鼠脊髓組織促凋亡相關蛋白顯著性增加；當給予瑞香素后,其Bax/Bcl-2(圖5A、5B)、Caspase-3(圖5C、5D)和Cyt-c(圖5E、5F)含量的變化均發(fā)生顯著性回調,表明瑞香素對脊髓損傷誘發(fā)的凋亡相關蛋白異常表達具有顯著的調節(jié)作用,且高劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組。

2.6 瑞香素對SCI 大鼠脊髓組織中BDNF/TrkB和TRL4/NF-κB 信號通路的影響

如圖6 所示,與假手術組相比較,模型組的BDNF(圖6A、6B)、TrkB(圖6C、6D)、p-TrkB(圖6E、6F)、TRL4(G/H)和NF-κB p65(I/K)含量均顯著性升高,表明脊髓損傷導致了大鼠脊髓組織BDNF/TrkB 信號通路和TRL4/NF-κB 信號通路相關蛋白異常表達；當給予瑞香素后,其BDNF(圖6 A、6B)、TrkB(圖6C、6D)、p-TrkB(圖6E、6F)、TRL4(G/H)和NF-κB p65(I/K)含量的變化均發(fā)生顯著性回調,且呈現(xiàn)劑量依賴性,表明瑞香素能夠顯著性調節(jié)BDNF/TrkB 信號通路和TRL4/NF-κB 信號通路。

3 討論

脊髓損傷是由脊柱損傷后誘發(fā)的嚴重并發(fā)癥之一,包括原發(fā)性脊髓損傷與繼發(fā)性脊髓損傷。 其中繼發(fā)性脊髓損傷是損傷后機體細胞和分子水平的一種主動調節(jié)過程,具有可逆性和可控性；這也是目前脊髓損傷治療的主要階段[10-11]。 目前,藥物治療是降低脊髓損害程度最為快捷和有效的方法之一。 然而,目前臨床治療中,尚無一種安全有效的藥物。 因此,尋找一種安全、有效、多靶點的抗脊髓損傷藥物,已成為脊髓損傷相關疾病及其藥物研發(fā)的新熱點和難點。

注:A:假手術組；B:模型組:C:脊髓損傷+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓損傷+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓損傷+瑞香素90 mg/kg；與假手術(Sham)組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 與模型(SCI)組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖4 瑞香素對SCI 大鼠脊髓中TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-10(C)和IL-6(D)含量的影響Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 4 Effect of daphnetin on the contents of TNF-α (A), IL-1β (B), IL-10 (C) and IL-6 (D) in spinal cord of SCI rats

注:A:假手術組；B:模型組:C:脊髓損傷+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓損傷+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓損傷+瑞香素90 mg/kg；與假手術(Sham)組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 與模型(SCI)組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖5 瑞香素對實驗大鼠脊髓組織中Bax/Bcl-2(A/B)、Caspase-3(C/D)和Cyt-c(E/F)水平的影響Note. A, Normal group. B, Model group. C,Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D,Spinal cord injury + daphnetin 60 mg / kg. E,Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 5 Effect of daphnetin on Bax/Bcl-2 (A/B), Caspase-3 (C/D) and Cyt-C (E/F)levels in spinal cord tissue of experimental rats

大量研究表明,脊髓損傷過程中伴隨著氧化應激損傷[12-13]。 抗氧化劑能夠有效降低損傷脊髓組織中乳酸脫氫酶活性,減少超氧陰離子對機體的損害和繼發(fā)性水腫,繼而達到治療SCI 的目的。 瑞香素是一種天然抗氧化劑,能夠激活并促進機體內抗氧化酶活性,對自由基有著高效的清除作用[14-16]。 此外,脊髓損傷過程中伴隨著炎癥反應的發(fā)生。 TNF-α 是炎癥早期機體釋放的促炎因子,其表達水平的變化與機體的損傷程度密切相關。 IL-1β 參與機體脊髓損傷的過程可能與其能夠損傷血腦屏障的完整性密切相關。脊髓損傷誘發(fā)大量炎癥因子產生,最終導致機體組織處于過度炎癥反應和損傷狀態(tài)[17-19]。 本研究結果顯示,瑞香素能夠抑制IL-1β 分泌,減少由IL-1β 刺激成骨細胞所產生的NO、PGE2 含量,進而抑制TNF-α 含量,進而發(fā)揮抗炎作用。

注:A:假手術組；B:模型組:C:脊髓損傷+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓損傷+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓損傷+瑞香素90 mg/kg；與假手術(Sham)組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 與模型(SCI)組相比,#P＜0.05,##P＜0.01。圖6 瑞香素對實驗大鼠脊髓組織中BDNF(A/B)、TrkB(C/D)、p-TrkB(E/F)、TRL4(G/H)和NF-κB p65(I/K)水平的影響Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 6 Effect of daphnetin on the levels of BDNF (A/B), TrkB (C/D), p- TrkB (E/F),TRL4 (G/H) and NF-κB p65 (I/K) in spinal cord tissue of experimental rats

神經元細胞凋亡程序的啟動對繼發(fā)性脊髓損傷有直接的促進作用,Bax 蛋白具有促進細胞凋亡,并拮抗Bcl-2 的抑制凋亡作用,并能夠激活Caspase蛋白酶家族,最終加速細胞凋亡。 Caspase-3 是評價細胞凋亡的重要指標之一,可介導多種細胞凋亡途徑。 此外,TNF-α 又可激活凋亡相關蛋白Caspase-3的活化,進而促進機體細胞凋亡[20-23]。 為了進一步探究瑞香素對脊髓損傷誘發(fā)的凋亡作用的改善作用,本實驗檢測了瑞香素對脊髓組織的凋亡蛋白表達的改善作用,結果顯示,瑞香素能夠降低脊髓組織中Bax、Caspase-3、Cyt-c 凋亡蛋白的表達,進而減少或抑制脊髓神經元細胞凋亡,修復中樞神經系統(tǒng),并發(fā)揮神經保護作用。

研究表明,腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)可誘導和促進多種神經元的存活和分化,并能夠改善受損神經元的修復作用。 然而,當機體脊髓組織發(fā)生損傷后,可誘導BDNF 活化,并促進其與高親和力酪氨酸蛋白激酶受體B(tyrosine kinase B,TrkB)相互作用并發(fā)生結合,促進機體受損神經細胞的生存和發(fā)育,進而發(fā)揮神經保護作用,有效促進機體脊髓組織損傷后的軸突修復和肢體運動功能的恢復等作用[24],在調節(jié)神經節(jié)生長和神經再生過程中起著至關重要的作用。 TLR4 信號轉導通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一,TLR4 高表達時,激活NF-κB,進而啟動細胞因子TNF-α、IL-6 激活TLR4,最終引起級聯(lián)反應[25-26]。 此外,NF-κB 的活化還可進一步激活Caspase-3 信號通路介導細胞凋亡。 細胞異常凋亡在繼發(fā)性脊髓損傷過程中起著重要作用。 本研究發(fā)現(xiàn),瑞香素能夠調節(jié)模型大鼠凋亡相關蛋白的異常表達,這一作用可能與其能夠抑制TRL4/ NF-κB信號通路的活化有關。 因此,TLR4/NF-κB 信號通路同脊髓損傷后的恢復具有密切關系。

綜述所述,瑞香素能夠改善SCI 大鼠的運動功能,減輕SCI 大鼠的氧化應激損傷和炎癥水平,并能夠抑制脊髓組織的凋亡,進而改善脊髓損傷,其作用機制可能是通過調節(jié)TLR4/NF-κB 信號通路來發(fā)揮作用的。