范圓圓 李林福 李亞琪 黃玉娟 高園園 舒一崧 孔靜 潘鋒 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

卷丹為百合科植物卷丹LilumlancifoliumThunb.)的干燥肉質(zhì)鱗葉，為2020版《中國藥典》規(guī)定的三種藥用百合來源之一。其藥食兩用，性寒味甘微苦，入心、肺經(jīng)。有養(yǎng)陰潤肺，清心安神的功效。臨床上常用于陰虛燥咳，勞嗽咳血，虛煩驚悸等癥[1]?，F(xiàn)代藥效作用研究表明，卷丹具有明顯的降血糖作用[2-3]。

卷丹中主要含有酚類、甾體皂苷類、多糖類等主要化學(xué)類型，亦含有生物堿、磷脂、氨基酸以及微量元素等成分[4]。課題組前期對卷丹中皂苷類及酚類有效部位化學(xué)成分進行了系統(tǒng)研究，并分別建立了皂苷類及酚類指標(biāo)性成分含量測定方法及HPLC特征圖譜[5-7]。近年來，對百合降糖作用的研究主要集中在百合多糖，同時也有文獻根據(jù)體外實驗推測百合甾體皂苷具有潛在的降糖作用[8-12]。課題組前期在基于降糖作用對百合進行藥物體系研究時，發(fā)現(xiàn)百合中的酚類成分和甾體皂苷類成分為其藥物體系架構(gòu)的主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)，并建立了同時測定百合酚類及甾體皂苷類成分含量測定方法及特征圖譜[13]。筆者基于本課題組前期研究積淀[14-15]，建立卷丹有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法，其中涵蓋了卷丹兩類主要化學(xué)類型酚類及甾體皂苷類，并對模擬基準(zhǔn)的準(zhǔn)確性進行佐證及質(zhì)量評價應(yīng)用與驗證。以精準(zhǔn)、有效、便捷地評價卷丹飲片的質(zhì)量，為卷丹的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為有關(guān)藥物的質(zhì)量有效評價與控制提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695自動進樣高效液相色譜儀，2998型光電二極管矩陣檢測器(美國沃特世公司)，Empower工作站；Sartorius BT 125D型1/100 000電子分析天平；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋SYG-4(常州朗越儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥

王百合苷C對照品(批號：DST201027-076)，王百合苷A對照品(批號：DST201029-107)，王百合苷E對照品(批號：DST201027-075)，王百合苷B對照品(批號：DST200602-071)，均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，對照品純度均≥98%；卷丹皂苷[(25R)-3β,17α-二羥基-5α-螺甾烷-6-酮-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷，批號：18080801]，購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，對照品純度≥98%；色譜級乙腈購自Fisher Scientific公司；娃哈哈純凈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司；甲醇，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸，購自北京化工廠。16批卷丹飲片購自全國各地，檢驗報告均符合2015版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生和王學(xué)勇教授鑒定為百合科植物卷丹的干燥肉質(zhì)鱗葉。卷丹飲片的產(chǎn)地、批號、生產(chǎn)商及采購地見表1，飲片樣品現(xiàn)存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱量9.50 mg王百合苷C對照品，用80%甲醇溶解并定容至5 mL棕色容量瓶中，即得王百合苷C對照品母液。精密稱量9.35 mg王百合苷E對照品，用80%甲醇溶解并定容至5 mL棕色容量瓶中，即得王百合苷E對照品母液。精密稱量32.25 mg王百合苷A對照品，用80%甲醇溶解并定容至5 mL棕色容量瓶中，即得王百合苷A對照品母液。精密稱量46.50 mg王百合苷B對照品，用80%甲醇溶解并定容至5 mL棕色容量瓶中，即得王百合苷B對照品母液。精密稱量14.75 mg卷丹皂苷對照品，用80%甲醇溶解并定容至5 mL棕色容量瓶中，即得卷丹皂苷對照品母液。分別吸取王百合苷C及王百合苷E對照品母液0.1、0.2、0.3、0.4及0.5 mL，王百合苷A對照品母液0.4、0.5、0.6、0.7及0.8 mL，王百合苷B對照品母液0.3、0.35、0.4、0.45及0.5 mL，卷丹皂苷0.4、0.6、0.8、1.0及1.2 mL至5 mL棕色容量瓶中，用80%甲醇定容，即得5個濃度梯度的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取卷丹飲片基準(zhǔn)粉末(S16)及待評價飲片粉末(過4號篩)2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100倍量80%甲醇，加熱回流60 分鐘，濾液蒸干，殘渣加80%甲醇溶解并完全轉(zhuǎn)移至5 mL棕色容量瓶中，再用80%甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

表1 16批卷丹飲片信息

2.1.3 色譜檢測條件 Waters Xbridge Shield RP C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，洗脫梯度(0～10 分鐘，5%～14%A；10～30 分鐘，14%A；30～31 分鐘，14%～21%A；31～45 分鐘，21%A；45～55 分鐘，21%～36%A；55～63 分鐘，36%～66.3%A；63～70 分鐘，66.3%A；70～83 分鐘，66.3%～100%A；83～90 分鐘，100%A)，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，酚類成分檢測波長為330 nm，甾體皂苷類成分檢測波長為205 nm，進樣20 μL。卷丹飲片(S16)樣品、混合對照品在以上色譜檢測條件下的HPLC色譜圖，見圖1。

注：A供試品(330 nm)；B供試品(205 nm)；C混合對照品(330 nm)；D混合對照品(205 nm)；4王百合苷C；7王百合苷A；9王百合苷E；12王百合苷B；22卷丹皂苷；1-17酚類成分；18-26甾體皂苷類成分。

2.1.4 有效基準(zhǔn)特征圖譜方法學(xué)考察 (1)精密度考察：按“2.1.2”制備S16供試品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件，連續(xù)進樣6次，以王百合苷C為參照峰，計算25個色譜峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積。計算結(jié)果顯示，25個色譜峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.54%和2.08%，說明儀器精密度良好，符合含量測定要求[16]。(2)穩(wěn)定性考察：按“2.1.2”制備S16供試品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件，分別于0、2、4、6、12、24 小時進樣測定，以王百合苷C為參照峰，計算25個色譜峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積。計算結(jié)果顯示，25個色譜峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于1.85%和2.68%，說明樣品在24 小時內(nèi)穩(wěn)定[16]。(3)重復(fù)性考察：按“2.1.2”平行制備6份S16卷丹供試品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件并進樣檢測，以王百合苷C為參照峰，計算25個色譜峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積。計算結(jié)果顯示，25個色譜峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.79%和2.13%，說明本方法重復(fù)性良好[16]。

2.1.5 代表性成分含量測定方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察：按“2.1.1”制備混合對照品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件并進樣檢測，得到各代表性成分峰面積，以對照品的量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2，線性方程相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，表明線性范圍符合測定要求[16]。

(2)精密度考察：按“2.1.2”制備S16供試品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件，連續(xù)進樣6次，得到王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B及卷丹皂苷的峰面積，分別計算RSD為0.42%、0.36%、0.39%、0.31%和1.58%，說明儀器精密度良好，符合含量測定要求[16]。(3)穩(wěn)定性考察：按“2.1.2”制備S16供試品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件，分別于0、2、4、6、12、24 小時進樣，得到王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B及卷丹皂苷的峰面積，分別計算RSD值為0.70%、1.19%、1.16%、1.05%和1.71%，說明供試品溶液在24 小時內(nèi)穩(wěn)定性良好[16]。(4)重復(fù)性考察：按“2.1.2”平行制備6份S16卷丹供試品溶液，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件并進樣檢測，得到王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B及卷丹皂苷的峰面積并計算其含量，分別計算RSD值為0.38%、0.99%、1.38%、0.84%和1.69%，表明建立的含量測定方法重復(fù)性良好[16]。(5)加樣回收率考察：精密稱量6.03 mg卷丹皂苷對照品，用80%甲醇溶解并定容至2 mL容量瓶中(a)。精密稱量15.10 mg王百合苷A對照品，用80%甲醇溶解并定容至2 mL容量瓶中(b)。取卷丹粉末約1 g，精密稱定，各6份，分別加入a、b、王百合苷C、王百合苷E及王百合苷B對照品母液 0.28 mL、0.3 mL、0.1 mL、0.16 mL及0.25 mL，按照“2.1.2”項下方法，平行制備6份供試品溶液，按照“2.1.3”項下方法進樣測定，得到王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B及卷丹皂苷的峰面積，計算王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B及卷丹皂苷的含量及加樣回收率，結(jié)果見表3，回收率在95%～102%之間，RSD≤3%，表明建立的含量測定方法準(zhǔn)確可靠[16]。

2.1.6 模擬基準(zhǔn)點質(zhì)量表征考察 精密稱取王百合苷C對照品3.87 mg至50 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.0774 mg/mL的王百合苷C對照品溶液作為模擬基準(zhǔn)點，與“2.1.2”項下制備的卷丹飲片(S16)供試品溶液中所檢測的王百合苷C濃度相同，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件并進樣測定，得模擬基準(zhǔn)點的HPLC色譜圖，見圖2。

表2 5個代表性成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=5)

表3 加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

圖2 模擬基準(zhǔn)點的HPLC色譜圖(330 nm)

由圖2可知，王百合苷C對照品模擬基準(zhǔn)點的保留時間(min)及峰面積(μV·s)與卷丹有效基準(zhǔn)特征圖譜中王百合苷C的保留時間及峰面積(有效基準(zhǔn)飲片：16.200，4715466；模擬基準(zhǔn)點：16.270，4747752)RSD值均小于3%，表明所建立的檢測方法及其檢測結(jié)果與模擬卷丹質(zhì)量表征基準(zhǔn)點均具有準(zhǔn)確性，即王百合苷C對照品溶液(0.0774 mg/mL)可作為模擬表征點。

2.2 有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息

以S16為基準(zhǔn)得到的有效基準(zhǔn)特征圖譜中26個特征峰的保留時間、峰面積(以100 mg卷丹飲片計)及含量，以模擬基準(zhǔn)點為基準(zhǔn)得到的相對保留時間、相對峰面積、相對含量及換算系數(shù)(代表性成分的相對含量/代表性成分的相對峰面積)，見表4。

由表4可得卷丹有效質(zhì)量基準(zhǔn)標(biāo)尺，即基于模擬基準(zhǔn)點得到的26個特征峰及其相對保留時間、相對峰面積以及5個代表性成分的相對含量。

2.3 評價與驗證

取15批待評價卷丹飲片樣品，按“2.1.2”制備供試品溶液(n=3)，按“2.1.3”設(shè)定檢測條件并進樣檢測，得到15批待評價卷丹飲片質(zhì)量表征信息及5個代表性成分的實測含量，同時實測S16卷丹飲片有效基準(zhǔn)特征圖譜，并通過模擬基準(zhǔn)標(biāo)尺得到5個代表性成分的換算含量，以驗證基于有效質(zhì)量標(biāo)尺進行卷丹質(zhì)量評價的準(zhǔn)確性。如圖3、4、5、6，以及表5所示。

表4 26個特征峰的質(zhì)量表征信息

注：A:330 nm；B:205 nm

表5 15批卷丹飲片中5個特征代表性成分的含量(%；n=3)

圖4 15批卷丹飲片與基準(zhǔn)(S16)的相對保留時間

圖5 15批卷丹飲片與基準(zhǔn)(S16)的相對峰面積

圖6 15批卷丹飲片與基準(zhǔn)(S16)的相對含量

如圖3、4所示，15批卷丹飲片HPLC特征圖譜皆含有26個相同的特征峰，即17個酚類特征峰及9個甾體皂苷類特征峰，且26個特征峰的相對保留時間與有效基準(zhǔn)標(biāo)尺(S16)基本一致。結(jié)果表明：15批待評價飲片皆為卷丹飲片，且說明了有效基準(zhǔn)標(biāo)尺可以應(yīng)用于卷丹飲片真?zhèn)蔚蔫b別。

由表5可得，15批卷丹飲片中5個代表性成分的實測含量與換算含量基本一致，即驗證了代表性成分換算含量結(jié)果及其相對含量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由圖5、6可得，15批卷丹飲片質(zhì)量表征信息，根據(jù)26個特征峰相對峰面積及5個代表性成分相對含量高于其有效基準(zhǔn)標(biāo)尺對應(yīng)峰的數(shù)目和幅度，綜合考量評價得出S7，S11，S10，S12，S5，S13和S4質(zhì)量較優(yōu)。

3 討論

以自然藥學(xué)觀藥物體系為導(dǎo)向[17-20]，本研究基于HPLC-PDA技術(shù)，通過對供試品溶液制備方法(提取時間、提取溶劑、提取倍量及提取次數(shù))及色譜條件(溫度、流動相組成、流速及檢測波長)進行考察，建立了卷丹有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法與評價模式。即以確定藥效的飲片為基準(zhǔn)，并以特征代表性成分對照品王百合苷C模擬特征圖譜質(zhì)量表征基準(zhǔn)點，其特征圖譜所表征的特征峰及其特征代表性成分質(zhì)量信息涵蓋卷丹主要化學(xué)類型酚類和甾體皂苷類，體現(xiàn)其質(zhì)量內(nèi)涵的整體性、有效性、基準(zhǔn)性。本研究建立的卷丹質(zhì)量評價方法能夠整體、準(zhǔn)確、便捷地對卷丹飲片進行質(zhì)量表征，關(guān)注了卷丹飲片質(zhì)量的精確性與應(yīng)用有效性，為卷丹的質(zhì)量評價與篩選及其藥物質(zhì)量的精準(zhǔn)預(yù)期提供了科學(xué)依據(jù)。