徐曉華 劉敏 李可欣 張青

據(jù)GLOBOCAN 癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球乳腺癌新發(fā)病例為2088849，死亡病例為626679，其發(fā)病率(11.6%)和死亡率(6.6%)位居女性首位[1]。盡管目前有放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等多種治療手段，但仍無(wú)法完全根治此病，尋找更有效的治療方法是目前乳腺癌治療亟待解決的問題。

RECQL4屬于RECQ解旋酶家族(WRN，BLM，RECQL4，RECQL1和RECQL5)之一，存在于端粒和線粒體，具有解旋酶活性[2]，是正常細(xì)胞和癌細(xì)胞DNA復(fù)制起始因子之一，可以參與維持基因組穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)相互作用[3]。RECQL4 基因C端區(qū)域突變可導(dǎo)致具有癌癥易患性的Rothmund-Thomson綜合征[4]，此外，RECQL4蛋白和/或mRNA也可在乳腺癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]、前列腺癌[8]、骨肉瘤[9]等多種腫瘤中過表達(dá)，且多與預(yù)后不良相關(guān)。故本研究以固本抑瘤Ⅱ號(hào)為主，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察其療效，并探索其與RECQL4表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4T1-熒光素酶標(biāo)記(4T1-luc)小鼠乳腺癌細(xì)胞來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重20±2 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，獨(dú)立通風(fēng)籠(IVC)環(huán)境中。本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(AEEI-2018-089)。

1.2 試劑及儀器

固本抑瘤Ⅱ號(hào)由生黃芪(13.45%)、黨參(6.73%)、女貞子(6.73%)、茯苓(4.48%)、生白術(shù)(4.48%)、枸杞子(6.73%)、仙靈脾(4.48%)、川芎(4.48%)、雞血藤(13.45%)、莪術(shù)(4.48%)、腫節(jié)風(fēng)(6.73%)、浙貝母(6.73%)、苦參(5.38%)、水蛭(2.69%)、昆布(8.97%)共15味藥物組成，均購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院。煎煮方法：將草藥放入鍋內(nèi)，加入10倍體積去離子水，浸泡30分鐘后開始加熱，煮至沸騰，繼續(xù)煎煮30分鐘，將第一煎藥液用80目篩過濾后盛出。鍋中繼續(xù)加入5倍體積去離子水進(jìn)行第二煎，煮沸后煎煮25分鐘，過濾后與第一煎藥液混合，濃縮成藥物濃度為2.87 g/mL的藥液備用。鹽酸阿霉素(北京索萊寶科技有限公司；貨號(hào):D8740)；RNAsimple總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司；貨號(hào)DP419)；FastQuant RT Kit(With gDNase)(天根生化科技有限公司；貨號(hào)KR116-02)；2×SYBR Green qPCR Master Mix(Biotool；貨號(hào)B21203)；Pierce ECL Western Blotting Substrate(Pierce；貨號(hào)32106)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce；貨號(hào)：23227)；RECQL4抗體(Sdix；貨號(hào)2547.00.02)；β-Actin抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號(hào)C1313)；山羊抗小鼠/抗兔IgG抗體HRP標(biāo)記(北京普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號(hào)C1308、C1309)。

熒光定量PCR儀CFX96(美國(guó)Bio-Rad)；Mini電泳儀、Mini轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)FluorChem FC3(美國(guó)ProteinSimple)，5804R高速大容量冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。

1.3 4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1-luc細(xì)胞，配成1×106/mL的細(xì)胞懸液，將小鼠用異氟烷氣體麻醉后進(jìn)行接瘤，每只小鼠乳墊下注射50 uL(5×104個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸液[10]。

1.4 分組及給藥

按體重將荷瘤小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥組、阿霉素組和中藥+阿霉素組，每組6只，接種后24小時(shí)開始給藥，共28天。參考徐叔云的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，人和小鼠的體表面積折算的等效劑量比值為0.0026，故小鼠每日中藥用量為0.580 g，即0.202 mL，為操作方便，灌胃時(shí)取0.2 mL/天。阿霉素用蒸餾水配成0.5 mg/mL，4℃避光保存。具體給藥方法：對(duì)照組、中藥組分別予0.2 mL蒸餾水和中藥灌胃，1次/日，阿霉素組予阿霉素1.5 mg/kg腹腔注射，1次/日，中藥+阿霉素組予0.2 mL中藥灌胃聯(lián)合阿霉素1.5 mg/kg腹腔注射，1次/日。

1.5 小鼠體重、原位瘤長(zhǎng)短徑及瘤重測(cè)量

給藥后每隔7天稱量小鼠體重，同時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，在給藥第28天手術(shù)切取小鼠乳腺原位瘤稱重，計(jì)算并比較各組小鼠的原位瘤體積和抑瘤率。

腫瘤體積=a×b2/2

抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤)×100%

1.6 RealtimePCR檢測(cè)原位瘤組織RECQL4 mRNA表達(dá)

利用天根RNA提取試劑盒提取總細(xì)胞RNA，1 μg RNA合成cDNA。引物序列見表1，以上引物由Invitrogen公司合成。常規(guī)方法，實(shí)時(shí)定量PCR，獲得CT值。用2-△△CT方法分析各組小鼠目的基因的表達(dá)并比較。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 Western-Blot檢測(cè)原位瘤組織RECQL4蛋白表達(dá)

研磨乳腺原位瘤組織，提取蛋白后BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% BSA室溫封閉2小時(shí)。分別加入稀釋后的一抗β-Actin(抗體按1:1000稀釋)和RECQL4(抗體按1∶10000稀釋)，孵育4℃冰箱過夜，TBST洗膜5 min×3次，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/抗兔IgG抗體(抗體按1∶5000稀釋)室溫孵育1小時(shí)，用顯影儀曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 固本抑瘤Ⅱ號(hào)對(duì)小鼠原位瘤瘤重和抑瘤率的影響

與對(duì)照組相比，中藥組、阿霉素組和中藥+阿霉素組瘤重均明顯減輕(P<0.01)，抑瘤率分別為25.23%、41.44%、59.46%，且中藥+阿霉素組瘤重低于中藥組和阿霉素組(P<0.01)。見表2。

表2 不同藥物干預(yù)后各組 小鼠原位瘤瘤重及抑瘤率

2.2 固本抑瘤Ⅱ號(hào)對(duì)荷瘤小鼠體重的影響

體重是觀察藥物療效的一個(gè)重要指標(biāo)，在給藥第7天，各組小鼠體重?zé)o明顯差異，在給藥第14天，中藥+阿霉素組小鼠體重較對(duì)照組減輕(P<0.05)，在給藥第21天和第28天，阿霉素組和中藥+阿霉素組小鼠體重均明顯低于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，而中藥組小鼠體重與對(duì)照組相比未見明顯差異。見表3。

2.3 固本抑瘤Ⅱ號(hào)對(duì)小鼠原位瘤體積的影響

在給藥前14天，各組原位瘤體積增長(zhǎng)均較緩慢，在給藥后14天，各組原位瘤體積增長(zhǎng)較前變快，以對(duì)照組和中藥組增速較為明顯，中藥+阿霉素組增速最為緩慢。 在給藥第28天， 中藥+阿霉素組小鼠原位瘤體積明顯小于對(duì)照組(P<0.01)和中藥組(P<0.05)。見圖1。

表3 不同藥物干預(yù)后各組小鼠體重變化

注：與對(duì)照組比較aP<0.01，與中藥組比較bP<0.05。

2.4 固本抑瘤Ⅱ號(hào)對(duì)RECQL4 mRNA和RECQL4蛋白表達(dá)的影響

用Image J軟件計(jì)算RECQL4蛋白條帶的灰度值，可以看出，中藥組(P<0.05)、阿霉素組(P<0.01)和中藥+阿霉素組(P<0.01)RECQL4蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組降低，而且與對(duì)照組相比，阿霉素組(P<0.05)和中藥+阿霉素組(P<0.01)也抑制了RECQL4 mRNA的表達(dá)(見表4、圖2、表5)。

表4 不同藥物干預(yù)后各組小鼠 原位瘤RECQL4 mRNA表達(dá)

注：①對(duì)照組；②中藥組；③阿霉素組；④中藥+阿霉素組。

表5 不同藥物干預(yù)后各組小鼠原位瘤RECQL4 蛋白表達(dá)

3 討論

虛、毒、瘀是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，《素問·刺法論篇》云“正氣存內(nèi)，邪不可干”，《素問·評(píng)熱病論篇》云“邪之所湊，其氣必虛”，說(shuō)明正氣存內(nèi)是機(jī)體抗御病邪的防線，正氣不足是邪氣內(nèi)侵的基礎(chǔ)；癌毒是在臟腑功能失調(diào)、氣血郁滯的基礎(chǔ)上，受內(nèi)外多種因素誘導(dǎo)而生成，是導(dǎo)致癌病的一類特異性致病因子[11]，也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病機(jī)；腫瘤屬“癥瘕”“積聚”等范疇，血瘀與其關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤是一個(gè)高度血栓前狀態(tài)，可以導(dǎo)致血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)升高4～7倍甚至更高[12]，因此補(bǔ)虛、解毒、化瘀是中藥治療腫瘤的重要法則。郁仁存教授在臨床實(shí)踐中提出了腫瘤的“內(nèi)虛學(xué)說(shuō)”，后續(xù)又發(fā)展出“平衡學(xué)說(shuō)”和“氣血理論”，在腫瘤治療方面強(qiáng)調(diào)益氣活血解毒法的運(yùn)用，固本抑瘤Ⅱ號(hào)即是郁仁存教授基于此創(chuàng)立。

固本抑瘤Ⅱ號(hào)包含15味藥物，方中生黃芪、黨參、茯苓、生白術(shù)等益氣養(yǎng)血，川芎、雞血藤、莪術(shù)等活血化瘀，腫節(jié)風(fēng)、浙貝母、苦參等解毒散結(jié)，扶正與祛邪兼顧，既能提高機(jī)體免疫力，又能改善血液高凝狀態(tài)。同時(shí)方中的多種藥物均具有抗腫瘤作用，如黃芪中的黃芪多糖可以激活巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮和腫瘤壞死因子α，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]；黨參中的多糖CPP1a and CPP1c可以上調(diào)Bax/Bcl-2比值并激活caspase-3，并通過影響腫瘤細(xì)胞G2/M時(shí)相來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]；茯苓中的茯苓酸可以以濃度和時(shí)間依賴性的方式顯著抑制細(xì)胞增殖并以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡部分通過PTEN/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Caspase 3/7活性介導(dǎo)[15]；雞血藤提取物可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬，阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[16]；莪術(shù)中的有效成分姜黃素、莪術(shù)醇、β-欖香烯等可以通過抑制增殖細(xì)胞核抗原Ki-67和PCNA的表達(dá)、抑制mTOR信號(hào)通路的激活和調(diào)控miRNA的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]；女貞子中的提取物齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷等可以抗誘變，抑制肉瘤、消化系腫瘤、泌尿系腫瘤等多種腫瘤的生長(zhǎng)[18]。盡管方中多味中藥在實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出抗腫瘤功效，但單味中藥在臨床運(yùn)用和功效發(fā)揮方面都具有局限性，難以完全覆蓋患者癥狀，因此中藥復(fù)方才是當(dāng)前中醫(yī)治療的主要趨勢(shì)。

阿霉素是原發(fā)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性乳腺癌的首選化療藥物之一，其屬于細(xì)胞毒類藥物，可作用于腫瘤細(xì)胞的DNA。盡管阿霉素在乳腺癌化療中廣泛應(yīng)用，但其副作用仍無(wú)法避免，主要包括疲乏、心臟毒性、肝功能損傷、脫發(fā)、皮膚色素沉著等[19-20]，因此，如何減輕阿霉素化療中的不良反應(yīng)是臨床醫(yī)生無(wú)法逃避的問題，而中藥則是解決方法之一。

筆者團(tuán)隊(duì)的既往研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)340例III-IV期腫瘤患者(其中乳腺癌患者105例)的觀察中，固本抑瘤Ⅱ號(hào)聯(lián)合化療能提高治療有效率 (CR+PR) (34.9%VS27.6%)，改善化療所致惡心嘔吐、腹瀉及骨髓抑制(P<0.05)，降低治療前纖維蛋白原、纖溶酶和血栓素TXB2水平((P<0.01)，減輕患者高凝狀態(tài)[21]。在基礎(chǔ)研究中，固本抑瘤Ⅱ號(hào)以劑量依賴性的方式抑制4T1乳腺癌細(xì)胞的增殖，可以降低4T1細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子(FGF-2和VEGF)的表達(dá)，并通過抑制乙酰肝素酶的表達(dá)進(jìn)一步降低絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)的磷酸化[22]，但在疾病相關(guān)基因?qū)用娴难芯可写钊搿?/p>

通過UALCAN[23](http://ualcan.path.uab.edu)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌樣本進(jìn)行生物信息分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌組織中RECQL4基因表達(dá)顯著升高(P<0.01)，進(jìn)一步對(duì)RECQL4基因高表達(dá)和低表達(dá)患者的生存率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩者的生存率沒有顯著差異，但在五年乃至約近10年生存期內(nèi)，RECQL4基因高表達(dá)的乳腺癌患者生存率低于RECQL4基因低表達(dá)患者，提示RECQL4高表達(dá)可能是乳腺癌患者的危險(xiǎn)因素。此外，Arora Arvind[24]通過對(duì)1900多例乳腺癌樣本中RECQL4的基因拷貝數(shù)、mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)水平的大型隊(duì)列分析發(fā)現(xiàn)RECQL4高表達(dá)與侵襲性腫瘤行為顯著相關(guān)，證實(shí)了其對(duì)散發(fā)性乳腺癌具有腫瘤促進(jìn)作用，同時(shí)RECQL4基因突變也出現(xiàn)在BRCA1和BRCA2陰性的家族性乳腺癌中[25]，因此，RECQL4可能是乳腺癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了固本抑瘤Ⅱ號(hào)、阿霉素及固本抑瘤Ⅱ號(hào)聯(lián)合阿霉素均可對(duì)4T1乳腺癌荷瘤小鼠原位瘤產(chǎn)生抑制作用，抑瘤率分別為25.23%、41.44%和59.46%，聯(lián)合應(yīng)用的抑瘤效果更加明顯，其機(jī)制可能與抑制RECQL4蛋白的表達(dá)有關(guān)。