李文霞 孔靜 武秋紅 王夢(mèng)林 路東波 孫仁弟 黃廣偉 李思潼 范圓圓 黃玉娟 高園園 劉路路 陳思玉 姜艷艷 石任兵

香薷為唇形科植物石香薷MoslachinensisMaxim.或江香薷ModachinensisMaxim.cv.jiangxiangru的干燥地上部分，前者習(xí)稱(chēng)“青香薷”，后者習(xí)稱(chēng)“江香薷”。本文主要基于江香薷進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，其性辛，微溫，藥食兼用，屬于藥食同源物品，具有發(fā)汗解暑、行水散濕、溫胃調(diào)中的功效，臨床多用于抗菌、抗病毒、調(diào)血脂、降低膽固醇、抗氧化、增強(qiáng)免疫等；其主要成分含有酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)，此外還含有苯丙素類(lèi)、脂肪酸等[1-7]。2015版、2020版《中國(guó)藥典》一部以江香薷中揮發(fā)油成分對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制；文獻(xiàn)報(bào)道主要對(duì)其揮發(fā)油中單萜類(lèi)成分(香荊芥酚、麝香草酚)與黃酮類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定[8-11]。

為了能整體、有效、精準(zhǔn)地表征與評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，本課題組基于自然藥學(xué)觀藥物體系理念，相繼建立了中藥質(zhì)量表征模式、方法與應(yīng)用[12-28]。筆者在基于活血藥效對(duì)江香薷飲片進(jìn)行藥物體系研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其活血藥效的藥學(xué)架構(gòu)主要為其酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)及萜類(lèi)成分。本文研究中以確定有活血藥效的江香薷飲片作為飲片基準(zhǔn)(S5)，以飲片基準(zhǔn)中黃酮類(lèi)有效特征指標(biāo)性成分黃芩素-7-甲醚作為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)，采用HPLC-PDA建立江香薷有效基準(zhǔn)特征圖譜，其 15個(gè)共有特征峰及其7個(gè)特征代表性成分涵蓋了酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)及萜類(lèi)三種主要化學(xué)類(lèi)型；以黃芩素-7-甲醚對(duì)照品模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息，作為江香薷飲片的質(zhì)量基準(zhǔn)標(biāo)尺，并對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行佐證及質(zhì)量評(píng)價(jià)應(yīng)用與驗(yàn)證。所建立的有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征模式、方法，可整體、有效、精準(zhǔn)、簡(jiǎn)易地對(duì)江香薷飲片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)與篩選。

1 材料

1.1 主要的儀器

Waters e2695 自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，2998PDA 檢測(cè)器，Empower 工作站，Sartorius BT 25S 型 1 /100 000 電子分析天平( 北京賽多利斯儀器有限公司) ，AL204 型1 /10 000 電子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)，KQ-500 DE 型數(shù)控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)，RE-52 A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；ZNHW型智能恒溫電熱套(鄭州恒巖儀器有限公司)。

1.2 主要的試藥與試劑

咖啡酸(批號(hào)：Y09J8C28349，純度≥98 %)、異迷迭香酸苷(批號(hào)：R02M9F60399，純度≥98 %)、野黃芩苷(批號(hào)：Z17O7XX22900，純度≥98 %)、迷迭香酸(批號(hào)：S03N8H47130，純度≥98 %)、黃芩素-7-甲醚(批號(hào)：P15J8F38064，純度≥98 %)、 香荊芥酚(批號(hào)：Z13M8H35994，純度≥98 %)、麝香草酚(批號(hào)：TN1112CB14，純度≥98 %)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司)；分析甲醇(購(gòu)自北京化工廠)；磷酸(北京化學(xué)試劑公司)；娃哈哈水( 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

14批江香薷飲片分別購(gòu)自北京市各藥店，見(jiàn)表1，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定所購(gòu)江香薷飲片均為正品，飲片標(biāo)本現(xiàn)存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系。

2 方法和結(jié)果

2.1 有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征方法的建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取咖啡酸、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚各對(duì)照品4.56 mg、2.04 mg、11.04 mg、4.06 mg、9.48 mg、7.80 mg，分別置6個(gè)10 mL的量瓶中；精密稱(chēng)取異迷迭香酸苷4.38 mg置100 mL量瓶中，分別用70 % 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，然后再依次精密量取上述各對(duì)照品溶液0.0220 mL、0.9800 mL、0.2430 mL、0.1133 mL、0.1300 mL、0.2300 mL置同一5 mL量瓶中，精密量取異迷迭香酸苷對(duì)照品溶液3.62 mL置另一5 mL量瓶中，分別用70 % 甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚濃度分別為2.01 μg/mL、31.71 μg/mL、39.98 μg/mL、53.65 μg/mL、9.20 μg/mL、24.65 μg/mL、46.94 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

表1 14批江香薷飲片信息

2.1.2 供試品溶液的制備 取過(guò)2號(hào)篩的飲片基準(zhǔn)(飲片編號(hào)S5)粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞的錐形瓶中，精密加入90 % 甲醇50 mL ，稱(chēng)定其重量，加熱回流提取1 小時(shí)，冷卻至室溫，再稱(chēng)定其重量，用90 % 甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，用 0.45 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測(cè)條件 通過(guò)自建的色譜檢測(cè)條件：Waters XBridge Shield RP18色譜柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ，流動(dòng)相為乙腈-0.2 % 磷酸水，梯度洗脫，梯度洗脫條件見(jiàn)表2，流速 0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣量20 μL；在此色譜條件下，江香薷混合對(duì)照品及供試品溶液的HPLC 圖譜見(jiàn)圖1。

表2 HPLC 梯度洗脫條件

如圖所示，15個(gè)特征峰分離度良好，通過(guò)與咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚各對(duì)照品紫外吸收光譜對(duì)比，判斷15個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分類(lèi)型，涵蓋了酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)3種主要化學(xué)成分類(lèi)型。

2.1.4有效基準(zhǔn)特征圖譜方法學(xué)考察 (1)精密度考察：精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次檢測(cè)，以黃芩素-7-甲醚為參照，計(jì)算各色譜峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示：各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均<1.49 % ，各特征峰相對(duì)峰面積的RSD均<2.78 % ，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜要求(≤3%)[27]。(2)穩(wěn)定性考察: 精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，于0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24 小時(shí)分別進(jìn)樣檢測(cè)，以黃芩素-7-甲醚為參照，計(jì)算各色譜峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示：各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<2.34 % ，各特征峰相對(duì)峰面積的 RSD均<2.60 %，說(shuō)明樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(≤3%)[27]。(3)重復(fù)性考察：取同一批(S5)江香薷飲片，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備 6 份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各色譜峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示：各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<2.25 % ，各特征峰相對(duì)峰面積的RSD均<2.04 %，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好(≤3%)[27]。

A:供試品 ( 270 nm) ; B: 混合對(duì)照品 ( 270 nm)

2.1.5 特征代表性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察：按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液，分別設(shè)置進(jìn)樣量5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、40 μL進(jìn)樣檢測(cè)，以進(jìn)樣量(μg) 為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 7個(gè)特征代表性成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 (n=8)

(2)精密度考察：精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚峰面積的RSD分別為 2.70%、 2.37%、0.35%、1.19%、1.29%、1.41%、2.21%，表明儀器精密度良好，符合含量測(cè)定要求(<5%)[27]。(3)穩(wěn)定性考察：精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，于0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)分別進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚峰面積的RSD分別為1.15%、2.80%、1.67%、2.23%、1.87%、1.97%、1.25%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。(4)重復(fù)性考察：取同一批(S5)江香薷飲片，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備 6 份供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示：咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚的平均含量分別為 0.02%、0.33%、0.40%、0.62%、0.11%、 0.20%、 0.37%，RSD值分別為2.04%、1.62%、1.20%、0.73%、0.59%、0.99%、1.14%，表明本方法重復(fù)性良好。(5)加樣回收率考察：取已知特征指標(biāo)性成分含量的過(guò)二號(hào)篩的江香薷飲片(S5)約 0.25 g，精密稱(chēng)定 6 份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚平均加樣回收率分別為98.92%、101.59%、102.31%、99.82%、99.97%、100.75%、99.90%，RSD分別為2.28%、2.47%、2.19%、1.64%、1.65%、2.24%、2.85%，符合定量要求，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.1.6 模擬基準(zhǔn)點(diǎn)質(zhì)量表征考察 文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類(lèi)成分具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)的作用[1,28]，因此以黃酮類(lèi)有效特征代表性成分黃芩素-7-甲醚作為質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)。精密稱(chēng)取黃芩素-7-甲醚對(duì)照品2.30 mg于20 mL容量瓶中，用90% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密移取1 mL至10 mL容量瓶中，用90% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.0115 mg/mL的黃芩素-7-甲醚對(duì)照品溶液作為模擬基準(zhǔn)點(diǎn)，即與2.1.2項(xiàng)下制備江香薷飲片(S5)供試品溶液中所檢測(cè)的黃芩素-7-甲醚含量相同，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件，得模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的HPLC色譜圖，見(jiàn)圖2。

由模擬基準(zhǔn)點(diǎn)色譜圖可得其保留時(shí)間：61.020分鐘，峰面積：937319 ，與江香薷有效基準(zhǔn)特征圖譜中黃芩素-7-甲醚的保留時(shí)間(61.012 分鐘)、峰面積(891286 )基本吻合，表明所建立的檢測(cè)方法及其檢測(cè)結(jié)果與模擬江香薷質(zhì)量表征基準(zhǔn)點(diǎn)均具有準(zhǔn)確性，即0.0115 mg/mL黃芩素-7-甲醚對(duì)照品溶液可作為模擬基準(zhǔn)點(diǎn)。

2.2 有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息

以確定有活血藥效的江香薷飲片(S5)作為有效飲片(基準(zhǔn))，在其有效基準(zhǔn)特征圖譜中，共指認(rèn)出了 15 個(gè)特征峰，其中酚酸類(lèi)特征峰 10 個(gè)，黃酮類(lèi)特征峰 3 個(gè)，揮發(fā)油中萜類(lèi)特征峰2個(gè)；有效基準(zhǔn)特征圖譜中15個(gè)特征峰的保留時(shí)間、峰面積(均以100 mg飲片量計(jì))、含量，以模擬基準(zhǔn)點(diǎn)為基準(zhǔn)得到的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積、相對(duì)含量、換算系數(shù)(特征代表性成分的相對(duì)含量/特征代表性成分的相對(duì)峰面積)，見(jiàn)表5。

表4 加樣回收率考察結(jié)果 (n=2)

圖2 模擬基準(zhǔn)點(diǎn)的 HPLC 色譜圖(270nm)

表5 江香薷有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征信息

由表5可得，以對(duì)照品模擬基準(zhǔn)點(diǎn)為基準(zhǔn)得到的15個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積及7個(gè)特征指標(biāo)性成分的相對(duì)含量、含量換算系數(shù)，即為江香薷有效質(zhì)量基準(zhǔn)標(biāo)尺。

2.3 應(yīng)用與驗(yàn)證

取 13 批待評(píng)價(jià)江香薷飲片，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣檢測(cè)，得到 13 批待評(píng)價(jià)江香薷飲片質(zhì)量表征信息，同時(shí)實(shí)測(cè)江香薷飲片S5(基準(zhǔn))有效基準(zhǔn)特征圖譜，以及實(shí)測(cè)13批待評(píng)價(jià)江香薷飲片特征指標(biāo)性成分含量，以驗(yàn)證基于質(zhì)量標(biāo)尺進(jìn)行江香薷質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，如圖3、4、5、6及表6所示。

如圖3、4所示，13批江香薷飲片特征圖譜皆含有與有效飲片(S5)基準(zhǔn)15個(gè)相同的特征峰，且15個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間與基準(zhǔn)標(biāo)尺基本一致，同時(shí)也與實(shí)測(cè)值相吻合，表明13批飲片皆為江香薷飲片，且驗(yàn)證了應(yīng)用基準(zhǔn)標(biāo)尺辨別江香薷飲片真?zhèn)蔚臏?zhǔn)確性。結(jié)果表明：江香薷質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)尺中質(zhì)的標(biāo)尺具有可行性，可依據(jù)其判斷江香薷飲片的真?zhèn)渭皩?duì)江香薷特征圖譜中各特征峰進(jìn)行指認(rèn)。

由圖5、6可見(jiàn)13批江香薷飲片質(zhì)量表征信息，可依據(jù)其特征峰相對(duì)峰面積及相對(duì)含量高于其基準(zhǔn)標(biāo)尺對(duì)應(yīng)點(diǎn)的數(shù)目、幅度和所涵蓋的3種主要化學(xué)類(lèi)型及其黃芩素-7-甲醚同類(lèi)成分，可對(duì)江香薷飲片的質(zhì)量?jī)?yōu)劣進(jìn)行評(píng)價(jià)；在所研究的14批江香薷飲片中，綜合考量評(píng)價(jià)得出編號(hào)S13飲片質(zhì)量較優(yōu)，其次是編號(hào)S3、S8、S2、S1、S10、S12飲片。

由表6可見(jiàn)，換算含量與實(shí)測(cè)含量基本一致，即驗(yàn)證了代表性成分換算含量結(jié)果的準(zhǔn)確性及其相對(duì)含量結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明：江香薷質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)尺中量的標(biāo)尺具有可行性，可依據(jù)其判斷江香薷飲片的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

注：1-4、6-9: 酚酸類(lèi); 5: 咖啡酸; 9: 異迷迭香酸苷; 10: 野黃芩苷;11: 黃酮類(lèi) 12: 迷迭香酸; 13: 黃芩素-7-甲醚; 14: 香荊芥酚;15: 麝香草酚

圖4 13批江香薷飲片與基準(zhǔn)(S5)相對(duì)保留時(shí)間

圖5 13批江香薷飲片與基準(zhǔn)(S5)相對(duì)峰面積

圖6 13批江香薷飲片與基準(zhǔn)(S5)相對(duì)含量

表6 14批江香薷飲片中7個(gè)特征指標(biāo)性成分含量考察結(jié)果 (%，n=2)

3 討論

本文報(bào)道研究建立的江香薷有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征模式、方法，所關(guān)注的江香薷飲片中15個(gè)特征峰涵蓋了其藥學(xué)架構(gòu)組成的酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)三種主要化學(xué)類(lèi)型，其中酚酸類(lèi)成分中咖啡酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸及黃酮類(lèi)成分中野黃芩苷具有抗血小板聚集、抗血栓作用[29-31]，黃芩素-7-甲醚及2個(gè)揮發(fā)油中萜類(lèi)成分香荊芥酚、麝香草酚有擴(kuò)張血管、降低血液稠度、促進(jìn)血液循環(huán)等作用[1,28,32]，從而整體的反映了江香薷飲片發(fā)揮活血藥效的有效物質(zhì)基礎(chǔ)；基于此，對(duì)14批江香薷飲片進(jìn)行了質(zhì)量?jī)?yōu)良度評(píng)價(jià)，得出編號(hào)S13飲片質(zhì)量較優(yōu)，其次是編號(hào)S3、S8、S2、S1、S10、S12飲片。建立的江香薷有效基準(zhǔn)特征圖譜質(zhì)量表征模式、方法，可簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確、整體地對(duì)江香薷飲片進(jìn)行質(zhì)量表征，并可應(yīng)用于精準(zhǔn)、有效的評(píng)價(jià)江香薷飲片質(zhì)量，構(gòu)建的江香薷質(zhì)量評(píng)價(jià)模式關(guān)注了飲片質(zhì)量的精確性與應(yīng)用有效性，從而為江香薷飲片的精準(zhǔn)質(zhì)量評(píng)價(jià)與篩選提供了科學(xué)依據(jù)，亦為其他中藥質(zhì)量表征與評(píng)價(jià)提供借鑒。

本研究收集了除江香薷飲片S5(飲片基準(zhǔn))外的13批江香薷飲片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同產(chǎn)地的飲片質(zhì)量差異性不顯著，由于實(shí)驗(yàn)采集樣品數(shù)量只有14批，且只收集了三個(gè)產(chǎn)地的江香薷飲片，不能得出有效的統(tǒng)計(jì)結(jié)論。但在江香薷飲片質(zhì)量不一的現(xiàn)狀下，可關(guān)注多種特征成分的類(lèi)型、含量、峰面積及江香薷有效質(zhì)量基準(zhǔn)標(biāo)尺，以全面客觀評(píng)價(jià)江香薷飲片的質(zhì)量，從而完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。